Métodos de estudo

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Citologia e Histologia
	 Métodos de Estudos
			 Prof. Ricardo Andrade
Introdução
O estudo das células e tecidos inicia-se com o conhecimento de suas estruturas.
o ramo da biologia denominado morfologia.
A morfologia utiliza o método cartesiano, isso é:
	 1. dissecação das estruturas do nível mais geral de organização para o nível mais particular. 
Métodos de Estudo em Cito e Histologia
A análise das estruturas de células e tecidos nos órgãos depende da observação com o microscópio de luz (microscópio óptico) e o microscópio eletrônico.
Biópsia
Retirada do órgão ou parte do órgão ocorre no ser vivo, sob anestesia.
Necropsia
	Retirada do material para estudo em animal já morto. 
Importante!!!!
Consiste na etapa de obtenção de fragmentos do material biológico para estudo (< 1cm).
Os fragmentos do tecido devem ser mergulhados na substância fixadora imediatamente após sua retirada.
Fixação
Promove a preservação dos tecidos para que sejam observados no microscópio, ou seja, evita-se a degeneração post-mortem. A fixação tem como finalidade:
impedir a autólise ou digestão das células e tecidos por ação de enzimas hidrolíticas presentes no interior dos lisossomas 
digestão por ação de bactérias que provocam putrefação dos tecidos 
rigidez no tecido para facilitar as etapas seguintes 
matar bactérias e outros agentes causadores de doenças 
A fixação ideal é aquela que preserva a estrutura do tecido morto com aspecto o mais próximo possível da estrutura do tecido vivo.
Os mecanismos de ação dos fixadores nem sempre são conhecidos. Geralmente eles agem como desnaturantes ou estabilizadores das proteínas das células e tecidos
Processos da fixação
Processos físicos:
Calor (chama de um bico de gás incandescente) 
Frio (temperaturas inferiores a 0°C) 
Processos químicos:
Solução de substâncias fixadoras, como por exemplo:
Formaldeído 45 (formol), paraformaldeído e glutaraldeído: (substâncias do grupo dos aldeídos) – ligam-se às proteínas das células e tecidos 
Tetróxido de ósmio: essa substância é muito utilizada como fixadora em técnicas de microscopia eletrônica ( t. ósmio e aldeído glutárico)
Misturas de diversas substâncias fixadoras em solução como: líquido de Bouin (mistura de formaldeído, ácido acético, picrato de sódio) 
Importante na fixação
1. Processo imediato – que dura aproximadamente cerca de 12 horas dependendo do material ( tamanho) e do fixador
Desidratação
A desidratação - retirar a água.
	Consiste na imersão dos tecidos em soluções de concentração crescente de etanol (etanol a 70%100%), para
Os tecidos são desidratados após a fixação para que possam ser incluídos em meio sólido e submetidos a microtomia. 
Importante na desidratação
Duração de 06 a 24 horas dependendo da peça ( tamanho).
Clarificação
Torna os tecidos mais translúcidos.
Também conhecida como diafanização.
Processo:
Consiste em passar os fragmentos impregnados em álcool em vários banhos de xilol, substituindo assim o álcool pelo xilol. Dando aspecto translúcido aos fragmentos.
Observação: xilol ou benzol – substância miscível com o meio de inclusão ( parafina ou resinas plásticas).
Importante na clarificação
Duração de 1 a 06 horas dependendo da peça ( tamanho ).
Impregnação
Impregnar os tecidos com substâncias orgânicas no estado líquido. 
Geralmente usam-se vários banhos de parafina aquecida.
Usa-se estufa a 60º.C ( promove evaporação do xilol e benzol), ou seja, remove o solvente usado na etapa de clarificação.
A parafina penetra nos espaços
Resfria -se, torna-se um bloco rígido e macio. 
Alternativamente, usam-se outros meios de inclusão como resina plástica, que, entre outras vantagens, permite a obtenção de cortes mais finos e melhor visualização dos tecidos. 
Importante na impregnação
Duração de 30 minutos a 06 horas dependendo da peça ( tamanho).
Inclusão
Peça é colocada num molde retangular contendo a parafina.
Objetivo: ter um bloco de parafina regular para ser cortado.
Micrótomo
	Instrumento para seccionar.
	Utiliza a navalha de aço/ vidro ou diamante.
	Secciona os blocos de parafina contendo os tecido influídos.
Cortes
Na microscopia óptica – 06 a 08 micrômetros
Obs.: com uso de resinas – corte de 1 a 2 micrômetros – navalha de aço.
Na microscopia eletrônica – corte de 0,02 a 0,1 micrômetros – navalha de vidro ou diamante
Pós corte
Os cortes são estirados em água quente e depois colocados nas lâminas. 
Coloração – corantes:
Básófilos – azul de toluidina/ azul de metileno/ hematoxilina
Acidófilos – orange G, eosina, fucsina ácida
Coloração mais utilizada hematoxilina/eosina.
Atividade complementar
1. apresente um esquema geral do processo de preparação de lâminas.