aula 3 Cromatografia de interação hidrofóbica

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Aula 3- Cromatografia de interação hidrofóbica
A proteína está la dentro da amostra, o próximo passo é a lavagem(com o mesmo tampão de equilíbrio) que irá remover as proteínas que não foram adsorvidas, os contaminantes e não queremos que nossa proteína alvo saia nessa lavagem. Nesse gráfico também, temos essa linha da concentração de sal, que é decrescente, ou seja as moléculas de água que antes tinha muita liberdade, ela vão ter que voltar para os resíduos hidrofóbicos. Depois da lavagem nós vamos eluir, 1) podemos adicionar um solvente apolar, mas é a ultima opção, porque ele pode interagir com a proteína alvo, 2) podemos mudar o pH, mas que também não é eficiente,pois pode ter um caráter hidrofílico maior que o hidrofóbico, e vai conseguir eluir, mas nem sempre funciona 3)pode também aumentar a temperatura, que vai diminuir a energia livre do sistema que é favorável para o sistema mas para adsorver, mas não é usado portanto porque tem o risco de desnaturar a proteína, assim como a diminuição da temperatura(vai aumentar a energia livre do sistema,), faz eluir, e 4) a melhor opção é diminuir a concentração de sal (moléculas de água hidratam região apolar da proteína e do ligante), pois vai diminuir a entropia do sistema(porque as moléculas de água vão ter que voltar para os resíduos hidrofóbicos), aumentando a energia livre do sistema. Muito sal, água hidrata os íons de sal, pois agora as ligações que mantiam a proteína adsorvida vão ser rompidas, e as proteínas então vão migrar para fase aquosa e ser eluidas. Na adsorver então, aumentamos a concentração de sal, no tampão e na amostra. O sulfato de amônio poderia ser utilizado, pois um sal utilizado na adsorção tem que ser solúvel; não pode reagir com a resina; não pode desnaturar a proteína (como os cátions divalente, vão no sitio ativo e interagem); ter alto poder de hidratação, e o sulfato de amônio apresenta essas características.
Detalhes da cromatografia, então nós vamos aplicar nossa amostra em uma alta concentração de sal, e as moléculas de água vão competir. Na figura temos a resina, de vermelho, e de amarelo a região do grupo ligante apolar, antes tínhamos moléculas de água ao redor desses grupos e a medida que vamos adicionando sal, as moléculas de água se deslocam para hidratar esses íons e nos vamos favorecer a parte apolar da proteína e do ligante. Se o fluxo for muito elevado, a proteína vai passar direto, porque ela tem que ta orientada corretamente, por isso o fluxo deve ser adequado. Depois na hora de eluir, vamos diminuir a concentração de sal e as moléculas de água vão voltar a hidratar esses ligantes e a proteína vai ser eluida. Na figura podemos observar que um ligante mudou a orientação, então adicionou algum tipo de substância, tipo detergente, que vai fazer com que o ligante mude a conformação e a proteína vai ser eluída, nesse tipo depois tem que voltar o ligante para a conformação para a resina ser utilizada novamente. 
Na troca iônica as proteínas são separadas pela diferença de hidrofobicidade, ou seja, de acordo com a carga e o ponto isoelétrico da proteína, já aqui nesse cromatografia a proteína vai ligar pela hidrofobicidade, se a hidrofobicidade da molécula alvo e dos contaminantes forem a mesma essa cromatografia não é recomendada. 
O que vai manter as proteínas adsorvidas na coluna são as interações hidrofóbicas, que na maioria das vezes que estão presentes são as ligações de van der Waals, podem ter também as interações aromáticas, quando a parte apolar da proteína é aromático e se os nossos ligantes também forem. 
Uma forma de favorecer a adsorção é utilizando pH neutro (mais próximo possível do ponto isoelétrico da proteína, desde que a proteína seja estável nele). A presença de solutos orgânicos, a temperatura e o pH podem afetar a estrutura da proteína, então se muda a estrutura da proteína, a gente pode ou não favorecer a interação dela com os ligantes, por exemplo, quando muda a temperatura, a estrutura terciária da proteína também pode mudar e o número de resíduos apolares podem diminuir ou aumentar, mudando a adsorção ou eluição, mas normalmente não trabalha com isso pois mudar a estrutura terciaria e não conseguir voltar, pode perder sua atividade enzimática. 
Um desenho mostrando a adsorção da proteína, em alta concentração de sal sempre vai favorecer a adsorção(favorece as ligações hidrofóbicas) e em baixa concentração(diminui as ligações hidrofóbicas) vai favorecer a eluição.
As interações hidrofóbicas em um tampão com baixa força iônica é mínima, para aumentar a adsorção(aumentar as interações hidrofóbicas) tem que ter alta força iônica, usando um sal. A concentração de sal tem que ser menor que a proteína precipita, para cada amostra,porque senão a proteína em vez de ligar ao ligante vai ligar uma com a outra dentro da resina e vai entupir a coluna. O sulfato de amônio utiliza 1M (o máximo é 4,00M em água e com 2M (50%) precipita, então usa uma concentração menor que 2). Com 1M teve dificuldade para eluir, a proteína está fortemente adsorvida na resina, muita interação, então para diminuí-las, diminuiu a concentração de sal presente no tampão de adsorção ou adiciona álcool que seja solúvel no tampão, ou seja, vai colocar uma concentração menor que 1M de sulfato de amônio, com menor força iônica.
Aparentemente quando diminuiu o pH, aumenta as interações hidrofóbicas, favorecendo a adsorção, então se sua proteína não adsorveu a coluna em um pH 8, você pode diminui-lo para 7 e tentar melhorar a adsorção da proteína na coluna. Por outro lado, quando aumentamos o pH a proteína fica com mais resíduos hidrofílicos, então é mais fácil para eluir. Se a proteína tem carga, favorece a eluição. Usa então, um tampão com pH maior que 8. Dúvida: onde o pH interfere na proteína? Resposta: a proteína é formada por aminoácidos, temos vários tipos de aminoácidos em relação a carga dos grupos R, ácidos e básicos, apolar e polar sem carga, as células sintetizam as proteínas e elas tem uma etapa de enovelamento, onde a proteína vai dobrar onde tenha uma menor energia livre possível, que seja mais favorável termodinamicamente. Durante esse enovelamento da proteína, como ela está em um ambiente aquoso, os resíduos apolares ficam voltados pra cavidade da proteína e vai ter também resíduo apolar que vai estar voltado pra parte externa, em contato com a água, e os resíduos hidrofílicos vão ser enovelados com que o máximo de números de resíduos tenha contato com a solução aquosa. Se esses residos hidrofílicos, ácidos e básicos, tem como características, os ácidos tem um grupo carboxila a mais e os básicos tem um NH2 a mais. Esse carboxila e esse grupo amina dependendo do pH, o grupo carboxila pode estar desprotonado, tendo uma carga negativa e o grupo amina pode estar protonado tendo uma carga positiva, então quando a gente muda o pH, a gente favorece a mudança de carga da proteína de acordo com os resíduos laterais (grupo R), se tem resíduos muito básicos (NH2), e colocamos em um pH muito ácido, esses resíduos vão estar protonados, carga positiva, se a gente pega uma proteína de caráter ácido (grupo carboxila) e coloca em um pH básico, esses grupos vão estar desprotonados, carga negativa, e ai quando ela tem carga positiva ou negativa, vai ter o caráter hidrofílico maior que o hidrobófico, por isso que o pH é importante nessa cromatografia quanto na de troca iônica. Alguns macetes: se a proteína não dissolve em pH neutro, a gente pode diminuir o pH para ver se melhora a adsorção da proteína. 
A força de Van der Waals é a principal força que mantém a interação de ligação da proteína-alvo com o ligante. E quando aumenta a temperatura, aumenta a força de Van der Waals, mas normalmente não aumenta a temperatura pelo risco de desnaturação. Quando a proteína está adsorvida muito fortemente a resina, a gente pode utilizar álcool no tampão, que seja solúvel. Podemos utilizar detergentes também, a parte apolar vai competir com o ligante e proteína e a parte polar vai recrutar as moléculas de água, quando adicionamos detergentes,temos uma cromatografia mista,troca iônica e interação hidrofóbica ao mesmo tempo. Pois a parte apolar liga no ligante e a parte polar vai estar disponíveis para ligar a outras moléculas, por isso não utilizamos detergentes iônicos, que tem cargas, os detergentes que utilizamos são os não iônicos, sem carga, que tem uma parte polar, mas ela não tem carga, para diminuir a possibilidade de ter uma cromatografia mista.
Fatores que vão interferir na cromatografia hidrofóbica:
Tipo de adsorvente (resina): tipo de polímeros hidrofílico(celulose) ou hidrofóbico (sintético), vai ter maior caráter hidrofóbico, nesse adsorvente coloca um grupo hidrofóbico, a resina puxa esse grupo e vai ter uma caráter hidrofóbico maior, tendo maior força na adsorção e na hora da eluição vai ter mais trabalho.
Tipo de ligante: normalmente vamos ter ligantes com quatro cadeias de carbonos (butil), com 6 cadeias de carbono (hexil) e com 8 cadeias de carbono. São alcanos, de cadeia linear. Podemos ter ligantes com resíduos aromáticos também. temos dois gráficos, no primeiro temos 3 tipos de ligantes e no segundo gráfico, temos graus de substituição, que significa que temos 10 mM de ligante por mL de gel, em um 1mL de resina tem 10mM de ligante. E a outra possibilidade é em 1mL de resina tem, 20mMde ligante, isso significa que essa resina tem uma densidade maior que a que tem 10mM de ligante. Se observarmos os dois gráficos, podemos observar quanto ao comprimento da cadeia do ligante, que quanto maior a cadeia, maior a capacidade de ligação de proteína nessa coluna (favorece a interação hidrofóbica). Então o tipo de ligante que vamos utilizar depende da proteína, pois se ela for muito hidrofóbica a gente não quer que essa proteína interaja fortemente com o ligante, porque vai ser mais difícil para eluir, então vamos escolher um ligante de cadeia menor, se a proteína for pouco hidrofóbica, então a gente tem que favorecer o máximo de interação hidrofóbica, então o ligante vai ser o de cadeia maior. E o grau de substituição é fácil, quanto maior o grau de ligantes, maior a capacidade de ligação de proteínas na resina, mas chega uma hora que não adianta mais aumentar esse grau, porque a capacidade de ligação da resina vai estacionar devido aos impedimento estérico, vai ter muito ligante que a proteína nem vai ver alguns. Diferentes tipos de ligantes que podemos ter:
- fenil: tem 2 tipos interações molecular, que vão manter a proteína adsorvida na resina, hidrofóbicas e aromáticas. Quando a cadeia é linear, vamos ter apenas as interações hidrofóbicas. 
-butil. o butil tem massa molar de 54Da e a massa da proteína é geralmente 50kDa, quase mil vezes maior então que o ligante. Como a parte apolar da proteína vai encontrar esse ligante, não é fácil. Então esse grupo vai estar ligado lá na resina e a proteína tem que passar e encontrar esse grupo pequeno que ta ligado na resina para formar a interação hidrofóbico, estástica e quimicamente isso não é possível, então alguma coisa vai ter que ajudar a proteína encontrar esse grupo, vai ter que deixar o ligante mais visível para a proteína, usando então o braço espaçador, que fica entre o grupo ligante e a resina, que pode ser um alcano, que tem como única função fazer esse grupo ligante ficar disponível.
A resina tem que ter as mesmas características que a da cromatografia de troca iônica. Ela não poder reagir nem química, nem fisicamente com o ligante, tem que ter estabilidade química, para poder trabalhar com tampão com diferentes pH, sal e ter estabilidade física para não deformar sob um fluxo maior.
Temos esse quadro aqui, que já vimos na precipitação com sulfato de amônio, que tem os aniôns e cátions que podemos utilizar para promover a adsorção da proteína na resina. Os melhores anions são os fosfatos e sulfatos e os melhores cátions é o amônio, rubídio, potássio e sódio, normalmente os mais utilizados amônio e sódio. 
Tipo e concentração de sal: vamos utilizar uma concentração que não vai precipitar qualquer proteína na amostra, porque se qualquer proteína precipitar dentro da coluna, o fluxo vai diminuir e pode deformar a coluna, até entupir (que a pressão está tão grande que anda passa por ela). E a concentração de sal tem que favorecer ao máximo a adsorção da proteína. O sal mais utilizado é o sulfato de sódio, potássio , de amônio.
Na figura podemos observar a influência da concentração de sal na capacidade de ligação da resina. Então temos duas proteínas, a RNAse e α-chymotrypsinogen, em diferentes concentrações de sal. A proteína que precisa de menor concentração de sal para adsorver na resina, é a α-chymotrypsinogen, pois tem um maior caráter hidrofóbico. 
As etapas dessa cromatografia são as mesmas que da cromatografia de troca iônica, na figura do cromatograma, primeiro equilibrou a coluna, lavou a coluna com 5 a 10 volumes de tampão de equilíbrio, depois aplicou a amostra, diminuiu a força iônica do tampão, utilizamos outro tampão então sem sal, e depois temos uma diluição por gradiente linear, que começou com 100% do tampão A e 0% do tampão do B e no final tem 100% do tampão B e 0% do tampão A, mas na curva apresentada no cromatograma a curva está decrescente porque ela não estão mostrando a concentração do tampão B, apenas a concentração de sal. Se tivesse no eixo a concentração do tampão B e ele não tivesse sal, a curva seria crescente. Continuando a cromatografia, a gente lava para retirar as impuresas e depois começa a eluição, diminuindo a concentração de sal, que primeiro vão ser eluidas as proteínas que ficaram adsorvidas fracamente, ou que não adsorveram e depois elui as proteínas que interagiram mais fortemente com a resina. Depois da eluição, precisamos fazer a regeneração da nossa resina, passamos outro tampão para retirar os contaminantes que foram não foram eluidos durante a eluição, por estarem interagidos fortemente na resina. Na adsorção, podemos adicionar 1M(molar) de sal e na eluição vamos diminuir a concentração desse sal. Quando adicionamos 1M de sulfato de amônio e a proteína não adsorveu, olha as características da resina ( resina de 4 carbonos para uma resina 6 ou 8 carbonos; se tem 8 carbonos, pode diminuir o pH ou aumentar a concentração de sal, desde que esse aumento não leve a precipitação da proteína). Diminuir a cadeia do ligante quando não elui, pois está usando o menor ligante (4C) e está fortemente adsorvida, aumentando a concentração de sal e diminuir a cadeia do ligante. E se a gente já está utilizando o menor ligante, por exemplo uma coluna em que o ligante é o menos hidrofóbico (4 carbonos) e mesmo assim na hora e eluir temos que adicionar um solvente porque a proteína ficou ligada fortemente na resina, podemos aumentar o pH para proteína ficar mais hidrofílica, mas pH tem que levar muito cuidado, porque pode levar a desnaturação, então o método mais eficaz é diminuir a concentração de sal.
pH
temperatura