milho, tratos, fitossanidade e colhita

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Disciplina: Fitopatologia Geral
Diagnose de Doenças de Plantas
Postulados de Koch
 1. ASSOCIAÇÃO CONSTANTE PATÓGENO-HOSPEDEIRO: 
 Associar sempre um determinado sintoma a um patógeno particular. 
 2. ISOLAMENTO DO PATÓGENO: 
 O organismo associado aos sintomas deve ser isolado da planta doente e 
multiplicado artificialmente. 
 3. INOCULAÇÃO DO PATÓGENO E REPRODUÇÃO DOS SINTOMAS: 
 A cultura pura do patógeno, obtida anteriormente, deve ser inoculada em 
plantas sadias da mesma espécie que apresentou os sintomas inicias da 
doença e provocar a mesma sintomatologia observada anteriormente. 
 4. REISOLAMENTO DO PATÓGENO:
 O mesmo organismo deve ser isolado das plantas submetidas à inoculação 
artificial. 
TESTE DE PATOGENICIDADE PARA PARASITAS 
OBRIGATÓRIOS
 1. Associação constante patógeno-hospedeiro: 
 Um determinado microrganismo deve estar presente em 
todas as plantas de uma mesma espécie que apresentam o 
mesmo sintoma. 
 2. Inoculação do patógeno e reprodução dos sintomas:
 Extrato de folhas doentes (no caso de vírus) 
 ou suspensão de esporos ou esporângios (no caso de 
fungos causadores de ferrugens, carvões, oídios e míldios) 
 deve ser inoculado em plantas sadias da mesma espécie que 
apresentou os sintomas iniciais da doença e provocar a 
mesma sintomatologia observada anteriormente 
Preparo de meio de cultura para isolamento de 
fitopatógenos
Isolamento de fungos fitopatogênicos Isolamento de bactérias fitopatogênicas
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• Bactérias são classificação em 2 grandes Grupos:
1884 - Método de Coloração de Gram (Bacteriologista 
dinamarquês Hans Christian Gram)
Detecção de Bactérias Fitopatogênicas
Gram positivas: roxo Gram negativas: vermelho
Amostra vegetal com 
sintomas de mosaico
Trituração da amostra 
em presença da 
solução tampão e 
abrasivo em almofariz
Inoculação do 
extrato vegetal em 
plantas indicadoras
Transmissão mecânica de vírus fitopatogênicos
Observação dos sintomas em uma série de plantas-teste inoculadas
Plantas indicadoras:
Espécies que reagem com sintomas característicos 
e consistentes para o(s) vírus em estudo.
 Pré requisito para as medidas adequadas de CONTROLE
 Difícil observação sem MET
- Diagnóstico IDEAL:
- Resultados rápidos e precisos
- Custo reduzido
DIAGNOSE
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1 - Teste de Gama de Hospedeiras: sintomas em uma série de 
plantas-teste
Amostra vegetal 
com sintomas de 
mosaico
Trituração da 
amostra em 
presença da 
solução tampão e 
abrasivo em 
almofariz
Inoculação do 
extrato vegetal 
em plantas 
indicadoras
Plants infected with PVX.GFP or PVX.19K at 21 dpi. (A) N. benthamiana plants infected with PVX.GFP (left) and PVX.19K 
(right). (B, D) PVX.19K-infected N. benthamiana and N. clevelandii plants, respectively, at 21 dpi show systemic necrosis. 
(C) PVX.GFP-infected N. clevelandii plants. (E, F) C. quinoa and C. amaranticolor leaves infected with PVX.19K (left both 
panels) and PVX.GFP (right in both panels).
2- Microscopia ótica e eletrônica: Partículas virais e inclusões
citoplasmáticas -Bastonete rígida 
Tobacco mosaic virus (TMV) 
300x18nm 
-Alongada flexuosa 
Inclusões do tipo 
cata vento- Potyvirus
- Poliédrica, isométrica
3)identificação vírus de plantas
técnica sorológica – ELISA
 Enzyme-Linked Imunosorbent Assay
Teste de imunoadsorção com enzima ligada ao Antissoro
 Sorologia baseada na reação: Anticorpo e Antígeno
 Produção do Anti-soro:
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Após a purificação, o vírus é injetado em um animal de sangue quente para produzir
os ANTICORPOS contra o vírus.
IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS DE PLANTAS
37° - 1h 10°C-3h
3000g - 10’
Plantas coletadas no campo com 
sintomas de mosaico
Amostras trituradas
Amostras trituradas adicionadas a um suporte sólido 
(placa)
Microscopia Eletrônica
Microscopia Óptica
Exames microscópicos
- Poder de Resolução:
-Olho humano: 0,1 mm ou 100.000 nm
-Microscópio de luz: 200 nm
-MEV: 3-5 nm
-MET: 0,1-0,2 nm
Microscopia ótica:inclusões cristalinas
Microscopia eletrônica: Partículas virais e 
citoplasmáticas
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Inclusões cristalinas-TMV
Inclusões do tipo cata vento- Potyvirus
-Bastonete rígida 
Tobacco mosaic virus (TMV) 
300x18nm 
-Alongada flexuosa 
Lettuce mosaic virus (LMV) 
730x11nm 
- Poliédrica, isométrica
Cucumber mosaic virus (CMV) 29 nm
- Geminada
Bean golden mosaic virus (BGMV) 24x48 nm
- Pleiomórfico
Tomato spotted wilt virus
(TSWV) 
90x70 nm
- Baciliforme
Lettuce necrotic yellows virus
(LNYV) 
230x70 nm
3- Sorologia: 
Especificidade da reação entre 
ANTÍGENO (AG): vírus no hospedeiro 
ANTICORPO (AC): substância produzida contra o 
antígeno
PRODUÇÃO DE ANTISSORO / ANTICORPO a partir 
da PURIFICAÇÃO DA CAPA PROTÉICA DO VÍRUS 
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Verificação da presença do vírus 
por meio do gradiente de sacarose e 
leitura em espectofotômetro
Adjuvante: Aditivo utilizado 
que permite a liberação do 
antígeno (vírus purificado) 
no organismo do animal por 
um período de tempo 
prolongado
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37° - 1h 10°C-3h
3000g - 10’
Teste sorológico:
Teste de imunoadsorção com enzima ligada ao anticorpo (enzyme-linked 
imunosorbent assay,ELISA)
-Originalmente desenvolvido para análises 
clínicas
-Reação enzimática
-Maior sensibilidade
-Anti-soro altamente diluído
-Pode conter variações 
Incubar 1 h a 37 ° C ou 18 h a 4 °C
Lavagem da placa
Adição do Antissoro 
(vírus que foi purificado)
Incubar 1 h a 37 ° C ou 18 h a 4 °C
Lavagem da placa
Adição do Conjugado
Incubar 1 h a 37 ° C ou 18 h a 4 °C
Lavagem da placa
Adição da Fosfatase Alcalina
Métodos Moleculares
UTILIZA O ÁCIDO NUCLÉICO PARA A 
DETECÇÃO DO PATÓGENO
Extração de ácidos nucléicos
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DNA: mais resistente à degradação
RNA: altamente suscetível à degradação por RNases
Vidrarias, Mãos, Saliva, Água
Protocolos de extração de Ácidos Nucléicos devem 
conter:
1) Tampão de extração com anti-oxidante
2) Tampão de lise celular e inativação de nucleases
detergente (SDS), desnaturante proporciona o 
rompimento celular 
3) Solvente orgânico para dissolver a proteína e expor 
o ácido nucléico
4) Tampão de Precipitação sal e álcool
5) Tampão de Lavagem álcool 70%
6) Secagem
6) Ressuspensão
Reação em cadeia da polimerase 
(polymerase chain reaction, PCR)
-Descrito por Kary Mullis no final da década de 1980, em 1993, 
Prêmio Nobel da Química pelo seu trabalho 
-Amplificação de um número elevado de cópias da seqüência de 
DNA
-Delimitada por dois oligonucleotídeos:
Fragmentos curtos de uma cadeia simples de ácido nucléico 
tipicamente com 20 ou menos bases
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• DNA desejado
• Par de oligonucleotídeos ou “primers”
• Enzima Taq DNA Polimerase
• DNTP’s
dATP (desoxiAdenosina Trifosfatada), 
dCTP (desoxiCitidina Trifosfatada), 
dGTP (desoxiGuanosina Trifosfatada) e 
dTTP (desoxiTimidina Trifosfatada), 
• Cloreto de Magnésio
• Tampão da Enzima
• Água
ELETROFORESE
- Separação de macromoléculas (proteínas, ácidos 
nucléicos) em gel com base no tamanho e carga elétrica
- DNA: macromolécula com carga total negativa
devido aos resíduos fosfato
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Agarose: cadeia de açúcares extraída de 
algas marinhas
Polímero: funciona como uma peneira
DNA: macromolécula com carga total 
negativa devido aos resíduos fosfato 
São utilizados ainda:
- Corante de DNA e 
- Luz U.V.
DNA é transparente e não fluoresce sob UV
- Brometo de Etídeo, SyberGreen
fluoresce com coloração avermelhada sob luz ultra-violeta)
***intercalanteentre as bases do DNA
CANCERÍGENO E MUTAGÊNICO
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Visualização do DNA no Gel
DIAGNOSE
 Doenças diagnosticadas: Sintomas e sinais;
 Utilização: chaves de identificação, publicadas em livros,
revistas, folhetos, relatórios; internet
 Comparação com a literatura
 Sintomas não característicos de doença (diferentes causas);
 Questionário, histórico da área
 Observações ao microscópio
COMO COLETAR, PREPARAR E ENVIAR MATERIAL 
PARA ANÁLISE FITOPATOLÓGICA?????
A – Plantas demonstrando murchamento, amerelecimento ou enfraquecimento 
geral.
1. Arrancar as plantas cuidadosamente (não puxá-las).
2. Enviar a planta inteira, incluindo as raízes, com torrão de terra em volta.
3. Enviar plantas que apresentem os primeiros sintomas da doença.
4. Enviar amostras do solo e pedaços de raízes em saco plástico, bem fechado 
para evitar perda de umidade.
5. Árvores grandes, coletar as raízes, grandes e pequenas, junto com torrão de 
solo, na área da projeção da copa, cobrindo-as com plástico.
COMO COLETAR, PREPARAR E ENVIAR MATERIAL 
PARA ANÁLISE FITOPATOLÓGICA?????
B – Cancros em ramos e troncos
1. Selecionar espécimes com infecções recentes.
2. Enviar uma parte inteira com o sintoma e, se possível, também uma parte 
localizada abaixo e acima da parte infectada.
3. Ramos e galhos mortos, há vários meses, não servem para identificações.
COMO COLETAR, PREPARAR E ENVIAR MATERIAL 
PARA ANÁLISE FITOPATOLÓGICA?????
C – Manchas foliares
1. Coletar amostras de folhas que mostram sintomas iniciais e adiantados 
de infecção.
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COMO COLETAR, PREPARAR E ENVIAR MATERIAL 
PARA ANÁLISE FITOPATOLÓGICA?????
D – Órgãos frágeis
1. Putrefações em frutas frágeis e vegetais necessitam atenção especial. Não 
enviar aquelas com avançado estado de decomposição.
2. Selecionar espécimes frescos que demonstrem os primeiros sintomas, 
colocá-los em saco plástico, não adicionar água. 
Vegetais frágeis e frutas devem ser acondicionadas separadamente.
Guardar em lugar fresco, até o momento do envio.
Obs.: É recomendado o uso de saco plástico devido a melhor conservação do 
material e para evitar derrames de secreções, etc.
E – Acondicionamento e despacho
1. Embrulhar cada espécie em papel resistente. Colocar o endereço 
perfeitamente visível.
2. Folhas ou pequenas plantas podem ser envolvidas em folha de jornal.
3. Não colocar o endereço e a ficha de identificação em contato com o material 
a ser analisado.
4. Enviar logo após a coleta. Se não for possível, guardar em geladeira até o 
momento da remessa.
5. Endereçar para laboratório fitopatológico.
6. Programar a chegada das amostras no laboratório, em dias úteis (segundas 
as sextas-feiras)
F – Informações que devem acompanhar o espécime
1. Preencher o mais detalhado possível a ficha para o envio 
do material para análise.
2. Colocar a ficha em lugar seguro junto ao pacote.
RECOMENDAÇÕES PARA COLETA DE MATERIAL PARA 
ANÁLISE DE NEMATÓIDES
1- Caules e folhas devem ser envolvidos em algodão ou papel umedecido e
colocados em sacos de polietileno.
2- Raízes devem ser arrancadas com blocos de terra e colocados em saco de
polietileno.
3- Plantas anuais, as amostras são colhidas até 0,30 m de profundidade.
RECOMENDAÇÕES PARA COLETA DE MATERIAL PARA ANÁLISE DE NEMATÓIDES
4. Levantamento de área, coleta-se um grande número de pequenas amostras
de vários locais do campo.
5. Amostras de solo seco, antes de serem examinadas, devem ser umedecidas
e deixadas em repouso por vários dias para os nematóides reiniciem seus
ciclos de vida.
6. Anote todos os dados importantes, tais como: localidade, data, coletor,
sintomas, extensão, distribuição, etc.
7. Amostras devem ser mantidas de forma que os nematóides não sofram
excesso de aquecimento ou desidratação até a chegada ao laboratório.