Aula 3 - Validação de métodos analíticos

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Validação analítica
Validação
➢ A validação é a ferramenta adequada para garantir a confiabilidade de 
instalação do processo produtivo e de componentes-chaves que incluem:
a) Qualificação de equipamentos
b) Instalação
c) Fornecedores 
d) Validação de metodologias analíticas que certifiquem a qualidade do 
produto produzido
“Validação analítica: é a avaliação sistemática de um 
método por meio de ensaios experimentais de modo a 
confirmar e fornecer evidências objetivas de que os 
requisitos específicos para seu uso pretendido são 
atendidos” (RDC166/2017).
“O objetivo da validação de um 
procedimento analítico é demonstrar que 
ele é adequado ao uso pretendido.” (ICH-
Q2 (R1)).
"Confirmação por testes e apresentação 
de evidências objetivas de que 
determinados requisitos são preenchidos 
para um dado uso intencional" (ISO/IEC 
17025).
“A validação de métodos assegura a 
credibilidade destes durante o uso rotineiro, 
sendo algumas vezes mencionado como o 
"processo que fornece uma evidência 
documentada de que o método realiza aquilo 
para o qual é indicado para fazer" (USP 
<1225>).
"Avaliação sistemática de um 
procedimento analítico para 
demonstrar que está sob as 
condições nas quais deve ser 
aplicado" (WHO)
Validação
➢VALIDAR significa provar e documentar resultados que indiquem que o 
método é seguro dentro dos limites estabelecidos, e que com sua aplicação se 
consegue resultados desejados.
Perguntas polêmicas, como: “o que e como validar um processo?”, são 
frequentes.
A primeira resposta é “TUDO”; já a segunda parte da questão é bem mais 
complexa.
Validação
➢Alguns processos são válidos simplesmente pela eficiência da forma 
pela qual eles são controlados e documentados, exemplos:
a) Programas de manutenção preventiva
b) Procedimento de paramentação
Validação
a) Processos como controle de umidade e temperatura dos ambientes 
produtivos devem necessariamente ser atrelados a programas de 
calibração dos equipamentos de medição;
b) Processos de compra e recebimento de matérias-primas de vem ser 
atrelados a programas de qualificação de fornecedores.
Validação
➢ A VALIDAÇÃO da grande maioria dos processos ligados diretamente à 
produção requer, além da documentação detalhada de todas as 
etapas, incluindo mecanismos de controle, a qualificação de 
equipamentos e estudos comprobatórios de performance.
Validação
Processo Exemplo de requisitos Motivo
Compressão Dureza e friabilidade Resistência mecânica
Limpeza e desinfecção Contagem microbiana Controlar contaminação
Mistura de sólidos Teste de uniformidade Precisão de dosagem
Secagem Aquametria Estabilidade e teor
Quadro 1: Processos e requisitos técnicos para validação
Validação analítica
➢ O CQ de medicamentos destaca-se pelo número e diversidade de 
técnicas analíticas.
➢Este número cresce com o desenvolvimento de novos produtos, 
para os quais é necessário o uso de técnicas distintas que podem ser 
divididas em 2 grupos 
Validação analítica
➢MÉTODOS OFICIAIS 
➢MÉTODOS VALIDADOS (intra ou inter-laboratorialmente)
A aplicabilidade dos métodos oficiais na análise de medicamentos 
nem sempre é possível de ser realizada, considerando a grande 
diversificação de formulações farmacêuticas, bem como de produtos 
novos e impurezas.
Validação analítica
➢ RDC nº 166, de 24 de julho de 2017 - Dispõe sobre a validação de métodos 
analíticos e dá outras providências;
➢Provar que o método tem a capacidade de demonstrar que a medida de um 
analito numa determinada matriz é confiável e reprodutível;
➢ Recomendações que devem ser adaptadas de acordo com o método analítico 
a ser utilizado.
Desenvolvimento da Validação analítica
É necessário contar com:
a) Padrões de referência certificados;
b) Toda instrumentação deve estar previamente calibrada;
c) Inclui-se como instrumentação vidrarias, balanças, cromatógrafos e 
todos os equipamentos.
d) Em paralelo deve-se definir os níveis de validação que para o CQ de 
medicamentos é bem alto.
PARÂMETROS ANALÍTICOS DE VALIDAÇÃO
➢ De modo geral um método analítico deve, idealmente, ser EXATO para fornecer valor 
real;
➢ Ser PRECISO para fornecer, com o menor número de ensaios, este valor real;
➢ Ser SELETIVO para que a exatidão não se desvie com interferentes potenciais;
➢ Ser SENSÍVEL ou capaz de determinar as menores concentrações possíveis; e enfim, 
responder de forma proporcionalmente LINEAR, ao longo da ampla faixa de 
concentração.
Esses são os 5 atributos mais desejados em um método analítico, a base de um 
procedimento de validação: exatidão, precisão, seletividade, sensibilidade e 
linearidade.
Parâmetros
➢Linearidade
➢Seletividade
➢Exatidão
➢Precisão
➢Sensibilidade
➢Limite de detecção
➢Limite de quantificação
Linearidade
Deve ser demonstrada por meio da sua capacidade de obter respostas 
analíticas diretamente proporcionais à concentração de um analito em uma 
amostra;
Deve-se utilizar, no mínimo, 5 (cinco) concentrações diferentes da substância 
química reagente (SQR) para as soluções preparadas em, no mínimo, triplicata;
Linearidade
I. representação gráfica das respostas em função da concentração do analito; 
II. equação da reta de regressão de y em x, estimada pelo método dos mínimos 
quadrados; 
III. avaliação da associação linear entre as variáveis por meio do coeficientes de 
correlação (r) e de determinação (r²); 
O coeficiente de correlação deve estar acima de 0,990
Linearidade
Conc. padrão 
(μg/mL)
Absorbância
Curvas
A B C D E Média ± DP
3,0 0,248 0,247 0,244 0,246 0,242 0,245 ± 0,002
4,0 0,323 0,308 0,323 0,317 0,323 0,319 ± 0,007
5,0 0,403 0,4 0,408 0,4 0,404 0,403 ± 0,003
6,0 0,546 0,535 0,539 0,54 0,536 0,539 ± 0,004
8,0 0,675 0,673 0,687 0,708 0,702 0,689 ± 0,016
10,0 0,883 0,874 0,858 0,839 0,891 0,869 ± 0,021
Linearidade
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
2,0 4,0 6,0 8,0 10,0
A
b
so
rb
â
n
ci
a
 (
λ
=
 4
2
9
 n
m
)
Concentração do analito (ug/mL)
y = 0,0905x - 0,0323
r2 = 0,9954
Coeficiente de correlação
Pelo menos 5 
concentrações 
diferentes
Seletividade
➢ A seletividade do método analítico deve ser demonstrada por meio da sua 
capacidade de identificar ou quantificar o analito de interesse, 
inequivocamente, na presença de componentes que podem estar presentes 
na amostra, como impurezas, diluentes e componentes da matriz;
➢Capacidade de diferenciar o analito na presença de outros compostos na 
mesma matriz;
➢Testar interferentes potenciais na matriz em que será aplicado o método;
Seletividade
Leitura Absorbância
L1 -0,002
L2 -0,002
L3 0,000
L4 -0,002
L5 -0,002
L6 -0,002
L7 -0,002
L8 0,000
L9 -0,002
Média ±
DP
-0,002 ± 0,001
Absorbâncias a 429 nm de formulação base (sem adição do analito)
Legenda: L1 a L9 – réplicas da mesma amostra
Todos apresentam o 
mesmo valor de 
absorbância quando 
avaliamos uma 
formulação base
Seletividade/Especificidade
Especificidade: Um método que produz resposta 
para apenas um analito é chamado específico.
Seletividade: Um método que produz respostas 
para vários analitos, mas que pode distinguir a 
resposta de um analito da de outros, é chamado 
seletivo.
Intervalo
➢ O intervalo especificado é a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um 
método analítico
Exatidão e Precisão
Precisão
Expressa por meio da:
Repetibilidade (Precisão intra-dia)
Precisão intermediária (Precisão inter-dia)
Reprodutibilidade
Mesmas condições de operação, mesmo analista e mesma instrumentação, 
em uma única corrida analítica
Análise de uma mesma amostra, no mesmo laboratório, em pelo menos dois dias 
diferentes, realizada por operadores distintos
Estudos colaborativos ou na padronização de métodos analíticos para inclusão 
desses em compêndios oficiais, mediante testes estatísticos adequados
Precisão
Demonstrada pela dispersão dos resultados
DPR = (DP/CMD)X100, em que DP é o desvio padrão e CMD, a 
concentração médiadeterminada.
L1 L2 L3 Cmédia ± DP
Precisão 
intra-dia (%)
Precisão inter-
dia (%)% p/p
C1 4,95 4,96 4,95 4,95 ± 0,01
1,51
1,16
C2 4,85 4,83 4,85 4,84 ± 0,01
C3 4,86 4,85 4,86 4,86 ± 0,01
C4 4,96 4,97 4,97 4,97 ± 0,01
C5 4,85 4,84 4,83 4,84 ± 0,01
C6 4,80 4,80 4,80 0,48 ± 0,00
C7 5,02 5,00 5,01 4,80 ± 0,00
C8 4,86 4,89 4,97 5,01 ± 0,01
C9 4,98 5,02 5,01 5,00 ± 0,02
C10 4,92 4,91 4,92 4,92 ± 0,01
CID1 4,91 ± 0,07
C11 4,87 4,86 4,87 4,87 ± 0,01
0,72
C12 4,90 4,91 4,91 4,91 ± 0,01
C13 4,95 4,94 4,94 4,94 ± 0,01
C14 4,93 4,91 4,91 4,92 ± 0,01
C15 4,94 4,97 4,95 4,95 ± 0,01
C16 4,93 4,93 4,95 4,94 ± 0,01
C17 4,89 4,90 4,90 4,90 ± 0,01
C18 4,97 4,98 4,99 4,98 ± 0,01
C19 4,98 4,96 4,98 4,97 ± 0,01
C20 4,95 4,92 4,92 4,93 ± 0,02
CID2 4,93 ± 0,04
A precisão, definida como 
desvio padrão relativo 
(DPR), é considerada 
aceitável quando encontra-se 
abaixo de 15% (BRASIL, 
2003; FDA, 2015)
Exatidão
Relação percentual de recuperação do analito de concentração conhecida 
adicionado à amostra ou pela relação entre a concentração média, 
determinada experimentalmente, e a concentração teórica correspondente
Recuperação =
Concentração média experimental
Concentração teórica
x 100
Os valores obtidos experimentalmente devem estar dentro de uma faixa de 15% 
da concentração teórica, ou seja, entre 85 e 115% (BRASIL, 2003; FDA, 2015)
Deve ser determinada 
após o estabelecimento 
da linearidade e 
especificidade
Exatidão
Concentração do analito (µg/mL)
Exatidão (%)
Conc.Teórica Conc.Experimental
5,55 5,99 107,9
6,55 7,13 108,8
7,55 8,22 108,9
Os valores obtidos experimentalmente devem estar dentro de uma faixa de 15% 
da concentração teórica, ou seja, entre 85 e 115% (BRASIL, 2003; FDA, 2015)
Sensibilidade
➢ Limite de detecção (LD)
➢ Limite de quantificação (LQ) 
Limite de detecção (LD) Limite de quantificação (LQ)
➢ Menor quantidade do analito 
presente em uma amostra que 
pode ser detectado, porém, não 
necessariamente quantificado, 
sob as condições experimentais 
estabelecidas
➢ Menor quantidade do analito em uma 
amostra que pode ser determinada com 
precisão e exatidão aceitáveis sob as 
condições experimentais estabelecidas
➢ As medidas quantitativas devem ser feitas 
num nível superior ao LQ
Robustez
➢ É a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos 
parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o seu uso normal
Esse parâmetro prevê a dependência 
do método a essas variáveis, durante o 
processo analítico.
Mapa mental de validação analítica
➢Linearidade
➢Seletividade
➢Exatidão
➢Precisão
➢Sensibilidade
➢Limite de detecção ➢Limite de quantificação
➢Robustez
Referências
✓ GIL, E. Controle Físico-químico de qualidade de medicamentos. 3. ed. São 
Paulo: Editora Pharmabooks, 2010
✓ ANVISA. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução da 
diretoria colegiada- RDC nº 17, de 16 de Abril de 2010. Disponível em:< 
www.anvisa.gov.br/legis>
✓ DOQ-CGCRE-008. Orientação sobre validação de Métodos analíticos: 
documento orientativo. INMETRO, Revisão: 04 , Jul.2011