01 2015 ApostilaPCR (1)

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Curso: Disciplina: Biologia Molecular 
Período: Professor(a): Letícia da C. Braga 
Nome: 
 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE - PCR 
 
Amplificação de DNA: 
 
 Em 1993, Kary Mullis, um geneticista da Califórnia, recebeu o prêmio Nobel da Química pelo 
desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande 
quantidade de um determinado fragmento de DNA por meio da técnica de PCR (polymerase chain 
reaction - reação em cadeia pela polimerase). É um método para amplificação rápida e específica 
de um de segmento de DNA ou cDNA específico. Consiste em fazer cópias de DNA in vitro, 
usando os elementos básicos do processo de replicação. Os produtos da PCR são chamados 
amplicons. 
 
Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular tem trazido um 
enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense, entre muitas outras 
para além da Investigação em Biologia. É usada para o diagnóstico médico, mapeamento 
genético, detecção de doenças hereditárias, clonagem de genes, testes de paternidade, 
identificação de “impressões digitais” genéticas… De fato, a PCR revolucionou várias áreas das 
ciências biomédicas, como a Biologia Molecular, Patologia, Farmácia, Botânica, Medicina Forense 
e valeu o prêmio Nobel, em 1993, a Kary Mullis (PIERCE, 2004; MALACINSKI, 2005; GRIFFITS et 
al.,.2006). 
 
O objetivo da PCR é produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de 
DNA a partir de uma quantidade mínima. O DNA molde sofre uma amplificação controlada por 
enzimas, obtendo-se milhões de cópias do fragmento de DNA de interesse. O molde pode ser 
qualquer forma de DNA de cadeia dupla, como o DNA genômico: pode usar-se uma gota de 
sangue, um fio de cabelo, uma célula do epitélio oral, um blastômero… ou cDNA específico 
(BROWN, 2006). 
 
Os elementos envolvidos nesta reação são basicamente os mesmos componentes do 
processo de replicação que ocorre no interior das células (Figura 1): 
- DNA que contém o trecho a ser amplificado 
- Desoxinucleotídeos trifosforilados (dATP,dTTP, dCTP e DGTP) 
- Dois iniciadores (pequena seqüência de DNA complementar ao DNA alvo) 
- Enzima DNA polimerase 
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Figura 1: Elementos envolvidos nesta reação da PCR. 
Fonte:http://www.extension.org/pages/32364/the-polymerase-chain-reaction-pcr 
 
A enzima responsável por esta polimerização é a DNA polimerase termoestável (Taq DNA 
polimerase), tendo sido isolada a partir da bactéria termofílica Thermus aquaticus que vive em 
elevadas temperaturas. É essencial que a enzima usada seja estável ao calor, uma vez que os 
ciclos de PCR têm lugar a temperaturas situadas entre os 64ºC e 95ºC. Para executar este ciclo 
usa-se um termociclador, que faz variar de forma rigorosa o tempo e a temperatura ao longo do 
ciclo. 
 
 A reação ocorre em um equipamento chamado termociclador que, através de sucessivas 
mudanças de temperatura, direciona as três etapas da reação (Figura 2): 
1. Desnaturação: é o processo no qual ocorre a separação da dupla fita de DNA por meio da 
elevação da temperatura para ~94oC, 
2. Anelamento: uma vez separadas as fitas de DNA, a temperatura da reação é reduzida para 
~60oC e os iniciadores encaixam-se, um em cada fita, nas respectivas seqüências 
complementares vicinais à região alvo da amplificação, 
3. Extensão: eleva-se a temperatura para ~72oC para que a enzima DNA polimerase posicione-se 
junto aos iniciadores que se anelaram anteriormente e comece a duplicação da fita, recrutando no 
meio os nucleotídeos que contenham as bases nitrogenadas complementares à fita molde. Após o 
término deste ciclo, todo o processo é repetido a partir da desnaturação até a extensão por várias 
vezes (30 vezes em média) até que se obtenha uma quantidade razoável do DNA a ser 
amplificado. 
UNICENTRO IZABELA HENDRIX - Da Igreja Metodista 
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Figura 2: Ciclo da PCR. 
Fonte: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html 
 
Cada uma das fitas novas de DNA extendidas a partir dos primers serve de molde para síntese de 
uma nova fita. Isso garante o aumento exponencial do número de fitas novas (figura 3). 
 
Figura 3: Amplificação exponencial 
Fonte: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html 
 
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Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR tem a seqüência dos primers na 
extremidade 5’ (forward) e a seqüência complementar aos primers da posição 3’ (reverse), de 
forma que o fragmento alvo é isolado na reação (Figura 4). 
 
 
Figura 4: Ciclo da PCR e amplificação do alvo. 
Fonte: http://www.obgynacademy.com/basicsciences/fetology/genetics/ 
 
 
A cinética da PCR consiste em 3 fases: 
-Fase de screening- ciclos iniciais: Os primers procuram o template de DNA com as seqüências 
que lhes são complementares (agem como as sondas nos experimentos de 
hibridização).Encontrar a seqüência complementar não é tão difícil, pois os primers estão em 
considerável excesso em relação ao template. 
-Fase intermediária: O processo de amplificação está ocorrendo, levando ao acúmulo exponencial 
do fragmento de DNA. O pareamento do primer com a seqüência que lhe é complementar já está 
bem facilitada, pois já existem várias cópias das seqüências alvo. 
-Fase tardia ou fase de platô: O aumento exponencial do no de cópias ocorre até um determinado 
nº de ciclos, que será variável de reação para reação ocasionando esta fase. A amplificação já é 
sub-ótima devido à limitação dos reagentes e à competição dos produtos gerados com os primers 
disponíveis. As causas do platô são várias: 
-Perda da atividade da enzima 
-Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA 
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-Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre sí, em detrimento do pareamento 
com os primers. 
-Aumenta possibilidade de amplificação de produtos inespecíficos. 
-Gasto dos reagentes, especialmente de primers, mas também de deoxinucleotídeos. 
-Acúmulo de pirofosfato, resultante das ligações fosfodiésteres 
-Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor mas 
também foram se acumulando, etc… 
 
Algumas variações da técnica de PCR são usadas de acordo com o objetivo a ser alcançado. 
Dentre estas: 
 PCR Multiplex 
 Reverse Transcription PCR (RT-PCR) 
 PCR metilação específica (MSP) 
 PCR-RFLP (amplificação de Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição) 
 RAPD (Fragmentos de DNA amplificados ao acaso) 
 PCR Quantitativa em tempo real 
 
Síntese do cDNA para reações de Reverse Transcription PCR (RT-PCR) 
O cDNA é um DNA produzido a partir de RNA mensageiro (mRNA) que servirá como molde 
(Figura 5). 
 
Figura 5: Reverse Transcription PCR (RT-PCR) 
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Através da enzima transcriptase reversa é gerada uma fita de DNA complementar ao 
mRNA, procedimento conhecido como RT-PCR. Este método é útil, pois se sabe que todo DNA 
gerado corresponde, quase totalmente, à seqüência do gene, sem conter os íntrons que estão 
presentes no gene de organismos eucariotos. 
 
Exercícios: 
1) O que é desnaturação e qual a importância da elevação da temperatura? 
2) Qual a função dos fragmentos são chamados “primers”.? 
3) Para que usar dois primers? 
4) O que é Taq Polimerase? 
5) Quais elementos devem estar no tubo de reação de PCR? 
6) Para que serve a PCR?