Unidade IX Eletroforese

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UNIDADE IX 
 
 ELETROFORESE 
1 
Prof. Me. Augusto César R. Araújo 
UNIDADE IX 
 
 Eletroforese 
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 PRINCÍPIOS DA TÉCNICA 
 FATORES QUE INFLUENCIAM A ELETROFORESE 
 TIPOS DE ELETROFORESE 
 APLICAÇÕES DA ELETROFORESE 
 
PRINCÍPIOS DA TÉCNICA 
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Princípios da Técnica 
• Um dos métodos mais utilizados em laboratório de 
bioquímica e biologia molecular; 
 
• Consiste em uma técnica de separação de componentes de um 
sistema através da aplicação de CAMPO ELÉTRICO; 
 
• Migração e separação de moléculas ionizadas ao se aplicar um 
diferença de potencial elétrico segue a lei de Coulomb. 
 
• Separação se processa em função da CARGA e do PESO 
MOLECULAR. 
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Princípios da Técnica 
 
• Componente negativos migram para lado positivo; 
 
• Componente positivos migram para o lado negativo; 
 
• Partículas de cargas diferentes – Análise Qualitativa; 
 
• Partículas de mesma carga – Análise Quantitativa; 
 
• Proteínas – Anfóteras ( requerendo utilização de 
sistema tampão); 
 
 
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Princípios da Técnica 
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Princípios da Técnica 
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Princípios da Técnica 
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FATORES QUE INFLUENCIAM 
A ELETROFORESE 
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Fatores que influenciam a eletroforese 
• Todos os fatores irão influenciar na velocidade de 
arraste, ou seja, na MOBILIDADE das partículas: 
 
pH do meio; 
pI ou pK das substâncias; 
Eletrólitos utilizados; 
Interações com fase fixa; 
Temperatura; 
 
 
 
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TIPOS DE 
ELETROFORESE 
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Tipos de Eletroforese 
1. Eletroforese em Placa de Gel ( Papel Filtro – Celulose – 
Agarose – Poliacrilamida); 
2. Eletroforese em Disco; 
3. Eletroforese por Focalização Isoelétrica; 
4. Eletroforese Bidimensional; 
5. Técnicas de Blotting ( Southern – Northern – Western); 
6. Eletroforese Capilar; 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Eletroforese em Placa de Gel 
 
De acordo com tipo de suporte 
 
Papel filtro; 
Acetato de celulose; 
 
Gel de Agarose; 
Gel de Poliacrilamida. 
 
 
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SÓLIDO 
SEMI-SÓLIDO 
Tipos de Eletroforese 
Papel Filtro 
 
Umas das primeiras técnicas utilizadas; 
 
Eficiente para separação de partículas com grande 
diferença de cargas; 
 
Separação de proteínas (composição de diferentes 
aminoácidos); 
 
 Entrou em desuso pela baixa reprodutibilidade. 
 
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Tipos de Eletroforese 
Papel Filtro 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
Acetato de Celulose 
 
Método mais prático e econômico; 
 
Tem a vantagem de ser quimicamente mais homogêneo e 
tornar-se transparente; 
 
Permite excelente grau de separação e quantificação de 
frações proteicas; 
 
Fácil manipulação e rapidez na análise. 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Gel de Agarose 
 
Polissacarídeo extraído de algas marinhas; 
 
Polimerização mais rápida e o gel pode ser reciclado; 
 
Evita que suporte fique mole para ser utilizado; 
 
Utilizado para proteínas de alto peso molecular; 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Gel de Agarose 
 
Eletroendosmose 
 
Interferência no campo elétrico pelas cargas negativas no 
Agar que é o componente do gel de agarose; 
 
Gera dificuldade no processo de separação das frações de 
proteínas; 
 
Para se reduzir este efeito deve-se utilizar agarose hiper-
purificada. 
 
 
 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
Gel de Poliacrilamida (PAGE) 
 
Surgiu a partir de uma polimerização vinílica da 
acrilamida e bisacrilamida; 
 
Características melhoradas de densidade, elasticidade, 
transparência e tamanho dos poros; 
 
Mais utilizado em pesquisa por conta do custo (melhor 
resolução). 
 
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Tipos de Eletroforese 
Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) 
 
SDS – Dodecil sulfato de sódio 
 
Desnaturação das proteínas - Romper as interações 
não covalentes entre as subunidades de proteína. 
 
Mede com precisão a massa de uma subunidade 
proteica ao invés da proteína intacta. 
 
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Tipos de Eletroforese 
Revelação Eletroforese em gel 
 
Azul brilhante de Comassie; 
 
Coloração com Prata; 
 
Fluorescamina. 
 
Brometo de Etídio 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Eletroforese em Disco 
 
Eletroforese com pH descontínuo; 
 
Utiliza 2 géis ( Gel de corrida e o gel de empilhamento) 
e vários tampões; 
 
Movimentam da extremidade superior para inferior . 
 
pH descontínuo porque os íons ao migrarem para gel 
de empilhamento encontram um pH diferente do pK, 
adotando forma neutra e portanto imóveis; 
 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Eletroforese em Disco 
 
• Ocorre uma migração dos íons macromoleculares até 
encontrarem região contendo os íons do tampão do gel 
de empilhamento, com isso uma diminuição da 
velocidade. 
 
• É chamada em disco porque os íons macromoleculares 
ao chegarem no gel de corrida empilhados formam 
bandas ou disco estreitos que são ordenados de acordo 
com a mobilidade. 
 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Eletroforese em Disco 
 
 
 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Eletroforese por Focalização Isoelétrica (IEF) 
 
• Separação de compostos anfóteros (grupos funcionais 
positivos e negativos na molécula); 
 
• Ponto Isoelétrico – Valor de pH com carga elétrica nula; 
 
• Migração irá ocorrer para uma zona onde o pH = pI da 
proteina; 
 
• Nesse ponto a carga da proteína zera e a migração cessa. 
 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Eletroforese por Focalização Isoelétrica 
 
 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Eletroforese Bidimensional 
 
Estudar famílias de proteínas e pesquisar diferenças 
genéticas ou de doenças ; 
 
Estudar conteúdo proteico das células; 
 
Usa a técnica IEF dependente de carga na 1ª dimensão; 
 
Usa a eletroforese dependente de peso molecular na 
segunda dimensão; 
 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Técnicas Blotting - Southern Blotting 
 
Edward Southern – 1975; 
 
Amplamente utilizada em Biologia Molecular; 
 
Blotting - Transferência 
 
Identifica sequência específica de DNA - Determinar a 
presença, a posição e o número de cópias de um gene 
em um genoma; 
 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Técnicas Blotting - Northern Blotting 
 
Analogia a técnica anterior; 
 
Separar e detectar RNAm; 
 
• Técnicas Blotting - Western Blotting 
 
Separar, detectar e identificar uma ou mais proteínas 
em uma mistura complexa; 
 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Técnicas Blotting - Western Blotting 
 
Também chamada de protein blotting ou 
immunoblotting; 
 
Imunodetecção de proteínas após a separação destas 
por eletroforese em gel e transferência para uma 
membrana adsorvente; 
 
Detectar, Caracterizar e quantificar as múltiplas 
proteínas. 
 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Técnicas Blotting - Western Blotting (Vantagens) 
 
Membrana úmidas não maleáveis 
Fácil manuseio; 
Proteínas imobilizadas são rapidamente e 
uniformemente acessíveis a diferentes ligantes; 
Pequena quantidade de reagente é necessário para 
análise de transferência; 
A mesma proteína isolada pode ser usada em múltiplas 
analises. 
 
 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Eletroforese Capilar 
 
Técnica mais recente a ser utilizada; 
 
É uma modificação de uma técnica clássica utilizando 
um tubo capilar de sílica fundida de diâmetro interno 
pequeno. 
 
Tubocapilar irá atuar como câmara eletroforética 
capilar; 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Eletroforese Capilar - Vantagens 
 
Permite maior dissipação de calor ao aplicar altas 
voltagens; 
 
Permite excelente grau de separação e quantificação de 
frações proteicas; 
 
Reduz o tempo de separação ( em torno de 1 minuto). 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Eletroforese Capilar 
 
 
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Tipos de Eletroforese 
• Eletroforese Capilar 
 
 
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APLICAÇÕES DA 
ELETROFORESE 
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Aplicações da eletroforese 
Análise de enzimas, proteínas e ácidos nucléicos; 
 
Estudos de taxonomia (classificação biológica); 
 
Bioquímica, fisiologia e genética humana, de plantas, 
animais e microorganismos; 
 
Caracterização de fitopatógenos; 
 
Amplificação de DNA (PCR). 
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Aplicações da eletroforese 
• Hemoglobina 
 
Hemoglobina –Proteína de estrutura quaternária presente nas 
Hemácias composta de 4 cadeias de globulinas e um grupo 
heme; 
 
Hemoglobina A – 95% hemoglobina em adultos (2α e 2β); 
 
Hemoglobina A2 – 3% hemoglobina em adultos (2α e 2δ); 
 
Hemoglobina F – 2% hemoglobina em adultos(2α e 2γ) 
produzida durante a gestação; 
 
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Aplicações da eletroforese 
• Hemoglobina 
 
 
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Aplicações da eletroforese 
• Hemoglobinopatias 
 
Grupo heterogêneo de doenças causadas por uma 
interrupção do padrão normal de expressão dos genes; 
 
Variantes estruturais em que a mudança na estrutura da 
Hb se dá pela substituição de um aminoácido em uma de 
suas cadeias polipeptídicas; 
 
Por deficiência de síntese ou talessemias em que ocorre 
um desequilibrio na produção de uma ou mais cadeias de 
globulinas. 
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Aplicações da eletroforese 
• Hemoglobinopatias - Anemia Falciforme (HbS) 
 
 
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Aplicações da eletroforese 
• Hemoglobinopatias - Talessemia beta menor 
 
 
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Aplicações da eletroforese 
Hemoglobinopatias - Talessemia beta maior 
 
 
 
 
 
 
 
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Aplicações da eletroforese 
• Inflamação Aguda 
 
 
 
 
 
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Aplicações da eletroforese 
• Hepatites Virais 
 
 
 
 
 
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Aplicações da eletroforese 
• Mieloma múltiplo 
 
 
 
 
 
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EXERCÍCIOS 
DE 
FIXAÇÃO 
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EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
1) Sobre o processo de eletroforese assinale a alternativa 
incorreta: 
 
a) Técnica se processa sob aplicação de campo magnético. 
b) Separação ocorre em função da carga e do peso 
molecular. 
c) Ao se analisar partículas de mesma carga estamos 
efetuando uma análise qualitativa. 
d) Proteinas somente apresentam carga negativa e não 
requerem solução tampão. 
 
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EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
2) Diversos fatores podem influenciam na mobilidade das 
partículas, exceto: 
 
a) pH do meio 
b) pK da substância 
c) Pressão 
d) Temperatura 
e) Interações com fase fixa 
 
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EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
3) De acordo com o conceito a seguir identifique qual o 
tipo de eletroforese: Durante processo de eletroforese de 
proteinas pode desenvolver eletroendosmose 
 
a) Eletroforese em gel de poliacrilamida 
b) Eletroforese bidimensional 
c) Eletroforese em papel filtro 
d) Eletroforese em gel de agarose 
e) Eletroforese capilar 
 
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EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
4) De acordo com o conceito a seguir identifique qual o 
tipo de eletroforese: Migração irá ocorrer para uma zona 
onde o pH = pI da proteina. 
 
a) Eletroforese em gel de poliacrilamida 
b) Eletroforese bidimensional 
c) Eletroforese em papel filtro 
d) Eletroforese em gel de agarose 
e) Eletroforese por Focalização Isoeletrica 
 
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EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
5) Existe um família de eletroforese chamada de técnicas 
blotting. Assinale a alternativa correta 
 
a) Southern Blotting identifica sequência de RNAm 
b) Northern Blotting identifica sequência de DNA 
c) Northern Blotting identifica sequência de RNAm 
d) Southern Blotting identifica sequência de proteínas 
e) Western Blotting identifica sequência de DNA 
 
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