Técnica de Biofísica Molecular e Celular

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Técnicas de Biofísica 
Molecular e Celular 
Prof. Thiago Salazar 
Universidade Federal de Pernambuco 
Centro de Ciências Biológicas 
Departamento de Biofísica e Radiobiologia 
 
Técnicas Moleculares 
• DNA recombinante 
 
• PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) 
 
• Sequenciamento de DNA 
 
• Microarranjo de DNA 
 
• FISH (Hibridização in situ Fluorescente) 
Plasmídios 
Plasmídios 
• São moléculas de DNA circulares que se 
replicam separadamente do cromossomo 
Enzimas de Restrição 
Interação da endonuclease de restrição 
EcoRV com sua sequência alvo 
Cromossomo bacteriano 
Clonagem de DNA 
• Procedimentos gerais: 
 
– Cortar o plasmídio por enzima de restrição 
– Cortar o DNA humano 
– Ligar o fragmento de DNA humano ao vetor de 
clonagem (plasmídio) com DNA ligase 
– Transferir o DNA recombinante para uma célula 
hospedeira 
– Selecionar as células hospedeiras que 
contenham o DNA recombinante 
 
 
+ 
DNA exógeno DNA plasmidial 
Inserção do gene (enzimas de restrição e DNA ligase) 
DNA recombinante 
Transformação, Eletroporação ou Infecção Viral 
Seleção dos clones com 
DNA recombinante 
Produção de proteína exógena 
Enzimas de Restrição 
5’ – G – A – A – T – T – C – 3’ 
3’ – C – T – T – A – A – G – 5’ 
5’ – C – C – G – C – G – G – 3’ 
3’ – G – G – C – G – C – C – 5’ 
Streptomyces achromogenes 
Escherichia coli 
Sequências 
palindrômicas 
Enzimas Ligase 
5’ – C – C – G – C – A – A – T – T – C – 3’ 
5’ – C – C – G – C – 3’ + 5’ – A – A – T – T – C – 3’ 
Enzimas Organismo fonte Sítio de restrição de 
DNA bifilamentar 
Estrutura dos 
produtos cortados 
(a) 
EcoRI 
Escherichia coli 
 ↓ 
5'-G-A-A-T-T-C- 
 -C-T-T-A-A-G-5' 
 ↑ 
-G 5' A-A-T-T-
C- 
-C-T-T-A-A 
5' G- 
PstI Providencia stuartii 
 ↓ 
5'-C-T-G-C-A-G- 
 -G-A-C-T-C-5' 
 ↑ 
-C-T-G-C-
A 3' G- 
-G 3' A-C-G-T-
C- 
SmaI Serratia marcescens 
 ↓ 
5'-C-C-C-G-G-G- 
 -G-G-G-C-C-C 5' 
 ↑ 
-C-C-C G-G-
G- 
-G-G-G C-C-
C- 
(b) 
HaeIII 
Haemophilus 
aegyptius 
 ↓ 
5'-G-G-C-C 
 -C-C-G-G- 5' 
 ↑ 
-G-G 5' G-G 
-G-G '5 G-G- 
HpaII 
Haemophilus 
parainfluenzae 
 ↓ 
5' -C-C-G-G- 
 -G-G-C-C 5' 
 ↑ 
-C C-G-G- 
-G-G-C C- 
Endonucleases de Restrição 
• Extremidades coesivas 
 ↓ 
5'-G-A-A-T-T-C- (EcoRI) 
 -C-T-T-A-A-G-5' 
 ↑ 
• Extremidades cegas 
 ↓ 
5'-G-G-C-C (HaeIII) 
 -C-C-G-G- 5' 
 ↑ 
 
Enzimas utilizadas na Tecnologia de 
DNA recombinante 
Transformação Bacteriana 
• DNA e células são incubadas juntos, a 
0 ºC em solução de cloreto de cálcio 
(CaCl2) 
 
• Choque térmico de 0 ºC a 43 ºC 
 
• Incubação por 24 h a 37ºC 
 
• Células “competentes” em receber o DNA 
1. E. coli em fase log 
de crescimento e 
sensível à ampicilina 
transferidas para uma 
solução gelada de 
CaCl2 
2. Plasmídios 
ampR são 
adicionados às 
células 
3. Células 
submetidas ao 
choque térmico à 42 
ºC. Algumas células 
incorporam o 
plasmídio ampR 
 
 
 
4. As células são 
espalhadas em 
placa de ágar 
contendo 
ampicilina 
 
Ampicilina mata as 
células que não 
contêm o gene ampR 
 
6. Apenas as colônias de E. coli que foram transformadas 
pelo gene ampR irão crescer 
5. As células são 
incubadas por 24 
horas a 37 ºC 
Placa Inicial 
Eletroporação 
• Células incubadas com o plasmídio são 
submetidas a um pulso de alta voltagem 
 
• Induz a membrana celular a se tornar 
permeável transitoriamente a grandes 
moléculas 
Seleção do Clone 
• Poucas células recebem o DNA plasmidial 
 
• O plasmídio deve conter um gene 
(marcador seletivo) que confere à 
bactéria resistência para crescer em 
condições específicas, ex. antibiótico 
Plasmídio pBR322 de E. coli 
Características úteis em vetor de 
clonagem 
• Uma origem de replicação – 10 a 20 
cópias por célula 
• Dois genes que confiram resistência a 
antibióticos diferentes 
• Várias sequências de reconhecimento 
para diferentes endonucleases de 
restrição 
• Um tamanho pequeno para facilitar 
entrada na célula e manipulação 
bioquímica 
Origem de Replicação 
Proteína 
Heteróloga 
YAC – 
Cromossomo 
Artificial de 
Levedura 
Cromossomo Artificial de Bactéria 
(BACs) 
• Plasmídios designados para a clonagem de 
segmentos de DNA muito grandes 
(centenas de milhares de pb) 
• Marcador seletivo – resistência ao 
cloranfenicol (CmR) 
• Origem de replicação (ori) muito estável 
• Introduzidos por meio da eletroporação 
• Mutações induzidas que comprometem a 
estrutura da parede celular – facilita entrada 
 
 
Biblioteca de DNA 
• Extração do mRNA 
 
• Transcriptase reversa 
 
• cDNA 
 
• Bibliotecas de cDNAs 
Hibridização 
• Detecção de um gene particular ou um 
segmento de ácido nucléico 
• DNA da sonda marcada (radioativa) 
complementar ao DNA de interesse 
• Papel de nitrocelulose prensado sobre uma 
placa de ágar 
• Papel tratado com base para liberar o DNA 
• Sonda de DNA radioativa adicionada ao 
papel 
Desenho de Sondas 
Microarranjo de DNA 
Estágios do 
Desenvolvimento 
Verde 
Vermelho 
Bacteriófagos 
• Cerca de 1/3 do genoma do fago não é essencial 
e pode ser substituído pelo DNA estranho 
 
• O DNA será empacotado em partículas 
infecciosas do fago apenas se elas contiverem 
40.000 a 53.000 pares de base de comprimento, 
o que permite o empacotamento do DNA 
recombinante 
https://www.newworldencyclope
dia.org/entry/Bacteriophage 
Terapia 
Gênica 
Clonagem de Plantas 
• Importância na Agricultura: 
 
– Alterar perfis nutricionais 
 
– Rendimento das safras 
 
– Resistência a estresses ambientais (pragas, 
insetos, doenças, frio, salinidade e seca) 
 
Planta de tabaco com o gene da 
luciferase de vaga-lume 
Plantas de tomate resistentes à larva 
de insetos 
Resistente – geneticamente 
modificada 
Não resistente – não 
geneticamente alterada 
Sequenciamento do DNA 
Sequenciamento de DNA 
• Técnica que determina a sequência de 
nucleotídeos que compõem o DNA 
• Identificação da ordem exata dos pares de 
base (A, T, G e C) em um segmento de 
DNA 
• Podemos sequenciar RNA ou DNA 
Qual a sua importância? 
• Compreensão de um gene e sua regulação, 
sua relação com outros genes ou a função 
de seu RNA ou proteína 
 
• Investigação biológica básica, ou aplicada à 
biotecnologia e diagnóstico 
Didesoxi 
Comparação 
H2O 
Por que a DNA polimerase ‘funciona’ no sentido 3’-5’? 
Tem fosfato ‘extra’ (trifosfato) 
(P) ~ (P) ~ (P) 
... 
Prospecção de Genes 
• Procura de seqüências nos bancos de 
dados 
 
• Alinhamento múltiplo das sequências 
 
• Identificação dos domínios conservados 
Terminologia 
• Prospecção 
– do Lat. prospectione, visão sobre o futuro 
 
• Genes 
– do Gr. génos, geração 
 
• No sentido de pesquisa de funções e 
caracterização de genes de interesse 
 
Estratégia de Prospecção 
• Procura de seqüências nos bancos de 
dados. 
 
• Alinhamento múltiplodas sequências 
 
• Identificação dos domínios conservados 
 
• Desenho de primers 
 
• Construção das bibliotecas de cDNA 
DB - NCBI 
NCBI (National Center for Biotechnology Information) 
1988 – Criado como fonte nacional (norte americana) de 
informações sobre biologia molecular 
 
– Bancos de Dados públicos 
– Pesquisas na área da biologia computacional 
– Desenvolvimento de ferramentas para análise de 
dados genômicos 
– Informações biomédicas 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 
NCBI 
Reação em cadeia da polimerase 
(PCR) 
Princípios da reação 
 • Técnica que permite a amplificação de DNA ou RNA in 
vitro, utilizando-se basicamente de uma reação 
enzimática catalisada pela polimerase cuja atividade 
depende de íons Mg2+ 
 
• A PCR ocorre em 3 etapas: 
 
• “Melting” (separação da dupla fita) 
 
• “Annealing” (anelamento ou hibridização - ligação do 
iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado 
 
• “Extension”(extensão-polimerização) inicia na posição 
3’ - “primer” 
 
Kary Mullis 
- 
+ 
SNPs 
PCR-RFLP 
• Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos 
de Restrição 
• Submete o material amplificado de uma 
reação de PCR a enzimas de restrição 
que cortam o DNA em posições 
constantes 
• Técnica que explora as variações nas 
sequências homólogas de DNA 
RFLP 
Técnicas de Estudo dos SNPs 
• PCR Alelo-Específico: 
 
– Técnicas simples, rápida, confiável e de baixo 
custo 
– Os primers forward são desenhados com 
tamanhos diferentes e extremidades 3’ 
complementares ao alelo normal mutante 
– O primer reverse complementa ambos os 
alelos 
– Restrito ao estudo de SNPs conhecidos 
Técnicas de Estudo dos SNPs 
• PCR alelo-específico 
Técnicas de Estudo dos SNPs 
• Real Time PCR: 
– Estudo de SNPs conhecidos 
 
• Diversos tipos de sistemas para detecção 
de produtos de qPCR 
– Sondas TaqMan 
– SYBR green 
– etc 
Sondas TaqMan 
• Sistema baseado na detecção e 
quantificação de um sinal florescente 
 
• Características: 
 
– Baseia-se na atividade 5’-3’ exonuclease da 
Taq polimerase 
– Funciona com sondas fluorescentes 
– Específico e sensível 
Sondas TaqMan 
• Características: 
 
– Localiza-se de 1 a 5 bases do primer forward 
– Tm deve ser 10ºC maior do que a Tm dos 
primers 
– Não deve ter mais do que três bases 
consecutivas iguais 
 
Sondas TaqMan 
• PCR inclui, além dos primers, uma sonda 
conjugada com: 
– Fluorocromo “reporter” – emite fluorescência 
– Molécula “quencher” – absorve a 
fluorescência do “reporter”, quando a sonda 
está intacta 
 
 
Sondas TaqMan 
• Corantes fluorescentes (Fluorocromos): 
 
– Reporters – FAM, VIC, NED, JOE 
– Quenchers – TAMRA e NFQ 
Técnicas de Estudo dos SNPs 
• Sequenciamento 
 
– Identificação de novos SNPs 
DNA 
Hibridização in situ fluorescente 
F 
Fluorocromo 
SONDA 
Sonda FISH 
Sinal 
fluorescente 
Lâmina 
Cromossomos 
DNA 
Sonda FISH anelando à 
molécula de DNA 
Sonda 
Hibridização in situ Fluorescente (FISH) 
Hall, 2000 
FISH 
Lloyd, 2005 
FISH 
IAEA, 2001 
Célula Estável 
ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS ESTÁVEIS 
TRANSLOCAÇÃO RECÍPROCA 
INSERÇÃO 
Inserção 
Micronúcleo 
Centrômero 
Negativo 
Centrômero 
Positivo 
Perda 
cromossômica 
Fragmento 
acêntrico