Aula 05 P2 Cromatografia de afinidade

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Esses ligantes tem que ter algumas características. Ele tem que ter uma região pra gente acoplar a resina e a outra região tem que ficar livre pra interagir com a molécula alvo. Se essas regiões forem iguais, se na hora do acoplamento a gente não conseguir direcionar pra acopla na posição adequada, o ligante vai fica acoplado, mas não vai ligar a proteína pq é justamente o sítio de ligação da proteína que foi acoplado na resina.
Critérios para escolha do ligante:
Ligação específica e reversível: Por exemplo, temos as proteínas que degradam proteínas, que são as proteases, então dentre as proteases temos a tripsina e quimiotripsina. Tem ligante que não é seletivo, mas é específico para protease. Ele liga diferentes tipos de protease. Imagina que queremos purificar a tripsina, esse ligante não vai adiantar pq ele é específico pra protease, mas ele não é específico pra tripsina. Nesse caso temos que escolher um ligante que consiga diferenciar em todas a proteases presentes apenas a tripsina. Em outros momentos isso não importa pra gente, então podemos escolher um ligante que liga todo tipo de protease. Vai depender muito do que a gente quer.
Tem que ter alto grau de pureza: Por exemplo, temos como ligante a tripsina, se vc acoplar só tripsina na sua coluna, vc vai aplicar massa maior de tripsina, mas se vc acoplar contaminantes a sua coluna, vamos perder capacidade de adsorção e se esses contaminantes ligarem em outros contaminantes presentes na amostra vai dar tudo errado, então o ligante tem que ser puro pra gente ter uma boa capacidade adsortiva.
Braço espaçador: 
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Orientação do ligante:
Se o ligante que vai ficar acoplado a resina não estiver numa orientação certa, a proteína não vai ligar. Quando o ligante está orientado numa orientação correta, a proteína vem e a gente forma a interação sítio-específica do ligante e a proteína. Quando a orientação do ligante é errada, a proteína pode interagir fracamente ou se essa orientação for muito errada, por exemplo invertida, a proteína nem vai interagir. Então quando o ligante está sendo acoplado a proteína temos que garantir que ele vai ser acoplado na orientação correta pra que a proteína interaja de forma adequada com esse ligante.
A gente pode proteger o sítio ativo da proteína antes de imobilizá-la pra poder ter essa interação da orientação correta, mas isso não é 100%. Podemos tentar mudar o ph, proteger um grupo químico que pode se ligar no sítio ativo pra tentar melhorar a orientação do ligante, mas aí a gente vai lembrar que nunca numa reação química a gente consegue ter 100%. 
Então a orientação do ligante vai ser importante pra que consigamos ter o máximo de adsorção por mL de resina. 
Formas para melhorar capacidade de adsorção da resina:
Garantir a pureza do ligante, pq se não os contaminantes são adsorvidos e a coluna perde capacidade de adsorção. 
Aumento da concentração do ligante: A gente pode usar uma solução contendo uma quantidade maior de ligante, mas não podemos pensar que se eu aumento o número de ligantes eu melhoro capacidade adsortiva. Se colocamos muito ligante pode acontecer impedimento estérico. Pq a gente vai ter um número tão grande de ligantes que a proteína que vai ligar 1 pode cobrir 2 ou 3. Nós até conseguimos acoplar muitos ligantes, mas a capacidade adsortiva da coluna não vai melhorar, uma vez que tem ligantes que estão impedidos estericamente. 
Trabalhar com diferentes phs, diferentes temperaturas, diferentes tempo de contato pra favorecer adsorção da molécula de interesse na resina. Quando aumentamos o tempo de contato, a amostra vai ficar mais tempo na coluna, aumentando a probabilidade da amostra encontrar um ligante orientado adequadamente. Com o ph conseguimos mudar a carga das proteínas e as vezes a gente precisa que a proteína tenha um caráter hidrofílico maior ou menor para interagir com o ligante. Então mudando o ph conseguimos melhorar ou piorar a capacidade adsortiva da coluna.
O braço espaçador é feito de diferentes substâncias. Se o meu ligante é por exemplo um carboidrato, eu tenho que usar um braço espaçador que tenha na ponta que vai ligar com um ligante um grupo químico que interaja com hidroxila ou outro grupo desses açúcares. Então podemos ter epóxi, grupo carboxila e grupo amina. O grupo espaçador poder ser um hidrocarboneto. 
Quando é proteína nosso raciocínio vai ser o mesmo, só que o que vai ficar na ponta pra reagir com a proteína que é o nosso ligante tem que ser um grupo que tenha afinidade ou por amina ou por carboxila. Então pode ser também o epóxi, carboxila, amina ou grupos que são iguais. Serve tanto pra usar pra imobilizar ligantes que são carboidratos e também proteína.
Exemplos de ligante:
Qual ligante escolher pra purificar a molécula alvo? Por exemplo, se quero purificar a invertase usando cromatografia de afinidade, o que vamos usar como ligante vai depender das características da invertase. Então devemos pensar com quem a invertase tem afinidade, quem é o substrato da invertase? Sabemos que o substrato da invertase é a sacarose, mas não podemos imobilizar a sacarose numa resina por ela ser considerada uma molécula pequena. Então podemos usar como ligante um cofator ou fazer um ligante químico ou anticorpo, no caso anti-invertase e aí imobilizamos esse anticorpo.
Exemplo Arginina: Tem como ligante a timina, então a timina está imobilizada e nesse caso existe um braço espaçador. Como a Arginina é um aminoácido, uma molécula bem pequena, faz necessário o uso de um braço espaçador. 
Nem sempre o braço espaçador é necessário. Quando vamos imobilizar um anticorpo ou uma proteína não se usa braço espaçador devido ao tamanho maior dessas moléculas. Nesse caso podemos acoplar direto esse anticorpo ou essa proteína. Então só precisamos de um braço espaçador quando meu ligante for pequeno, por exemplo, uma arginina. 
O que podemos inferir com esses dados?
Que a cada vez que adicionar mais proteína, mais proteína vai ficando adsorvida. Chega um momento que podemos continuar adicionando cada vez mais proteína que vai ficar constante a quantidade de proteína adsorvida.
Isso acontece pq já ocupou todos os ligantes, saturou a coluna.
Isso é importante porque as vezes quando estamos fazendo o processo pela primeira vez e não sabemos qual a massa de proteína alvo eu a gente vai aplicar. Então com a curva já sabemos que o máximo que vamos aplicar é 60 ou 70 mg pra garantir que vai estar saturado. 60 ou 70mg de molécula alvo e não de proteína total. Aí precisamos saber a pureza da nossa proteína alvo na nossa amostra pra saber quantos mL de amostra iremos aplicar. Nessa cromatografia isso funciona bem pq como ela é específica só vai ligar a molécula alvo, agora se for uma cromatografia de troca iônica ou de interação hidrofóbica isso não funciona bem pq outras proteínas presentes na amostra que tem o mesmo caráter hidrofóbico ou parecido ou hidrofílico vai adsorver também. Então aí vamos perceber que saturou antes pq tem contaminante que adsorveu também.
Como que vamos fazer essa cromatografia? Se temos uma amostra a purificar pela cromatografia de afinidade a primeira coisa que vamos fazer é escolher o ligante. Aí tentamos escolher um ligante que já está acoplado, porque geralmente se gasta muito tempo fazendo isso. 
Obs.: Por exemplo, temos um anticorpo A, aí podemos escolher uma resina de agarose, existe resina de agarose que tem 4% de agarose e resina que tem 6%. Quanto maior a porcentagem de agarose menor são os poros da sua resina, aí nesse caso o melhor é escolher uma resina de 4% de agarose e macroporosa pq o anticorpo é uma molécula grande.
Condições de ligação e eluição (momento que vamos aplicar a amostra na nossa coluna):
Quando a gente vai aplicar a amostra na coluna temos que prestar atenção em alguns fatores:
Não podemos ter matéria particulada (sólido, por exemplo agregados proteicos). Temos que remover ou filtrando ou centrifugando. Se aplicarmos essas partículas na nossa coluna vai ser ruim, pq essas partículas insolúveis precipitadaspodem entupir nossa coluna fazendo haver um aumento de pressão durante o processo, esse aumento de pressão leva a deformação dos poros e acabamos perdendo a capacidade adsortiva da nossa resina.
A velocidade do fluxo pode interferir na eficiência da ligação (adsorção) da molécula alvo com o ligante. Pq a gente diminui o tempo de residência e se a molécula não estiver orientada adequadamente ela sai da coluna e não tem tempo nem da orientada adequadamente adsorver com o ligante.
O volume da amostra não afeta a separação. O que o livro quer dizer com isso? Quer dizer que o volume da amostra não afeta a capacidade adsortiva da resina, que você pode aplicar um volume de amostra grande na coluna que isso não vai interferir desde que a quantidade de molécula alvo presente na sua amostra esteja abaixo da capacidade de saturação da sua resina.
Vamos supor que não afetamos a capacidade adsortiva da resina, mas temos um volume de amostra muito grande. Então ficamos muito tempo passando a amostra. Nesse muito temos que ficamos passando a amostra se a constante de dissociação for pequena, já aplicamos a amostra e temos molécula alvo sendo eluida. Se a força que mantém seu ligante associado a molécula alvo for pequena, então a constante de dissociação é grande, então se for grande estamos aplicando a amostra e o ligante já está saindo da coluna. O volume dependendo da força que mantem a proteína adsorvida, pode interferir. Se a constante de dissociação é alta não vai interferir ao usar um volume maior, mas se a constante de dissociação for pequena é melhor usar volumes pequenos pra que no momento que tivermos aplicando a amostra nenhuma proteína seja eluida. 
Quando a força que mantém a proteína adsorvida no ligante é grande, podemos aplicar qualquer volume uma vez que essa força é uma força forte. Agora se essa força for fraca, a tendência é que com o tempo ela vai sendo desfeita as interações, então ela elui no momento da aplicação da amostra.
Durante a dissorção que é a etapa de aplicação de amostra temos que tomar cuidado com o tempo, com o tampão, com o ph.
Antes de aplicar a nossa amostra equilibramos a coluna de adsorção, esse equilíbrio serve pra deixar ela com tampão pq durante o equilíbrio queremos deixa o ligante na melhor conformação possível. Quando esse grupo ligante é de troca iônica queremos deixar esse grupo ligante com carga e remover todos os outros íons que estavam ali presentes, que possam inclusive levar a mudança de ph. E nesse caso queremos deixar o ligante na melhor conformação possível, então vamos aplicar o tampão com ph de força iônica pra facilitar adsorção, depois aplicamos a amostra, lavamos com o mesmo tampão de equilíbrio pra retira o excesso de amostra e retirar os contaminantes que estão ali adsorvidos fracamente ou que ainda não teve tempo de ser eluido da coluna. Só depois que a gente lavou a coluna que a gente vai eluir. Para eluir, primeiro vamos usar uma substância que também tenha afinidade com o ligante, vamos colocar essa substância que tem afinidade com o ligante, e como essa substância vai está presente em grande concentração, por competição ela vai remover a proteína. Uma outra forma é usar uma outra substância que também vai competir e que tenha afinidade pela proteína. Então podemos escolher um agente que vai competir com a proteína pelo ligante e um agente que vai competir com o ligante pela proteína. Essa substância está solúvel. Então quando aplicarmos essa substância na coluna, vai sair proteína e o competidor ( que vai competir pelo ligante). 
Então podemos eluir utilizando uma substância que vai competir pelo ligante, uma substância que liga o ligante e uma substância que liga a proteína. Podemos eluir a molécula alvo também mudando o ph. Pq quando mudamos o ph, mudamos também a carga da molécula. E quando mudamos a carga, interações eletrostáticas ou hidrofóbicas são rompidas e por fim elui. Então podemos eluir tanto mudando ph quanto mudando a força iônica para romper as interações entre a proteína e o ligante. Quando mudamos o ph, podemos mudar a também a conformação do ligante e da proteína. Essa mudança de conformação tem que ser branda, de forma que depois consigamos fazer a reversão. Então quando a gente usa uma substância que tenha afinidade pelo ligante e uma que tenha afinidade pela proteína chamamos de eluição específica pq nenhuma mudança vai ocorrer nem no ligante e nem no sítio ativo da proteína. Essas duas moléculas ligante e proteína vão permanecer intactas.
Quando mudamos o ph e a concentração iônica, mais o ph do que a concentração iônica, provocamos mudanças tanto no ligante quanto na proteína, só que essas mudanças tem que ser reversíveis. Se uso um ph onde essas mudanças são irreversíveis não posso eluir usando essa condição. Geralmente se usa ph ácido, em torno de 2, pra eluir uma proteína da coluna, mas imediatamente após a eluição da proteína na coluna a gente neutraliza pq se deixarmos um tempo muito grande, essa mudança passa a ser irreversível, aí a gente perde a proteína. Então quando a gente elui mudando o ph e força iônica chamamos de eluição não específica porque não é específica, só levou a alterações dessas interações fazendo com que molécula alvo fosse eluida.
Depois da eluição pode ser que alguma molécula interaja tão forte com o ligante que ela ainda não saiu, então vamos usar uma condição mais drástica pra retirar o que ainda permaneceu adsorvido na resina, que é o que chamamos de regeneração. Depois que regeneramos nossa coluna, fazemos com que o ligante volte a forma ativa dele e armazenamos essa coluna. Pra cada tipo de ligante tem uma solução certa que vamos utilizar para guardar essa coluna.