Estudo das condições de reação das enzimas amilase e peroxidase

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS - EQA
CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS 
Estudo das condições de reação das enzimas amilase e peroxidase
Disciplina: Bioquímica de Alimentos
Rio Grande
2017
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO	3
2DESENVOLVIMENTO	4
2.1 MATERIAL E MÉTODOS	4
2.1.1 MATERIAL	4
2.1.2 MÉTODOS	4
2.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO	6
3 CONCLUSÃO	9
REFERÊNCIAS	10
1 INTRODUÇÃO
As enzimas são uma subclasse das proteínas (com estruturas terciárias ou quaternárias) que atuam como biocatalisadores reacionais, diminuindo assim a energia de ativação e facilitando a ocorrência das reações bioquímicas existentes. Elas possuem as chamadas atividade enzimática e atividade específica. A primeira lida com a ação das enzimas sob o substrato e como isso influencia no produto final, pois cada uma delas possui especificidade, ou seja, somente um determinado substrato pode reagir com as mesmas (de maneira resumida, ela mede se há ou não enzimas atuando sob aquele meio); já a segunda mede a eficácia da ação daquela enzima sob o substrato. (VOET,D.; VOET, G.; PRATT, C., 2014); (NELSON, D.; COX, M., 2007).
Foram trabalhadas em aula as enzimas Peroxidase e Amilase. A primeira possui grande importância na área de alimentos devido à sua atuação principalmente em plantas e animais, tendo como função a proteção de tecidos contra o peróxido de hidrogênio (água oxigenada). Essa enzima atua de forma indireta na decomposição do peróxido, necessitando de um substrato extra para a aceleração da reação (no caso foi utilizado o Guaiacol), formando assim o Tetraguaiacoquinona que é responsável pela coloração escura do produto final. Já a segunda pode ser derivada de origem animal, vegetal ou microbiológica. Ela é capaz de hidrolisar o amido, liberando diversos produtos como dextrinas, maltose e glicose. O amido é composto pelos polissacarídeos amilose (15-20%) e amilopectina (80-85%), e a ação enzimática catalisa a hidrólise das ligações α-1,4 glicosídicas destes polissacarídeos. Sobre o amido, atuam liberando diversos produtos incluindo dextrinas e progressivamente polímeros ainda menores compostos de unidades de glicose (DAMODARAN, S.; PARKIN, K.; FENNEMA, O., 2010); (NEVES, V.; SOUZA, K., 2008).
Tendo como partida estas duas enzimas, foram estudadas suas cinéticas. O estudo da cinética enzimática leva em conta o mecanismo pelo qual a enzima transforma o substrato em produto, e com que velocidade isto ocorreu. As enzimas são catalisadores naturais, ou seja, diminuem as energias de ativação de uma reação, fazendo com que a mesma ocorra com maior rapidez (NELSON, D.; COX, M., 2007).
Portanto, os objetivos destas práticas foram avaliar as ações das enzimas amilolítica e peroxidase em termos de atividade enzimática (U/g de fruta), atividade específica da enzima (U/mg de proteína) e por fonte de enzima (U/g) obtida das batatas doce e inglesa.
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 MATERIAL E MÉTODOS
2.1.1 MATERIAL
2.1.1.1 Reagentes, solventes e amostra
	Foram utilizados os seguintes reagentes e solventes: solução salina 0,5%, solução padrão de amido solúvel (1mg/mL), solução de guaiacol 1%, solução de peróxido de hidrogênio 0,08%, tampão fosfato 5 mM pH 6,5, ácido acético 0,2 mol/L, hidróxido de sódio 1 M, 3,5-DNS, água destilada, reagente de Biureto (dissolver 3 g de sulfato de cobre e 9 g de tartarato de sódio e potássio em 500 mL de solução de hidróxido de sódio 0,2 M) e amostras de batata doce e batata inglesa.
2.1.1.2 Equipamentos e instrumentação
	Banho-maria com agitação (Quimis), balança analítica (Marte Ay220), espectrofotômetro (Quimis Visível Digital), blender (Vios), banho ultrassônico, tubos de ensaio, Erlenmeyer, béquer, funil, algodão, provetas, faca, pipetas de 1, 2, 5 e 10 mL e bastão de vidro.
2.1.2 MÉTODOS
2.1.2.1 Obtenção do extrato enzimático
	Para a extração enzimática, foram adicionados 50 mL de solução salina 0,5% em 10 g de amostra, após o extrato deve ser submetido a agitação em blender por 3 minutos. No filtrado desse extrato, foi quantificado proteína pelo método do Biureto e a medida da atividade da enzima amilolítica.
2.1.2.2 Medida da atividade da proteína solúvel
Para quantificação de proteína solúvel no extrato enzimático em ambos estudos das enzimas foi adicionado em um tubo de ensaio 1 mL de extrato enzimático, 1 mL de água destilada, 0,5 mL de solução de NaOH 1 M, 3 mL de reagente de Biureto, incubado em banho-maria a 37°C durante 10 min. A medida da absorvância foi realizada em espectrofotômetro a 540 nm.
2.1.2.3 Medida da atividade da enzima amilolítica
A atividade da enzima amilolítica obtida da batata baseou-se na ação da enzima presente em 0,5 mL de extrato enzimático, volume de água e substrato amido e posterior incubação em banho – maria conforme Quadro 1 para ocorrer a reação enzimática.
Quadro 1. Estudo da concentração de guaiacol na reação enzimática para peroxidase.
	Experimento
	Extrato (mL)
	Água destilada (mL)
	Amido (mL)
	Banho (40 °C)
	1
	0,5
	3,0
	0
	15 min
	2
	0,5
	2,5
	0,5
	15 min
	3
	0,5
	2,0
	1,0
	15 min
	4
	0,5
	1,5
	1,5
	15 min
	5
	0,5
	1,0
	2,0
	15 min
	6
	0,5
	0,5
	2,5
	15 min
	7
	0,5
	0,0
	3,0
	15 min
	Br
	0,5
	0,5
	2,5
	15 min
Após permanecer 15 minutos em banho-maria na temperatura de 40 °C, foi adicionado aos tubos 1 mL de DNS e levado novamente a banho-maria a 100 °C por 5 minutos, a reação foi interrompida com banho de gelo e adicionados 5,5 mL de água destilada para completar o volume de 10 mL. A absorvância dos compostos foi determinada em espectrofotômetro a 470 nm.
2.1.2.3 Medida da atividade da enzima peroxidase
A atividade da PO baseia-se na ação da enzima presente em 1 mL de extrato enzimático, foram adicionados 1,5 mL de tampão fosfato 5 mM no pH 6,5 e o volume do substrato guaiacol e de água nas concentrações segundo o Quadro 2 e 1 mL de peróxido de hidrogênio a 0,08%. A mistura foi incubada durante o tempo de 5 minutos na temperatura de 8°C. A absorbância dos compostos foi determinada em espectrofotômetro a 470 nm.
Quadro 2. Estudo da concentração de guaiacol na reação enzimática para peroxidase.
	Experimento
	Extrato (mL)
	Água destilada (mL)
	Guaiacol (mL)
	1
	1
	2,5
	0
	2
	1
	2,3
	0,2
	3
	1
	2,0
	0,5
	4
	1
	1,7
	0,8
	5
	1
	1,5
	1,0
	6
	1
	1,3
	1,2
	7
	1
	1,0
	1,5
2.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os cálculos foram realizados como será indicado a seguir e os resultados estão apresentados nas tabelas posteriormente. Todas as transmitâncias obtidas foram passadas para absorbância pela fórmula: 2-log (T) = Abs
Os cálculos para proteínas solúveis tanto para a enzima amilase quando para a enzima peroxidase foram realizados de acordo com a curva já encontrada em práticas anteriores (y=0,2785x), os resultados encontram-se nas tabelas 1 e 2 e foram efetuados como o exemplo indicado a seguir:
Foram realizados os seguintes cálculos para obter a proteína solúvel das amostras:
Exemplo: AbsAmostra = 0,39
Utilizando a curva padrão da albumina:
y = 0,2785x
0,39 = 0,2785x			x = 1,40 mg/mL
1,40 mg/mL*5,5 mL = 7,70 mg
Tabela 1. Resultados de proteína solúvel para a enzima amilase nas amostras de batata doce e inglesa.
	Batata doce
	T (%)
	Média Abs
	Abs corrigida
	Curva (mg/mL)
	Média (mg/mL)
	Média [] (mg)
	1
	26,9
	0,57
	0,52
	1,87
	1,93
	10,62
	2
	24,8
	0,61
	0,55
	1,99
	
	
	Br
	89
	0,05
	
	
	
	
	Batata inglesa
	T (%)
	Média Abs
	Abs corrigida
	Curva (mg/mL)
	Média (mg/mL)
	Média [] (mg)
	1
	59,8
	0,22
	0,18
	0,63
	0,59
	3,24
	2
	62,8
	0,20
	0,15
	0,55
	
	
	Br
	89,6
	0,05
	
	
	
	
Tabela 2. Resultados de proteína solúvel para a enzima peroxidase nas amostras de batata doce e inglesa.
	Batata doce
	T (%)
	Média Abs
	Abs corrigida
	Curva (mg/mL)
	Média (mg/mL)
	Média [] (mg)
	1
	40,4
	18,4*
	0,39
	0,34
	1,24
	1,12
	6,16
	2
	54,241,5
	0,32
	0,27
	0,99
	
	
	Br
	89
	89,4
	0,05
	
	
	
	
	Batata inglesa
	T (%)
	Média Abs
	Abs corrigida
	Curva (mg/mL)
	Média (mg/mL)
	Média [] (mg)
	1
	73
	0,14
	0,09
	0,33
	0,31
	1,71
	2
	74,9
	0,13
	0,08
	0,29
	
	
	Br
	90
	0,05
	
	
	
	
*Valor não utilizado por ser incerto.
Abaixo estão os cálculos para a atividade da enzima amilolítica:
Foram realizados os seguintes cálculos para a atividade da enzima amilolítica:
Exemplo: Amostra (ABS corrigida) = 0,0431
Utilizando a curva padrão da glicose:
y = 3,4505x
0,0431= 3,4505 x 		x = 0,0125 mg/mL
Para 10 mL:
0,0125 mg/mL 0,5 mL
x	 10 mL x = 0,25 mg
Diluição:
0,25 mg 1 mL
x 20 mL x = 5 mg
Utilizando-se a seguinte equação para finalizar os cálculos da atividade enzimática:
E a seguinte equação para calcular a atividade específica da enzima amilolítica:
A atividade específica é o número de unidades de enzima por miligrama de proteína e serve para medir a pureza da enzima (LEHNINGER, 1995).
Todos os resultados apresentados nas tabelas a seguir foram calculados de acordo com os cálculos realizados acima. 
Tabela 3. Resultados da atividade enzimática da amilase na amostra de batata doce.
	Teste
	[Amido]
	T (%)
	Abs corrigida
	U
	U/mg
	1
	0
	98
	
	0,008
	0,06
	0,38
	2
	0,5
	45,1
	
	0,34
	2,67
	16,66
	3
	1,0
	23,8
	
	0,62
	4,81
	30,07
	4
	1,5
	18,7
	
	0,73
	5,62
	35,13
	5
	2,0
	16,2
	
	0,79
	6,10
	38,14
	6
	2,5
	10
	
	1,00
	7,72
	48,26
	7
	3,0
	12,3
	
	0,91
	7,03
	43,92
	Br
	3,0
	99,8
	
	0,008
	
	
Tabela 4. Resultados da atividade enzimática da amilase na amostra de batata inglesa.
	Teste
	[Amido]
	T (%)
	Abs corrigida
	U
	U/mg
	1
	0
	75,3
	
	0,09
	0,11
	2,20
	2
	0,5
	89,3
	
	0,02
	0,02
	0,47
	3
	1,0
	84,2
	
	0,05
	0,05
	1,07
	4
	1,5
	82,5
	
	0,06
	0,06
	1,28
	5
	2,0
	75,9
	
	0,09
	0,11
	2,12
	6
	2,5
	73,75
	
	0,10
	0,12
	2,40
	7
	3,0
	68,7
	
	0,13
	0,16
	3,12
	Br
	3,0
	93,6
	
	
	
	
De acordo com a Tabela 3 e 4 onde as amostras foram batata doce e batata inglesa, respectivamente, pode-se observar que quanto maior a quantidade de amido na solução, maior foi a atividade enzimática e atividade específica. 
O aumento da concentração do substrato (amido) faz com que ocorra o aumento da velocidade de reação até atingir a velocidade máxima, onde ela se mantém constante. Nesse ponto todas as enzimas estão saturadas, o que significa que todo o sítio ativo da enzima tem um substrato ligado (Bianconi, 2006). 
Abaixo estão os cálculos para a atividade da enzima peroxidase:
Foram realizados os seguintes cálculos para a atividade da enzima peroxidase:
Exemplo: Amostra (ABS corrigida) = 0,0431
= U/mLUtilizando-se a seguinte equação para o cálculo da atividade:
Onde:
= Absortividade molecular = 26600M-1 cm-1
V= volume no tubo= 6ml
103= correção 
Fator de correção:para batata doce =35, para batata inglesa =25.
E a seguinte equação para calcular a atividade específica da enzima peroxidase:
Todos os resultados apresentados nas tabelas a seguir foram calculados de acordo com os cálculos realizados acima. 
Tabela 5. Resultados de atividade enzimática da PO nas amostras de batata doce.
	Teste
	[Guaiacol]
	T (%)
	Abs corrigida
	U
	U/mg
	1
	0
	99,8
	
	0,0009
	0,001
	0,001
	2
	0,2
	37,2
	
	0,43
	0,68
	0,61
	3
	0,5
	28,3
	
	0,55
	0,87
	0,78
	4
	0,8
	8,5
	
	1,07
	1,69
	1,52
	5
	1
	18,4
	
	0,74
	1,16
	1,05
	6
	1,2
	4,5
	
	1,35
	2,13
	1,92
	7
	1,5
	3,73
	
	1,43
	2,26
	2,03
	Br
	1,5
	100
	
	
	
	
Tabela 6. Resultados de atividade enzimática da PO nas amostras de batata inglesa.
	Teste
	[Guaiacol]
	T (%)
	Abs corrigida
	U
	U/mg
	1
	0
	99,2
	
	0,0035
	0,004
	0,01
	2
	0,2
	89,3
	
	0,05
	0,055
	0,18
	3
	0,5
	79,1
	
	0,10
	0,115
	0,37
	4
	0,8
	70,6
	
	0,15
	0,171
	0,55
	5
	1
	66,1
	
	0,18
	0,203
	0,65
	6
	1,2
	66
	
	0,18
	0,204
	0,66
	7
	1,5
	59,1
	
	0,23
	0,258
	0,83
	Br
	1,5
	100
	
	
	
	
Pode-se observar nas tabelas 5 e 6 que a atividade especifica e a atividade enzimática das amostras aumentaram de acordo com o aumento da concentração do guaiacol
Utiliza-se a seguinte equação para o cálculo de concentração do guaiacol:
	E o quadro apresentado a seguir é utilizado para obter os valores que irão construir a curva padrão de cinética enzimática, que pode ser calculada de acordo com os valores encontrados anteriormente.
Quadro 1. Cálculo da curva de cinética enzimática da amilase.
	Volume
	[S] (mg/mL)
	1/[S] (mg/ml)
	1/U B.Doce
	1/U B.Inglesa
	0
	0
	0
	-
	-
	0,5
	1,852
	0,540
	0,375
	28,846
	1
	3,703
	0,270
	0,208
	15,625
	1,5
	5,556
	0,180
	0,178
	13,393
	2
	7,407
	0,135
	0,164
	8,571
	2,5
	9,259
	0,108
	0,130
	7,653
	3
	11,111
	0,090
	0,142
	6,000
Gráfico 1.Curva de cinética enzimática da amilase para batata doce e inglesa.
De acordo com o gráfico 1, para a enzima amilolítica, a cinética da batata inglesa e a batata doce decaíram de acordo com o volume adicionado no tubo. Para a batata doce o decaimento foi pequeno, já para a bata inglesa houve um grande salto de um valor para o outro. 
Quadro 2. Cálculo da curva de cinética enzimática da peroxidase.
	Volume
	[S] (mg/mL)
	1/[S] (mg/ml)
	1/U B.Doce
	1/U B.Inglesa
	0
	0
	0
	-
	-
	0,2
	0,033
	30
	1,475
	18,041
	0,5
	0,083
	12
	 Descartado 
	8,708
	0,8
	0,133
	7,5
	0,592
	5,864
	1
	0,167
	6
	0,861
	4,931
	1,2
	0,200
	5
	0,470
	4,913
	1,5
	0,250
	4
	0,443
	3,882
Gráfico 2.Curva de cinética enzimática da peroxidase para batata doce e inglesa. 
De acordo com o gráfico 2, para a enzima peroxidase, a cinética da batata inglesa e a batata doce decaíram de acordo com o volume adicionado no tubo. Para a batata doce o segundo ponto foi descartado por erro de análise e os valores seguintes tiveram uma pequena oscilação. Já para a batata inglesa, houve um grande decaimento até o quarto ponto e depois houve pequenas oscilações, tornando-os quase constante. 
Para os cálculos de Km e Vmáx, temos:
	Para calcular o Km e Vmáx utilizou-se a equação de Michaelis-Menten, que permite linearizar a reta y = ax+b:
Onde:
1/Vo = y
Km/Vmax = a
1/s = x
1/Vmax = b
Tabela 6. Valores de Km e Vmáx da amilase.
	
	Km (mg)
	Vmáx Batata Doce (mg/min)
	Batata doce
	6,381
	11,905
	Batata inglesa
	19,97
	0,406
Tabela 7. Valores de Km e Vmáx da peroxidase.
	
	Km (mg)
	Vmáx Batata Doce (mg/min)
	Batata doce
	0,0138
	2,604
	Batata inglesa
	0,2810
	0,521
Vmax é o valor máximo da velocidade inicial quando todos os sítios ativos estão ocupados e Km é a constante de Michaelis que pode ser definida como o valor da concentração de substrato quando a atividade da enzima é metade de Vmax(WILSON; WALKER, 2010).
Quando uma mesma enzima atua sobre mais de um substrato, esta constante permite identificar o substrato “natural” (principal) que será o de menor Km sendo este inversamente proporcional com a afinidade da enzima pelo substrato. Existe uma dependência entre Km e Vmax (NEILANDS; STUMPF, 1955).
Observamos de acordo com as tabelas 6 e 7, que tanto na enzima amilase quanto na enzima peroxidase, o Km da batata inglesa foi maior que o da batata doce, e o Vmáx foi ao contrário, onde o da batata doce foi maior que o da batata inglesa, o que já era esperado.
3 CONCLUSÃO
De acordo com os resultados encontrados, a amostra que possui maior especificidade com os dois substratos e melhor eficiência catalítica é a batata doce, com Km de 6,381 mg e Vmáx de 11,905 mg/min. Essa amostra também apresentou maiores atividades enzimáticas e maiorvalor proteico.
REFERÊNCIAS
Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Araquara: Departamento de Alimentos e Nutrição. Extração e caracterização de enzimas. Disponível em: <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/enzimas.htm> Acesso em 16 jun. 2017.
DAMODARAN, S.; PARKIN, K. L.; FENNEMA, O. R. Química de Alimentos de Fennema, 4 ed., Porto Alegre: Artmed, 2010.
NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 4. Ed. São Paulo: Editora Sarvier, 2007.
VOET, D., VOET, J.G., PRATT, C.W. Fundamentos de Bioquímica. 4. Ed. São Paulo: Editora Artmed, 2014.
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica. São Paulo: Sarvier, 1995. 190p
BIANCONI, M. L.; Efeito da Concentração de Substrato na Atividade Enzimática. Disponível em: <http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/concn_subst.htm>.Acesso em 09 out. 2016.
NEILANDS, B. J.; STUMPF, K. P. Outlines of Enzyme Chemistry. New York, 1995
WILSON, K.; WALKER, J. M. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. 7. ed. New York: Cambridge University Press, 2010.