Aula 2

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ALI 274 – Biotecnologia
Aula 2
Professor: Alexandre Fontes Pereira
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Velocidade específica:
CLASSIFICAÇÃO PROPOSTA POR GADEN
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CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
Descontínuo
Contínuo
Descontínuo alimentado e Semicontínuo são formas desenvolvidas a partir das formas básicas com o objetivo de contornar problemas inerentes a estes processos.
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CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
 As diferenças entre as formas de operação podem ser bem entendidas em relação a variação do volume do cultivo, da massa total e das concentrações de células, substrato e produto em função to tempo.
 As diferenças são caracterizadas principalmente pelas diferentes formas de adição do substrato e dos nutrientes. 
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Características principais:
Todos os nutrientes são adicionados ao biorreator antes do início do processo, exceto O2, e outros produtos químicos necessários para controle de pH e espuma.
O volume no decorrer da fermentação permanece constante.
 Processo Descontínuo
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo
Modo de operação:
» No instante inicial o meio de fermentação é inoculado e incubado em condições adequadas;
» No decorrer da fermentação nada é adicionado, exceto oxigênio (ar), antiespumante, ácido e base para controle de pH; 
» Terminada a fermentação descarrega-se o meio fermentado;
»O fermentador é então lavado, carregado novamente e iniciado outro processo.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo
Modo de operação:
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
 Processo Descontínuo
Vantagens: 
» Apresenta menor risco de contaminação (comparado ao contínuo);
» Grande flexibilidade de operação, podendo-se usar os fermentadores para a fabricação de diferentes produtos;
» Condições de controle mais estreitas da estabilidade genética dos microrganismos.
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 Processo Descontínuo
Desvantagens:
» Se o substrato exercer efeito de inibição, poderá ocorrer baixos rendimentos e/ou produtividades.
» Apresenta “tempo morto”, tempo em que o fermentador não está sendo usado no processo fermentativo propriamente dito, como tempo de carga, descarga e lavagem. 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo
Aplicações:
» É o mais utilizado na indústria de alimentos e bebidas, como: iogurte, cerveja, vinho, picles, chucrute, etc.
» Permite o conhecimento básico da cinética de fermentação, para que se possa propor alternativas de condução de processo.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo
Tipos de inóculo usados em processos descontínuos: 
» Com um único inóculo por fermentação;
» Com reaproveitamento de células para o inóculo;
» Com inóculo por sistema de corte.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo
Com um único inóculo por fermentação: 
» Propagado a partir de uma cultura pura.
» Oferece poucos riscos de contaminação.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo
Com reaproveitamento de inóculo: 
» É utilizado como inóculo as células da fermentação anterior.
(para isso pode-se utilizar parte do meio de fermentação ainda homogêneo, esperar que o microrganismo sedimente no fermentador ou ainda centrifugar o meio fermentado).
» Há uma tendência em aumentar o número de contaminação a cada fermentação.
» Técnica comum em destilaria de álcool.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo
Com reaproveitamento de células para inóculo: 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo
Com inóculo por sistema de corte:
» O “corte” pode ser feito na fase exponencial, quando deseja-se propagar inóculo, ou após o fim da fermentação.
»Inocula-se uma dorna, quando é atingido um estágio apropriado de fermentação, passa-se parte do conteúdo para uma dorna vazia, em seguida enche-se as duas dornas com meio. 
» Pode levar a sérias quedas de rendimento.
» O controle do rendimento pode indicar quando deve-se interromper os cortes e iniciar nova fermentação com novo inóculo.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo
Com inóculo por sistema de corte:
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo Alimentado
 É definido como um modo de operação no qual um ou mais nutrientes (incluindo substrato), ou mesmo todos os nutrientes são adicionados gradualmente durante o processo de fermentação e os produtos formados permanecem no meio até o tempo final. 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo Alimentado
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo Alimentado
- Com reaproveitamento de células.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo Alimentado
Características principais:
» O volume varia durante o decorrer da fermentação (embora possa ser pequena variação em alguns casos);
» A vazão de alimentação pode ser constante ou variar com o tempo, e a adição de mosto pode ser contínua ou intermitente.
» É possível controlar a concentração de substrato na fermentação (podendo assim interferir no metabolismo microbiano, levando a diferentes perfis de concentração não só de substrato, mas também de células e produto). 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Descontínuo Alimentado
Aplicações:
» Minimiza a repressão catabólica. 
 Minimização dos efeitos do controle do metabolismo celular
(Exemplos: produção de determinados antibióticos como neomicina, estreptomicina, bacitracina, sofrem repressão pela presença de glicose em concentrações mais elevadas) 
» Prevenção da inibição por substrato.
 Evita que elevadas concentrações de substrato causem inibições da fermentação.
(Exemplos: concentração de glicose superiores a 100 g/L podem causar inibição em fermentação alcoólica com Saccharomyces cerevisiae). 
» Minimização da formação de produtos metabólicos tóxicos.
 (Exemplos: para E. coli, fonte de carbono em excesso, mesmo em aerobiose, levam a formação de ácido acético, inibidor do crescimento). 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Semicontínuo
 O processo de fermentação é chamado semicontínuo quando, uma vez colocado no fermentador o meio e o inóculo, as operações que se seguem obedecerem à seguinte ordem:
1º - Aguarda-se o término da fermentação;
2º - Retira-se parte do meio fermentado, mantendo-se no fermentador o restante do mosto;
3º - Adiciona-se ao fermentador um volume de mosto igual ao volume de meio fermentado retirado;
4º - Repete-se esta sequência. 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Semicontínuo
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Semicontínuo
Características principais:
» O meio fermentado não retirado do reator serve de inóculo para a próxima fermentação.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Semicontínuo
 No sistema Semicontínuo é utilizado como inóculo as células da fermentação anterior que podem ser uma fração homogênea do meio ou mesmo células separadas por sedimentação.
 Um exemplo deste processo é o Melle-Boinot, usado em fermentações alcoólicas. 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Semicontínuo
 Vantagens:
Possibilidade de operar o fermentador por longos períodos (às vezes alguns meses) sem que seja necessário preparar um novo inóculo.
 Possibilidade de aumentar a produtividade do reator apenas modificando a forma de operação.
Ex: processo de fermentação de cacau.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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CRESCIMENTO
Crescimento Populacional: é definido como o aumento do número, ou da massa microbiana.
 Taxa de crescimento: é a variação no número ou massa de microrganismos por unidade de tempo.
Tempo de geração: é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique. O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de geração não corresponde a um parâmetro absoluto, uma vez que é dependente de fatores genéticos e nutricionais, indicando o estado fisiológico da cultura. 
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MEDIDA DE CRESCIMENTO
O crescimento de uma população microbiana em meio líquido pode ser determinado de várias formas:
Determinação do peso seco ou úmido;
Determinação química de componentes celulares
Turbidimetria
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MEDIDA DE CRESCIMENTO
Determinação do peso seco ou úmido
Peso úmido
Falha
Peso seco
Constitui o processo básico de medida de massa 
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MEDIDA DE CRESCIMENTO
Determinação química de componentes celulares
É possível calcular a massa microbiana pela dosagem de certos componentes celulares, como proteínas e ácidos nucléicos
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MEDIDA DE CRESCIMENTO
Turbidimetria
Fonte
 de luz
Filtro
Amostra
contendo
células
microbianas
Detector
sensível
á luz
Leitura dos
resultados 
em absorbância
ou transmitância
no
espectrofotômetro
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MEDIDA DE CRESCIMENTO
O número de organismos presentes numa suspensão também pode ser determinado, havendo para isso dois métodos principais:
Contagem do número total de indivíduos
Contagem do microrganismos viáveis
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MEDIDA DE CRESCIMENTO
Contagem do número total de indivíduos
 
Câmara de Neubauer
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MEDIDA DE CRESCIMENTO
Contagem do número total de indivíduos
Câmara de Neubauer
Ao microscópio – aumento de 100X
Ao microscópio – aumento de 400X
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MEDIDA DE CRESCIMENTO
Contagem do microrganismos viáveis
Superfície
Pour plate
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Contagem dos viáveis utilizando a
técnica das diluições em série
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CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO
a – Fase lag
b – Fase log
c – Fase estácionária
d – Fase de morte celular
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CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO
Fases da curva de crescimento
Fase lag: processo de divisão pouco ou ausente; adaptação das células ao meio.
Fase log: alto processo de divisão; crescimento exponencial; absorção de nutrientes do meio; produção de metabólitos (toxinas).
Fase estacionária: diminuição da velocidade de divisão bacteriana; diminuição da atividade metabólica; tiram nutrientes das células mortas; acúmulo de substâncias tóxicas; esporulação.
Fase de morte celular: número de células mortas excede o número de células vivas.
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FATORES QUE INFLUENCIAM NO CRESCIMENTO
Influência dos fatores físicos
Temperatura
pH
Pressão osmótica
Influência dos fatores químicos
Oxigênio 
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FATORES QUE INFLUENCIAM NO CRESCIMENTO
Influência dos fatores físicos
Temperatura:
Temperatura de crescimento:
Mínima (menor temperatura onde é capaz de crescer)
Ótima (onde apresenta melhor crescimento)
Máxima (mais alta temperatura para crescer)
Classificação primária:
Psicrófilos – crescem em temperaturas baixas (-10° – 20°C )
Psicotróficos - temperatura de refrigeração (0° – 30°C)
Mesófilos – crescem em temperaturas moderadas (10° – 50°C)
Termófilos – crescem em temperaturas altas (40° – 70°C)
Termófilos extremos ou hipertermófilos (ótima em > 80°C)
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FATORES QUE INFLUENCIAM NO CRESCIMENTO
Influência dos fatores físicos
Classificação microbiana - Temperatura
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FATORES QUE INFLUENCIAM NO CRESCIMENTO
Influência dos fatores físicos
pH
Ideal para bactérias: 
faixa da neutralidade (6,5 – 7,5) - Neutrófilas
Exceção: 
Acidófilas – pH 0,5 a 6,0 (com ótimo entre 2 e 3,5) 
Ex.: bactéria quimioautotrófica – oxida S pra formar ácido sulfúrico – pH 1,0
Alcalófilos – pH acima de 7,0 
Ex.: Bacillus e Archaea
Fungos filamentosos e leveduras: 
São tolerantes a maior variação de pH
Ótimo na faixa de 5 - 6
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FATORES QUE INFLUENCIAM NO CRESCIMENTO
Influência dos fatores físicos
Pressão osmótica
Osmose Plasmólise
Conservação dos alimentos com sal ou açúcar
Classificação:
Halofílicas extremas
Halofílicas obrigatórias
Halofílicas facultativas
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FATORES QUE INFLUENCIAM NO CRESCIMENTO
Influência dos fatores químicos
Oxigênio
Aeróbios estritos ou obrigatórios
Anaeróbios facultativos
Anaeróbios obrigatórios
Anaeróbios aerotolerantes
Microaerófilas 
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CONTROLE DOS MICRORGANISMOS PELA AÇÃO DOS AGENTES FÍSICOS
Temperatura
Pode ser empregado de duas maneiras:
Seco: age promovendo uma oxidação violenta de componentes do protoplasma. 160 a 180 °C durante um tempo mínimo de uma ou duas horas.
Úmido: age promovendo a desnaturação de proteínas e dissolução de lipídeos, o que também contribui para intensificar o primeiro efeito. A temperatura de 60 °C por uma hora é suficiente para matar formas vegetativas
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CONTROLE DOS MICRORGANISMOS PELA AÇÃO DOS AGENTES FÍSICOS
Radiação
Dois tipos:
Radiações UV: principalmente as de comprimento de onda entre 240 e 280 nm, são absorvidas pelas purinas e piridinas dos ácidos nucléicos, provocando mutações.
Radiações ionizantes: atinge os átomos, por isso são mais eficientes.
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CONTROLE DOS MICRORGANISMOS PELA AÇÃO DOS AGENTES FÍSICOS
Filtração
A passagem de soluções ou gases através de filtros de poros suficientemente pequenos que retêm microrganismos pode ser empregada na remoção de bactérias e fungos, deixando entretanto passar a maioria dos vírus.
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CONTROLE DOS MICRORGANISMOS PELA AÇÃO DOS AGENTES FÍSICOS
Vibrações Sônicas
Muitos microrganismos são sensíveis a vibrações ultra-sônicas, sendo destruídos por lise e extravasamento do conteúdo celular.
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CONTROLE DOS MICRORGANISMOS PELA AÇÃO DOS AGENTES QUÍMICOS
São classificados em dois grandes grupos:
Desinfetantes: 
São substâncias que agem diretamente sobre estruturas microbianas, causando a morte do microrganismo.
Principais estruturas e moléculas alvo: membrana citoplasmática, proteínas enzimáticas ou estruturais.
Mecanismo de ação: oxidantes, desnaturantes, etc
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CONTROLE DOS MICRORGANISMOS PELA AÇÃO DOS AGENTES QUÍMICOS
Principais grupis de agentes químicos
Álcoois: etílico, isopropílico, propilenoglicol, etilenoglicol
Aldeídos: fórmico (formol), glutárico
Fenóis: fenol, cresol, timol, clorocresol, cloroxilenol
Ácidos orgânicos: acético, láctico, benzóico, capróico
Halogênios: iodo, cloro, ácido hipocloroso, cloraminas, hipoclorito
Metais pesados: sais de mercúrio, prata, cobre, zinco
Agentes oxidantes: água oxigenada, permanganato de potássio
Agentes de superfície: cloreto de benzalcônico, cloreto de benzetônio, cloreto de cetil-piridineo, clorohexidina
Gases: óxido de etileno, óxido de propileno, beta-propil-lactona, dióxido de cloro, ozona.
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 Processo Contínuo
 O processo de fermentação contínua caracteriza-se por possuir uma alimentação constante de meio de cultura com uma determinada vazão (constante), sendo o volume de meio no reator, mantido inalterado através da retirada contínua de caldo fermentado. 
 Pode ser operado por longos períodos de tempo em estado estacionário.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Contínuo
Vantagens em relação ao descontínuo:
» Aumento da produtividade do processo;
» Manutenção das células em um mesmo estado fisiológico;
» Maior uniformidade do processo;
» Possibilidade de associação com outras operações contínuas na linha de produção;
» Menor necessidade de mão-de-obra.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Contínuo
Desvantagens em relação ao descontínuo:
» Maior investimento inicial;
» Possibilidade de ocorrência de mutação genética espontânea (com consequente queda da produtividade);
» Maior possibilidade de contaminação;
» Dificuldade de manutenção da homogeneidade;
» Dificuldade de operação em estado estacionário em determinados processos.
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Contínuo
Aplicações:
A utilização do processo contínuo de fermentação encontra grandes aplicações práticas, como: fermentação alcoólica, tratamento de resíduos. 
 Estes casos citados são processos não assépticos.
 Em processos em que se necessita de maior assepsia, como produção de enzimas e antibióticos, o processo contínuo encontra ainda aplicações restritas. 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Contínuo
Formas de operação no sistema contínuo:
A operação inicia-se como um processo descontínuo e a partir de um dado momento inicia-se a alimentação de nutrientes e a retirada de meio fermentado.
 Após um tempo o sistema convergirá ao estado estacionário.
O sistema contínuo é extremamente versátil quanto as suas várias possibilidades de operação, tais como:
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Contínuo
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Contínuo
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Contínuo
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Contínuo
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Contínuo
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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 Processo Contínuo
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SUA CONDUÇÃO
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