Controle de qualidade - HPLC (2)

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Controle de Qualidade
de Plantas Medicinais e Fitoterápicos: 
enfoque no Sistema de CLAE (parte II)
Profa. Dra. Luzia Kalyne A M Leal
Plantas Medicinais e Fitoterápicos: 
Controle de Qualidade
•Materiais 
estranhos
•Cinzas 
•Microbiologia
• Macro e 
Microcospia
da planta
• Perfil 
fitoquímico
• Identificar e Quantificar 
Marcadore(s) 
Autenticidade Purezae Integ.
Análise
marcador
Laudo
técnico
Análise Interdisciplinar
Para  fins  de  registro  de  um  produto:
método  analítico  validado.
O que é VALIDAÇÃO?
United State Pharmacopoeia: Validação é o
processo que fornece uma evidência
documentada de que o método realiza aquilo
para o qual é indicado para fazer.
ANVISA: A validação deve garantir, por meio
de estudos experimentais, que o método
atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados.
VALIDAÇÃO (cont.)
• Deve ser utilizado substância química de
referência oficial (Farmacopéia Brasileira e
códigos autorizados) mas, se inexistente
utilizar padrões de trabalho com identidade e
teor devidamente comprovados.
• Metodologia analítica oficialmente
reconhecidas no país/ Farmacopéia
reconhecida pela ANVISA (RDC 37/2009)
- Não precisa ser validada, com cumprimento
de alguns critérios
• REVALIDAÇÃO
Como	
  validar?
ü RDC	
  899,	
  2003	
  – ANVISA
üRDC	
  166/2017	
  	
  -­‐ ANVISA
Validação: classificação dos testes - finalidade
RESOLUÇÃO 899 (ANVISA, 2003)
Categoria Finalidade
I Testes quantitativos para determinação
do princípio ativo em produtos
farmacêuticos ou matérias-primas
II Testes quant. ou ensaio limite para 
impurezas e produtos de degradação em 
prod. farm. e matérias-primas
III Testes de performance (ex.: dissolução 
e liberação do ativo)
IV Testes de identificação
Parâmetro Categoria	
  I
Categoria	
  II
Categoria	
  
III
Categoria	
  
IVQuantit. Ensaio	
  Limite
Especificidade Sim Sim Sim * Sim
Linearidade Sim Sim Não	
   * Não
Intervalo Sim Sim * * Não
Precisão
Repetibilidade
Sim Sim Não Sim Não
Intermediária
** ** Não ** Não
Limite	
  de	
  detecção Não Não Sim * Não
Limite	
  de	
  quantificação Não Sim Não * Não
Exatidão Sim Sim * * Não
Robustez Sim Sim Sim Não	
   Não
Classificação dos testes analíticos
PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO ANALÍTICA
• Seletividade
• Linearidade
• Faixa de trabalho
• Precisão
• Exatidão
• Robustez
• Efeito de matriz
• Limite de detecção
• Limite de quantificação
RDC  166/2017    -­ ANVISA
Validação: parâmetros
• Seletividade
Capacidade de identificar ou quantificar o analito de 
interesse, inequivocamente, na presença de componentes 
que podem estar presentes na amostra, como impurezas, 
diluentes e componentes da matriz.
• Linearidade
Mostrar que os resultados obtidos são diretamente 
proporcionais à concentração do analito na amostra, 
dentro de um intervalo.
• Intervalo RDC  166/2017    -­ ANVISA
MATRIZ COMPLEXA?
Aquela que contém um número indefinido de substâncias 
não monitoradas, que não podem ser obtidas sem a 
presença do analito
• Extratos  vegetais
• Frações  de  extratos  vegetais
• Homogenato  de  tecido  e  outras
AMB AMB
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
1,
67
3
1,
99
9
2,
31
4
18
,8
63
AMB
CM
Time  (min)
Cromatograma  dos  padrões  Cromatograma  do  extrato  
seco  de  cumaru
Validação: especificidade do método
Validação: parâmetros necessários
• Seletividade
Capacidade de identificar ou quantificar o analito de 
interesse, inequivocamente, na presença de componentes 
que podem estar presentes na amostra, como impurezas, 
diluentes e componentes da matriz.
• Linearidade
Mostrar que os resultados obtidos são diretamente 
proporcionais à concentração do analito na amostra, 
dentro de um intervalo.
• Intervalo RDC  166/2017    -­ ANVISA
Curva de calibração ?
• Mostra a resposta de um método 
analítico para quantidades 
conhecidas de analito.
• Solução-padrão ? 
• Intervalo ?
Curva de calibração do amburosídio A 
obtida em sistema CLAE: LINEARIDADE
y  =  1E+07x  +  3652,3
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
0,0000 0,0100 0,0200 0,0300 0,0400 0,0500 0,0600
ü Mínimo  5  concentrações
ü Coeficiente  de  correlação  – r
r  ≥  0,99
RDC  166/2017    -­ ANVISA
Validação: parâmetros (cont.)
• Precisão
Repetibilidade: mesmo analista e mesma instrumentação
realizar 9 determinações (conc. Baixa, média e alta) 
com 3 réplicas ou 6 determinações a 100% conc. teste
Intermediária: 
- Resultados: dias diferentes, com analistas diferentes
e/ou equipamentos diferentes
Reprodutibilidade: precisão interlaboratorial
RDC  166/2017    -­ ANVISA
Validação: parâmetros
• Exatidão
Proximidade dos resultados obtidos pelo método em 
estudo em relação ao valor verdadeiro.
• Robustez
É a medida da capacidade de um método em resistir a 
pequenas variações dos parâmetros analíticos (ex.: 
pH, composição da fase móvel etc)
RDC  166/2017    -­ ANVISA
Precisão
Preciso  e  
exato
Impreciso  e  
exato
Preciso  e  
inexato
Impreciso  e  
inexato
Repetibilidade (precisão  intra-­corrida)
Precisão  intermediária  (precisão  inter-­corridas)
Dia  1
Dia  2
Reprodutibilidade  (precisão  inter-­laboratorial)
Dia  1
laboratório analista instrumentação
Validação: parâmetros
• Exatidão
Proximidade dos resultados obtidos pelo método em 
estudo em relação ao valor verdadeiro.
• Robustez
É a medida da capacidade de um método em resistir a 
pequenas variações dos parâmetros analíticos (ex.: 
pH, composição da fase móvel etc)
RDC  166/2017    -­ ANVISA
Limite  de  detecção  (LD)
Limite  de  quantificação  (LQ)
ü Menor  quantidade  do  analito
presente  em  uma  amostra  que  
pode  ser  detectado,  porém  não
necessariamente  quantificado,  sob  
as  condições  experimentais  
estabelecidas
ü Menor  quantidade  do  analito  em  uma  amostra  que  
pode  ser  determinada  com  precisão  e  exatidão  
aceitáveis  sob  as  condições  experimentais  
estabelecidas.
REVALIDAÇÃO?
üOs	
  parâmetros	
  a	
  serem	
  revalidados	
  dependem	
  
principalmente	
  da	
  alteração	
  realizada	
  no	
  
processo/procedimento,	
  mas	
  de	
  forma	
  geral:	
  
ESPECIFICIDADE,	
  EXATIDÃO	
  E	
  PRECISÃO
Em  que  circunstâncias?
• mudanças  na  síntese  da  substância  ativa;;  
• mudanças  na  composição  do  produto  acabado;;  
• mudanças  no  método  analítico
• Outras  alterações  que  possam  impactar  
significativamente  no  método  validado.
REVALIDAÇÃO
CONTROLE DE QUALIDADE:
• Método Analítico validado* 
• Amostragem
• Preparação e análise da Amostra
RDC  166/2017    -­ ANVISA
CONTROLE DE QUALIDADE DE PLANTAS 
MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS:
AMOSTRAGEM: retirada representativa de 
material para análise 
• A análise de uma amostra representará a 
qualidade de todo lote produzido
• Corresponde a primeira etapa do Controle 
de Qualidade e pode representar até 30 % 
do erro de um processo
Farmacopéia Brasileira, V (2010)
Técnica de Amostragem: número de 
embalagens
N° Embalagens N° a  serem  
amostradas
1  a  10 1  a  3
10  a  25 3  a  5
25  a  50 4  a  6
50  a  75 6  a  8
75  a  100 8  a  10
>  100 5%  (mínino  10)
CONTROLE DE QUALIDADE:
• Método Analítico validado
•Amostragem
• Preparação de Amostras
• Realizar análise
ü Ponto crítico da análise
ü Método - características: 
- Rápido,preferencialmente
- Boa recuperação
- Reprodutivo
Preparação de Amostras
üMatriz: fluidos biológicos, extratos, 
homogenato de tecido etc
ü Marcador
Preparação de Amostras
ü Características da matriz e do analito
ü Tratamento das amostras antes da 
análise
ü Extração líquido-líquido: distribuição do 
analito em dois líquidos imiscíveis
ü Extração em fase sólida: adsorção seletiva 
do analito em materiais sólidos e posterior 
eluição com solvente
ü Outras
• Métodos de Preparação de Amostras
ü Extração líquido-líquido: distribuição do 
analito em dois líquidos imiscíveis
• Método de Preparação de Amostras
matrix
analito
-
Análise qualitativa 
e quantitativa
CONTROLE DE QUALIDADE:
• Amostragem
• Método Analítico validado
• Preparação de Amostras
Realizar análises quali e quantitativa
• Método: 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-CLAE
Avaliação quali e quantitativa de princípios 
ativos ou classe química
• Condições analíticas
CONDIÇÕES ANALÍTICAS: 
• Coluna e pré-coluna
• Fase móvel
• Volume de injeção
• Detecção e condições
• Eluição
• Temperatura
• Fluxo
Exemplos de Amostras submetidas à 
análise em sistema de
Cromatografia Líquida de Alta 
Eficiência – CLAE para identificação e 
quantificação de marcador(es)
Guaraná - Paulinia cupana H.B.K.
(Pó da semente-2g)
Extração/ solv. orgânico
NH4OH
HCl/água
Fração Orgânica Fração Aquosa
CLAE
Preparação da Amostra para análise 
quali e quantitativa de cafeína no guaraná
• ESPECIFICAÇÃO DE QUALIDADE: Constituintes químicos: cafeína (3,6 – 5,8%), 
teofilina e teobromina. Taninos (12%).
Fase móvel: água: MeOH: ác.acético 
Fluxo: 0,8mL/min.
Eluição: isocrática
Temp.: 45°C
l = 275 nm
Padrão/ Curva de Calibração: Cafeína
Dosagem de cafeína por HPLC-UV 
(United State Pharmacopoeia- USP 23)
Cafeína: 0,23 ± 0,012 mg/mL
Dosagem de cafeína no pó de 
Guaraná por HPLC-UV
Considerações Finais
O CQ de matérias-primas vegetais e
fitoterápicos deve dá-se em todas as etapas
de produção, desde o plantio até o produto
final. Para isso, é necessário dentre outos
aspectos a realização de amostragem
adequada e emprego de métodos analíticos
validados.
IMPORTANTE!!!!