Resumo - Cromatografia de Afinidade

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Resumo - Cromatografia de Afinidade 
 Baseia-se nas propriedades biológicas ou funcionais das espécies que interagem (molécula 
 a ser separada e fase estacionária). O princípio da técnica é o isolamento seletivo de 
 macromoléculas biológicas, através da utilização das propriedades destas macromoléculas 
 de unirem-se reversivelmente a ligantes específicos. O ligante é imobilizado em uma 
 matriz porosa (insolúvel) e a molécula alvo é seletivamente adsorvida nesta ligante. Essa 
 técnica torna possível separar uma proteína a partir de uma mistura biológica complexa, 
 com base no reconhecimento e ligação da molécula-alvo às estruturas específicas do 
 ligante. 
 ● Princípio do método : Preparo da fase estacionária seletiva, por imobilização 
 covalente de ligantes específicos à matriz → Aplicação da amostra e interação entre 
 as espécies da amostra e ligante → Eliminação dos contaminantes adsorvidos com 
 ligações fracas, pouco específicas, por meio de lavagem → Alimentação de solução 
 tampão para adsorção de molécula com maior afinidade pelo ligante em 
 comparação à molécula-alvo e, consequentemente, eluição da molécula → 
 regeneração da coluna. 
 ● Características : Interação reversível entre molécula e ligante; Alta seletividade; 
 Separação de formas nativas de formas desnaturadas da mesma molécula; Alto 
 custo de execução e o uso desta técnica é recomendado após remoção ou redução 
 de contaminantes por métodos mais econômicos. 
 ● Seleção da Matriz: Não deve interagir com a molécula alvo, resistência mecânica e 
 química, possuir porosidade e fornecer alta resolução, podem ser inorgânicos, 
 polímeros orgânicos sintéticos ou polissacarídeos. 
 ● O agente de ligação cruzada aumenta a estabilidade da matriz; 
 ● Seleção do ligante: Agente que reconhece e se liga à molécula a ser purificada, 
 deve possuir ligação de afinidade específica e reversível com a molécula a ser 
 purificada. Devem ter grupos modificados que permitem a ligação com a matriz 
 porém sem perder sua atividade de ligamento com a molécula alvo. Os ligantes 
 podem ser corantes, polisscarídeos/polinucleotídeos e proteínas. 
 ● Preparação da fase estacionária: Envolve a etapa de ativação da matriz onde é 
 realizada a ligação de grupos reativos à matriz inerte e acoplamento do ligante que 
 envolve a ligação covalente do ligante à matriz ativada. Ligantes de cadeia pequena 
 apresentam baixa eficiência de adsorção, torna-se necessário utilizar braço de 
 extensão ou espaçador (cadeia de hidrocarboneto). Geralmente, o ligante é de 
 cadeia grande e a proteína de cadeia pequena e o braço de extensão pode não ser 
 necessário. 
 ● Eluição: Etapa de fundamental importância para uma boa resolução do método, 
 requer completa dissociação do complexo (molécula/ligante), pode ser eletivo e 
 não-seletivo. 
 ○ Seletivo: usa as propriedades naturais das interações bioespecíficas 
 ○ Não-seletivo: mudança de pH, proteínas desnaturantes, efeito de 
 temperatura.