Como comprovar a segurança de um novo medicamento?

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Como	
  comprovar	
  a	
  
segurança	
  de	
  um	
  novo	
  
medicamento?
Talita	
  Magalhães	
  Rocha
Mestre	
  em	
  Farmacologia
Julho	
  -­‐ 2017
UNIVERSIDADE	
  FEDERAL	
  DO	
  CEARÁ
DEPARTAMENTO	
  DE	
  FARMÁCIA
DISCIPLINA:	
  FARMACOGNOSIA	
  I
RDC	
  nº	
  26,	
  de	
  13	
  de	
  maio	
  de	
  2014
Ensaios	
  não	
  clínicos	
  e	
  clínicos	
  de	
  segurança	
  e	
  eficácia
Registro	
  simplificado
Lista	
  de	
  medicamentos	
  fitoterápicos	
  de	
  
registro	
  simplificado	
  -­‐ IN	
  n° 2/2014
Presença	
  nas	
  monografias	
  de	
  
fitoterápicos	
  de	
  uso	
  bem	
  
estabelecido	
  elaboradas	
  pelo	
  
Comitê	
  de	
  Produtos	
  Medicinais	
  
Fitoterápicos	
  da	
  European
Medicines	
  Agency (EMA)
Relatório	
  de	
  segurança	
  e	
  eficácia
Avaliação	
  da	
  toxicidade
• Objetivo
Predizer possíveis efeitos tóxicos, que podem se manifestar
quando da exposição humana à determinados produtos, como
medicamentos e outros.
• Modelos animais
-­‐ Educacional
-­‐ Desenvolvimento novos medicamentos e
outros produtos
Stokes,	
  2002;	
  Meyer,	
  2003;	
  HSU,	
  2003
Aspectos	
  históricos	
  de	
  pesquisa	
  
envolvendo	
  animais
• Hipócrates (450 a.C.) -­‐ Órgãos
humanos x animais;
• Galeno (129 -­‐ 210 d.C.) -­‐ Medicina
Científica;
• René Descartes (1596 -­‐ 1650) -­‐
Animais não sentiam dor;
• Jeremy Benthan (1789) -­‐ base para
proteção animal
Aspectos	
  históricos	
  de	
  pesquisa	
  
envolvendo	
  animais
• Claude Bernard (século XIX) -­‐ Postura
indiferente ao sofrimento dos animais
de laboratório;
• Século XIX -­‐ Sociedades Protetoras dos
Animais;
• Associação Médica Americana (1909) -­‐ Ética na
experimentação animal;
• UNESCO (1978) -­‐ Declaração Universal dos Direitos
dos Animais.
Animais	
  de	
  laboratório
• Fácil	
  manutenção,	
  manejo	
  e	
  observação
• Padronização	
  do	
  ambiente
• Pequeno	
  porte
• Docilidade
• Grande	
  amostragem
• Ciclo	
  reprodutivo	
  curto
• Fisiologia	
  conhecida
• Baixo	
  consumo	
  alimentar	
  
Animais	
  De	
  Laboratórios
Espécies	
  Utilizadas
Ø Cães
Ø Gatos
Ø Primatas
Ø Aves
Ø Ratos
Ø Camundongos
Ø Cobaias
Ø Insetos
Espécies	
  convencionais
Ø Ratos	
  (Rattus norvegicus)
Ø Camundongos	
  (Mus	
  musculus)	
  
Ø Hamster (Mesocrisetus auratus)
Ø Cobaias	
  (Cavia porcellus)
Ø Coelhos	
  (Oryctolagus cuniculus)
Geneticamente	
  modificados
Ø KO-­‐LDL.	
  Adquirido	
  em	
  2005	
  – USP,	
  Brasil
Ø Rato	
  NIH	
  (NUDE):	
  imunodeficiente,	
  
espontâneo
Animais	
  de	
  laboratórios
Ferreira	
  et	
  al,	
  2005
Nude mouse
Estudos de neoplasias e 
cicatrizes normais e patológicas
Utilização	
  de	
  animais	
  na	
  pesquisa:	
  
aspectos	
  éticos
ü Uso	
  disseminado	
  de	
  animais	
  na	
  pesquisa
ü Reavaliação	
  do	
  uso	
  de	
  animais
ü Desenvolver	
  e	
  Validar	
  novos	
  métodos
ü Implementação	
  regulatória	
  de	
  testes	
  alternativos
White,	
  2001;	
  Schechtman,	
  2002;	
  Russel	
  &	
  Burch,	
  1992
Regulamentação
Lei	
  Arouca	
  
nº	
  11.794	
  de	
  8	
  de	
  outubro	
  de	
  2008	
  
Regulamentação	
  do	
  Uso	
  de	
  Animais	
  para	
  fins	
  
didáticos	
  e	
  científicos
-­‐ Uso	
  dos	
  animais	
  para	
  atividades	
  didáticas	
  e	
  científicas	
  em	
  
Instituições	
  de	
  ensino	
  superior	
  e	
  ensino	
  técnico	
  na	
  área	
  biomédica	
  
-­‐ Criação	
  do	
  CONCEA	
  
-­‐ Obrigatoriedade	
  de	
  constituição	
  de	
  uma	
  CEUA
The	
  Principles Of Humane	
  
Experimental	
  Technique – 3Rs
Diminuir o	
  número	
  de	
  animais	
  utilizados	
  na	
  
pesquisa,	
  minimizar a	
  dor	
  e	
  o	
  desconforto	
  e	
  buscar	
  
alternativas	
  para	
  a	
  substituição de	
  testes	
  
Rex L.  Burch &  William  M.S.  Russell  (1959)
O	
  princípio	
  dos	
  3	
  Rs
• Replace -­‐ substituição
• Reduce -­‐ redução
• Refine -­‐ refinamento
Normas	
  para	
  avaliações	
  
toxicológicas	
  de	
  medicamentos
• Organização intergovernamental
• América do Norte, Europa e Ásia
• Guia de avaliação da segurança de produtos
químicos “Guidelines for testing of chemicals”
(OECD, 1996).
• Segurança de novos alimentos, etc
• Organizações participantes: FDA, WHO etc
OECD	
  guideline for	
  testing of
chemicals
• Acute oral	
  toxicity -­‐ guideline 401,	
  1981	
  
• Alternative methods
-­‐ Fixed dose	
  method -­‐ OECD	
  420,	
  1992
-­‐ Acute toxic class method – OECD	
  423,	
  1996
-­‐ Up-­‐and-­‐down procedure	
  – OECD	
  425,	
  1998
Criticado	
  frente	
  ao	
  programa	
  3Rs
Meta	
  3Rs:
Reduzir	
  o	
  nº	
  de	
  animais
Sofrimento	
  	
  dos	
  animais
E	
  no	
  Brasil...
Guia	
  para	
  a	
  realização	
  de	
  estudos	
  de	
  
toxicidade	
  pré-­‐clínica	
  de	
  fitoterápicos
1. Indica métodos padronizados para os estudos de toxicologia
pré-­‐clínica de acordo com Resolução vigente para registro e
renovação de registro de fitoterápicos.
2. Os estudos de toxicidade devem ser conduzidos com
amostras padronizadas do medicamento fitoterápico ou do
derivado vegetal a partir do qual é produzido.
31	
  de	
  janeiro	
  de	
  2013	
  -­‐ Versão	
  2
Fundamento
• Baseado	
  em	
  documentos	
  de	
  agências	
  e	
  instituições	
  
reconhecidas	
  na	
  área
FDA:	
  Food and Drug Administration
EMA:	
  European	
  Medicines	
  Agency
OECD:	
  Organization	
  for	
  Economic	
  Co-­‐operation	
  and	
  Development
ICH:	
  International	
  Conference	
  on	
  Harmonization	
  
NCI	
  :	
  National Cancer Institute
WHO:	
  World	
  Health	
  Organization
Objetivo
• Possibilitar uma maior harmonização com a
regulamentação internacional;
• Racionalizar estudos não clínicos, evitando
duplicidades e utilização desnecessária de animais
sem que isso comprometa a obtenção e
confiabilidade de informações referentes à
segurança da droga a ser testada;
• Fornecer dados confiáveis para subsidiar as
Pesquisas Clínicas.
Condução
• De acordo com as Boas Práticas de Laboratório
(BPL) -­‐ OECD Principles of Good Laboratory Practice
• HANDBOOK: GOOD LABORATORY PRACTICE (GLP) /
WHO (Quality practices for regulated non-­‐clinical
research and development), quando aplicável;
• Os animais a serem utilizados deverão ser
saudáveis, preferencialmente livres de patógenos
(SPF – Specific Pathogen Free), e de origem
conhecida, além de possuir peso e idade
adequados ao experimento.
Desenvolvimento	
  de	
  
medicamentos
Adaptado	
  de	
  BERKOWITZ	
  (2006)
Biodisponibilidade
Eficácia
Efeitos	
  
tóxicos
Avaliação	
  da	
  segurança	
  não	
  
clínica
Estudos	
  não	
  clínicos	
  de	
  segurança
1. Estudos de toxicidade de dose única (aguda)
2. Estudos de toxicidade de doses repetidas
3. Estudos de toxicidade reprodutiva
4. Estudos de genotoxicidade
5. Estudos de tolerância local
6. Estudos de carcinogenicidade
7. Estudos de interesse para a avaliação da segurança
farmacológica
8. Estudos de toxicocinética
9. Ensaios não clínicos necessários para condução de
estudos clínicos com associações em dose fixa
Guia	
  para	
  a	
  realização	
  de	
  estudos	
  de	
  
toxicidade	
  pré-­‐clínica	
  de	
  fitoterápicos	
  
Amostras	
  padronizadas	
  do	
  fitoterápico	
  ou	
  do	
  derivado	
  vegetal
Amostra
Toxicidade	
  aguda
Toxicidade	
  dedoses	
  repetidas
Toxicidade	
  crônicaToxicidade	
  subcrônica
Irritação	
  ocular
Irritação	
  cutânea
Sensibilização	
  dérmica
Estudo	
  especial	
  -­‐
genotoxicidade Avaliação	
  toxicológica	
  tópica
Testes	
  adicionais
Quando	
  houver
indicação	
  de	
  uso	
  contínuo	
  ou
prolongado	
  do	
  medicamento
em	
  humanos
Guia	
  para	
  a	
  realização	
  de	
  estudos	
  de	
  
toxicidade	
  pré-­‐clínica	
  de	
  fitoterápicos
1.	
  Estudos	
  de	
  Toxicidade	
  de	
  Dose	
  
Única	
  (Aguda)
OBJETIVO:
Avaliar	
  a	
  toxicidade	
  em	
  1	
  ou	
  mais	
  doses	
  até	
  24	
  horas	
  -­‐
observação	
  dos	
  animais	
  por	
  14	
  dias	
  após	
  a	
  administração.
MODELO	
  ANIMAL:	
  
no	
  mínimo	
  2	
  espécies	
  de	
  mamíferos:	
  um	
  roedor	
  e	
  um	
  não	
  
roedor	
  (machos	
  e	
  fêmeas)	
  adultos
VIAS	
  DE	
  ADMINISTRAÇÃO:	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
(1)	
  pretendida	
  para	
  administração	
  em	
  humanos	
  (oral	
  –
gavagem);	
  	
  
(2)	
  parenteral	
  (endovenosa)
RE	
  Nº	
  90	
  :	
  uma	
  espécie	
  de	
  mamífero	
  evitando-­‐se	
  animais	
  
com	
  características	
  genéticas	
  especiais.	
  No	
  mínimo	
  6	
  
machos	
  e	
  6	
  fêmeas	
  por dose.
1.	
  Estudos	
  de	
  Toxicidade	
  de	
  Dose	
  
Única	
  (Aguda)
Alteração	
  da	
  
locomoção
Frequência	
  
respiratória	
   Piloereção
Diarreia	
  
Alteração	
  do	
  
tônus	
  
muscular
Convulsões
Contorções	
  
abdominais	
  
2.	
  Estudos	
  de	
  Toxicidade	
  de	
  Doses	
  
Repetidas
OBJETIVO:	
  
Caracterizar o	
  perfil toxicológico da	
  droga	
  pela	
  administração	
  repetida	
  
sobre	
  diversos	
  parâmetros,	
  indicação	
  da	
  NOEL	
  e	
  NOAEL.
MODELO	
  ANIMAL:	
  
no	
  mínimo	
  2	
  espécies	
  de	
  mamíferos:	
  um	
  roedor	
  e	
  um	
  não	
  
roedor	
  (n° igual	
  de	
  machos	
  e	
  fêmeas	
  em	
  idade	
  adulta	
  
jovem)
VIA	
  DE	
  ADMINISTRAÇÃO:	
  
Pretendida	
  para	
  administração	
  em	
  humanos.	
  Pode-­‐se	
  usar	
  
uma	
  via	
  parenteral	
  quando	
  a	
  absorção	
  em	
  animais	
  for	
  baixa.
RE	
  Nº	
  90	
  :	
  
Roedores:	
  No	
  mínimo	
  10	
  machos	
  e	
  10	
  fêmeas,	
  por	
  dose	
  
Não-­‐roedores:	
  no	
  mínimo	
  3	
  machos	
  e	
  3	
  fêmeas,	
  por	
  dose
Incluir	
  um	
  grupo	
  veículo	
  da	
  formulação
no-­‐observed effect level
no-­‐observed-­‐adverse-­‐effect level
2.	
  Estudos	
  de	
  Toxicidade	
  de	
  Doses	
  
Repetidas
DOSE:	
  
3	
  doses:	
  a	
  maior	
  deve	
  produzir	
  efeitos	
  tóxicos	
  
observáveis,	
  mas	
  não	
  morte	
  nem	
  sofrimento,	
  no	
  máximo	
  
de	
  1000	
  mg/kg/dia,	
  seguidas	
  de	
  sequência	
  descendente	
  
com	
  	
  intervalos	
  de	
  2	
  a	
  4	
  vezes.
OBS:	
  Os	
  dados	
  de	
  segurança	
  obtidos	
  nesses	
  estudos	
  dão	
  
suporte	
  às	
  Fases	
  1,	
  2	
  e	
  3	
  da	
  Pesquisa	
  Clínica.
Período	
  de	
  uso	
   Duração	
  mínima	
  do	
  estudo	
  das	
  doses	
  repetidas	
  
Até	
  30	
  dias	
  de	
  uso	
  por	
  ano	
   4	
  semanas	
  
Acima	
  de	
  30	
  dias	
  de	
  uso	
  por	
  ano	
   12	
  semanas	
  
2.	
  Estudos	
  de	
  Toxicidade	
  de	
  Doses	
  
Repetidas
PARÂMETROS AVALIADOS Roedores Não	
  roedores
Sinais	
  clínicos	
  (incluindo parâmetros	
  
comportamentais)
x x
Mortalidade x x
Variações no	
  peso	
  corporal x x
Consumo	
  de	
  ração	
  e	
  água x x
Patologia	
  clínica	
  (hematologia,	
  
bioquímica)
x x
Duração	
  e	
  reversibilidade	
  da	
  toxicidade x x
Investigações anatomo e	
  histopatológicas x x
Oftalmologia x
RE	
  Nº	
  90	
  :	
  
• alterações	
  comportamentais,
• variação	
  do	
  peso	
  corpóreo	
  (semanal),	
  	
  
• hemograma	
  completo	
  e	
  análises	
  bioquímicas	
  de	
  
sangue	
  (sódio,	
  potássio,	
  gama	
  glutamiltranspeptidase,	
  
aminotransferases,	
  fosfatase	
  alcalina,	
  ureia,	
  creatinina,	
  
ácido	
  úrico,	
  colesterol,	
  triglicerídeos,	
  glicose,	
  proteínas	
  
totais	
  e	
  bilirrubina);
• Exames anatomopatológicos
• Exames macroscópicos órgãos vitais
Toxicidade de doses repetidas em ratos
Droga	
  teste:	
  
Cápsula	
  do	
  Extrato	
  Seco	
  de	
  A.	
  cearensis	
  
(ESAC)
Marcadores:	
  Cumarina e	
  Amburosídio A
Espécie:	
  ratas	
  Wistar e	
  cão	
  Beagle
Via	
  administração:	
  oral
Tratamento:	
  4	
  – 12	
  semanas
Peso (g)/ (Média ± EPM) 
Grupos 0 19 dias 26 dias 33 dias
Controle 127,3 ± 2,52 170,9 ± 2,10 185,3 ± 3,25 211,6 ± 3,52
ESAC 250 129 ± 3,60 164,0 ± 5,42 168,7 ± 9,28 186,0 ± 8,06
ESAC 500 128,8 ± 4,58 167,9 ± 7,85 186,0 ± 5,14 179,6 ± 5,61
ESAC 750 128,6 ± 3,84 168,1 ± 5,32 180,0 ± 4,24 176,4 ± 5,85
Pesos	
  de	
  ratas	
  registrados	
  durante	
  as	
  quatro	
  
semanas	
  de	
  tratamento	
  dos	
  animais	
  com	
  ESAC
PARÂMETROS CONTROLE
ESAC ESAC ESAC Valores de
250 mg / Kg 500 mg / Kg 750 mg / Kg Referência
Glicosea 64,43 ± 6,68 59,86 ± 5,54 62,57 ± 4,62 64,67 ± 3,90 59,59 - 107,15
Triglicerídeosa 25,86 ± 2,15 36,71 ± 2,91 33,00 ± 2,64 34,00 ± 4,02 27,00 - 63,40
Colesterola 55,71 ± 3,56 48,43 ± 5,30 50,14 ± 3,42 53,17 ± 7,53 36,07 - 79,13
HDLa 32,29 ± 1,43 29,57 ± 5,17 35,71 ± 2,96 37,50 ± 5,35 --
Creatininaa 0,77 ± 0,03 0,72 ± 0,03 0,71 ± 0,02 0,75 ± 0,03 0,54 - 1,06
TGO / ASTb 225,6 ± 13,36 247,1 ± 17,59 202,4 ± 14,96 193,3 ± 14,21 106,70 – 204,50
TGP / ALTb 38,57 ± 2,63 32,86 ± 1,96 35,29 ± 3,12 37,33 ± 4,02 34,00 - 96,60
Uréiaa 50,71 ± 3,61 53,14 ± 4,47 59,71 ± 5,34 57,00 ±1,34 42,00 - 71,20
Avaliação	
  toxicológica	
  do	
  ESAC:	
  parâmetros	
  
bioquímicos	
  do	
  sangue	
  de	
  ratos
3.	
  Estudos	
  de	
  Toxicidade	
  
Reprodutiva
OBJETIVO:	
  
Revelar	
  substâncias	
  toxicas	
  na	
  reprodução	
  de	
  mamíferos
FASES:
A.	
  Fertilidade	
  e	
  desenvolvimento	
  embrionário	
  inicial;
B.	
  Desenvolvimento	
  pré e	
  pós-­‐natal,	
  incluindo	
  função	
  
materna;
C.	
  Desenvolvimento embrio-­‐fetal.
4.	
  Estudos	
  de	
  Genotoxicidade
Genotoxicidade:
Estudo	
  da	
  ação	
  de	
  qualquer	
  agente	
  	
  físico,	
  químico	
  ou	
  
biológico	
  que	
  produz	
  danos	
  no	
  material	
  genético	
  de	
  células	
  
(DNA	
  ou	
  cromossomos).	
  Os	
  testes	
  avaliam	
  o	
  dano	
  
diretamente	
  na	
  célula.
4.	
  Estudos	
  de	
  Genotoxicidade
OBJETIVO:	
  testes	
  in	
  vitro	
  e	
  in	
  vivo	
  desenhados	
  para	
  
detectar	
  o	
  potencial	
  de	
  causar	
  mutações	
  genéticas	
  e	
  
cromossômicas.
RE	
  Nº	
  90	
  :	
  	
  Estudo	
  que	
  deve	
  ser	
  efetuado	
  quando	
  houver	
  
indicação	
  de	
  uso	
  contínuo	
  ou	
  prolongado	
  do	
  medicamento	
  
em	
  humanos.
Compostos	
  que	
  apresentam	
  resultados	
  “positivos”	
  são	
  
potencialmente	
  agentes	
  carcinogênicos	
  e/ou	
  mutagênicos	
  
para	
  seres	
  humanos.	
  
4.	
  Estudos	
  de	
  Genotoxicidade
MODELOS	
  BIOLÓGICOS
TESTE	
  DE	
  MUTAÇÃO	
  GENÉTICA:	
  
Para	
  detectar	
  mudançasnos	
  sítios	
  de	
  Guanina-­‐Citosina	
  (G-­‐C)
TESTE	
  DE	
  MICRONÚCLEO:
in	
  vivo	
  recomenda-­‐se	
  a	
  utilização	
  de	
  roedores	
  (camundongos	
  ou	
  ratos),	
  apenas	
  
um	
  sexo,	
  de	
  preferência	
  machos.
TESTES	
  DE	
  ABERRAÇÕES	
  CROMOSSÔMICAS:	
  	
  
podem	
  detectar	
  mudanças	
  na	
  integridade	
  cromossomal em	
  nucleotídeos	
  de	
  
células	
  hematopoiéticas	
  de	
  roedores	
  
RE	
  Nº	
  90	
  :	
  
1.	
  Avaliação	
  in	
  vitro	
  da	
  reversão	
  de	
  mutação	
  em	
  bactérias	
  incluindo	
  
ativação	
  metabólica	
  ou	
  de	
  dano	
  cromossomal de	
  células	
  de	
  mamíferos	
  ou	
  
de	
  linfoma	
  de	
  camundongo;
2.	
  Avaliação	
  in	
  vivo	
  do	
  dano	
  em	
  cromossomo	
  em	
  células	
  hematopoiéticas	
  
de	
  roedores	
  (teste	
  de	
  micronúcleo).
Análises	
  Farmacocinéticas
• Absorção do fármaco no intestino depois de, por
exemplo, uma dose oral ou mobilização do local
após a injeção
• Distribuição do princípio ativo (API) no
organismo
• Taxa do metabolismo da droga, do envolvimento
enzimático metabólico e da natureza dos
metabólitos produzidos.
Testes	
  complementares	
  de	
  
toxicidade:	
  modelos	
  experimentais	
  
de	
  citotoxicidade
Modelos	
  Experimentais	
  de	
  
Citotoxicidade
Célula  humana
Lactato  desidrogenase  (LDH)
-­ Permeabilidade  da  membrana
MTT
-­ Metabolismo  mitocondrial
Modelos	
  Experimentais	
  de	
  Citotoxicidade	
  –
Atividade	
  LDH
LDH
Citoplasma
Drogas  e  
outros  agentes
LDH
Alteração  da  permeabilidade
LDH
Meio  intracelular Meio  extracelular
PIRUVATO
LDH	
  
NADH	
   NAD+
LACTATO
Modelos	
  Experimentais	
  de	
  Citotoxicidade	
  –
Teste	
  do	
  MTT
grânulos
ribossomos
cristas
espaço  intermembranar
matriz  mitocondrial
partículas  de  ATP  sintase
DNA membrana  
externa  
membrana  
interna  
MTT Formazan
succinato-­‐tetrazol redutase
(mitocôndria)
MTT:  brometo  3[4,5-­dimetiltiazol]-­2,5,difeniltetrazólio.
MOSMANN,	
  1983
Ensaios	
  Clínicos
Brasília	
  – DF	
  
2008
Fases	
  de	
  um	
  estudo	
  clínico
ENSAIOS	
  DE	
  FASE	
  I	
  
VOLUNTÁRIOS
Limites	
  de	
  doses
Farmacocinética
Efeitos	
  inesperados
ENSAIOS	
  DE	
  FASE	
  II	
  
PACIENTES
Eficácia	
  e	
  segurança
Dose/resposta	
  
ENSAIOS	
  DE	
  FASE	
  III	
  
Perfil	
  terapêutico
Efeitos	
  tóxicos
Vantagens	
  e	
  
Limitações
FARMACOVIGILÂNCIA
vigilância	
  pós-­‐
comercialização
ENSAIOS	
  DE	
  FASE	
  IV	
  
Validação	
  de	
  plantas	
  medicinais
Planta Planta	
  medicinal
Novos	
  
Medicamentos
Fitoterápico -­‐ Fitofármacos
-­‐ Fármacos semi-­‐sintéticos
-­‐ Protótipos para a
síntese de novo fármaco
Considerações	
  finais
Obrigada!
talitamagalhaesr@gmail.com