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133 MECANISMOS DE MORTE CELULAR: APOPTOSE VERSUS NECROSE Cap. 10 AtØ aproximadamente 20 anos atrÆs só se definia uma via de morte celular em situaçıes patológicas, a necrose. Durante a dØcada de 1970 o patologista John Kerr e colaboradores estu- dando atrofia e hiperplasia hepÆtica descreveram uma outra forma de morte, a qual chamaram de necrose com encolhimento (shrinkage necro- sis). As características desta forma de necrose eram: a) ausŒncia de processo inflamatório; b) cØlulas pequenas; c) citoplasma contido em ve- sículas, algumas contendo nœcleo com croma- tina condensada; d) citoplasma levemente corado, indicando que os lisossomos ainda es- tavam intactos. Posteriormente a este grupo de pesquisadores se juntou o embriologista Allison Crawford que chama a atençªo do grupo para as descobertas de Glüchmanm do começo da dØ- cada de 1950, sobre a morte celular programa- da, que era nada mais que o mesmo fenômeno só que presente numa situaçªo fisiológica. O grupo entªo decide chamar a necrose por encolhimento de apoptose, palavra originÆria do grego clÆssico, que era o termo utilizado por Homero para descrever a queda das folhas no outono (dropping off ou falling off), isso com o intuito de tentar expressar renovaçªo e nªo a morte propriamente dita. Apesar do fenômeno descrito e chamado de apoptose na dØcada de 1970 ser o mesmo jÆ descrito por embriologis- tas na dØcada de 1950 como morte celular pro- gramada, foi durante o estabelecimento da Mecanismos de Morte Celular: Apoptose versus Necrose terminologia apoptose que se verificou que ele poderia aparecer tanto em situaçıes fisiológicas como em situaçıes patológicas. O termo morte celular programada ou apoptose tŒm sido diferenciados entre a mor- te que ocorre em situaçıes fisiológicas decor- rentes de informaçªo genØtica característica das cØlulas (cØlulas da pele, ovÆrios, espermatozói- des etc.) e aquela que ocorre em situaçıes pato- lógicas e Ø induzida por um fator externo. O termo suicídio celular tambØm Ø bastante uti- lizado e suscitou uma discussªo interessante so- bre o papel do suicídio de algumas cØlulas num organismo pluricelular e de um suicida na co- munidade, que parecem ser reaçıes totalmente antagônicas. Com a descriçªo das características da morte por apoptose e as diferenças com relaçªo à ne- crose entenderemos melhor as vantagens que ela tem sobre a œltima em algumas situaçıes, como na embriogŒnese. As vias bioquímicas da apop- tose sªo bastante intrincadas e ainda estªo sen- do estudadas. A apoptose tambØm Ø bastante estudada em patologias em que hÆ diminuiçªo da morte celular (câncer) ou que tem aumento exacerbado (SIDA). A manipulaçªo da via de morte tem sido bastante cogitada como uma maneira de se conseguir melhores resultados te- rapŒuticos, principalmente na quimioterapia do câncer. Simone Mafalda Rodrigues Camargo Nestor Schor 134 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 10 CARACTER˝STICAS MORFOLÓGICAS Necrose Na necrose hÆ intumescimento da cØlula, que Ø característica desta via de morte e de- corrente da falŒncia dos mecanismos de trans- porte da membrana. As organelas, em especial a mitocôndria, tambØm se apresentam intumes- cidas. A perda da integridade da membrana plasmÆtica pode permitir a entrada de enzimas proteolíticas para o citosol e tambØm a libera- çªo do material intracelular e desencadeamen- to de reaçªo inflamatória. Apoptose Morfologicamente, a cØlula em apoptose se caracteriza por diminuiçªo de tamanho, envol- vendo tanto o citoplasma como o nœcleo. A membrana citoplasmÆtica e as organelas se mantŒm íntegras, mas hÆ formaçªo de vacœo- los. A alteraçªo morfológica mais característi- ca aparece no nœcleo quando a cromatina condensada se redistribui perifericamente. A cØlula diminui de tamanho, o material intracelu- lar Ø dividido em corpos cercados pela própria membrana citoplasmÆtica (corpos apoptóticos), que sªo absorvidos pelas cØlulas vizinhas ou macrófagos residentes. Situaçıes Fisiológicas e Patológicas em que Ocorre Apoptose HÆ inœmeras situaçıes fisiológicas em que se observa a ocorrŒncia de apoptose em orga- nismos pluricelulares. Durante a fase final de diferenciaçªo atípica de algumas cØlulas (perda do nœcleo de eritróci- tos, das cØlulas do cristalino, modificaçıes dos queratinócitos para formar a pele); no turnover de tecidos que se dividem com maior velocidade, na manutençªo da homeostase celular (ductos mamÆrios durante o ciclo menstrual, œtero); in- voluçªo (córtex adrenal de ratos, ductos mamÆ- rios após desmame, folículos ovarianos em atresia, tecido alveolar ao redor do dente quando este nasce); linfócitos T, cØlulas K e natural killer in- duzem morte de cØlulas-alvo por apoptose. HÆ vÆrias situaçıes patológicas em que se pode encontrar diminuiçªo ou aumento da apop- tose. A diminuiçªo da apoptose, ou seja, perda da capacidade de morte Ø uma característica das cØlulas tumorais. Podemos observar aumento da apoptose em casos de derrame, infarto, síndro- me da imunodeficiŒncia adquirida (SIDA) por induçªo imprópria de apoptose em cØlulas T CD4, em algumas glomerulonefrites. Mecanismos Moleculares Os primeiros estudos sobre os mecanismos de morte por apoptose foram feitos em nemató- Tabela 10.1 Diferenças entre as Características Morfológicas da Apoptose e da Necrose Características Apoptose Necrose Tamanho das cØlulas fl › Permeabilidade da membrana Normal Perdida precocemente celular Brotamentos na membrana celular Precoces e característicos Ausentes Morfologia das mitocôndrias Normal Intumescida com perda das cristas Cromatina nuclear Condensada e fragmentada Nªo condensada e fragmentada Formaçªo dos corpos apoptóticos Característico Ausente TØrmino Fagocitada rapidamente por cØlulas vizinhas Lise AparŒncia nos cortes de tecidos Difícil de detectar Lesªo das cØlulas e ao redor, fÆcil de detectar 135 MECANISMOS DE MORTE CELULAR: APOPTOSE VERSUS NECROSE Cap. 10 deo, Caenorhabditis elegans, onde foram identi- ficados trŒs genes que podiam ser responsÆveis pela morte (ced-3 e ced-4) ou pela manutençªo da vida (ced-9). Nos mamíferos esses genes fo- ram identificados e as proteínas que eles trans- crevem sªo caspase-1, molØcula de apf-1 e bcl-2, respectivamente. Outro mecanismo descrito nos mamíferos Ø o dos receptores de membrana da família do TNF. Estes receptores permitem a morte de algumas cØlulas e sªo especialmente importantes no sistema imune. Receptores da Família do TNFa Os receptores do TNF, dos quais os mais conhecidos sªo TNFR1 e CD95 ou fas, sªo amplamente distribuídos nos tecidos. Eles tŒm uma porçªo extra e outra porçªo intracelular; a porçªo extracelular reconhece seus antígenos (TNFa ou fas) que sªo apresentados pelas cØlu- las de defesa, macrófagos, linfócitos T CD8+ ou natural killer. A parte intracelular difere um pouco de um receptor para outro, ambos tŒm a capacidade de ativar a cascata de caspases e le- var a cØlula à morte; no caso do TNFR1, por mecanismos desconhecidos, a cØlula pode optar por morrer ou simplesmente desencadear res- posta inflamatória mediado por NFkb . Ainda hÆ outros receptores chamados DR3, DR4 ou DR5. O receptor DR3 Ø semelhante ao receptor de TNFa (TNFR1) e tem como ligante a molØcula de apo3L que tambØm se parece com TNF. Este complexo pode levar a cØlula igualmente à mor- te por apoptose ou a uma resposta inflamatória. A grande diferença entre os dois Ø que, neste caso, o ligante Ø expresso em muitos tecidos e o receptor Ø expresso no fígado, baço e sangue perifØrico. Os receptores DR4 ou DR5 sªo si- milares ao CD95, tŒm com ligante o apo2L/ TRAIL e levam a cØlula à morte rapidamente. Como seu similar, eles estªo amplamente distri- buídos em todos os tecidos. Junto deles tambØm pode se encontrar outros dois receptores falsos(DcR1 2), que se ligam ao apo2L protegendo o tecido da morte. Em algumas situaçıes pode ha- ver a superexpressªo do DR45 e levar a cØlula à morte. Caspases As caspases sªo proteases com resíduos de cisteína (c-) e que clivam seus substratos sem- pre depois de um resíduo de Æcido aspÆrtico (-aspase). Elas foram identificadas como prote- ínas homólogas àquelas transcritas pelo gene ced-3 no C. elegans. Nos mamíferos elas jÆ sªo dez descritas e clivam diferentes substratos, po- dendo ser eles partes da cØlula ou outras pró- caspases. Elas sªo encontradas nesta forma de pró-caspase no citoplasma e podem ser levadas a ficar ativas por diversas vias. Elas podem agir numa reaçªo em cadeia, onde a hierarquia co- meça com as caspases iniciadoras (caspases-8, -9 e -10), que por sua vez ativam as propagado- ras1 e estas as executoras (caspases-2, -3, -7, -6). Os receptores da família do TNF induzem morte por ativaçªo destas proteases (caspase-8) pelas suas porçıes intracelulares. Assim como quimioterÆpicos e radiaçªo, podem tambØm in- duzir a ativaçªo deste mecanismo (caspase-9), em presença de ATP, de uma molØcula de apaf-1 modificada e de citocromo c liberado pela mito- côndria quando esta foi lesada. HÆ evidŒncias de que o citocromo c Ø liberado pelo poro de permeabilidade transacional (PT) da mitocôn- dria e que este pode ser regulado pelas proteínas da família bcl-2 (bax, bcl-2 e bcl-XL). As caspases tŒm inibidores, como a proteína codificada pelo gene do vírus cowpox, a CrmA (Cytokine Endogen Modifier) e a p35, tambØm produto de gene viral (baculovírus) que parece atenuar a apoptose agindo na via das caspases. As proteínas da família IAP (Inhibitor Apoptosis Protein) sªo endógenas e tŒm-se demostrado que inibem a atividade das caspases-3 e -7, mas nªo das caspases-1, -6 e -8, como, por exemplo, as proteínas XIAP e a survivina. HÆ tambØm inœ- meros inibidores sintØticos das caspases dispo- níveis no mercado As caspases podem ser ativadas por diferen- tes vias, e acredita-se que sejam a via final de todas as vias de apoptose: Tabela 10.2 Genes Identificados em Nematódeo que Apresentam Correspondente nos Mamíferos Nematódeo Mamiferos Funçªo Ced-3 ICE (1992) Apoptose Ced-4 Apaf-1 (1997) Apoptose Ced-9 Bcl-2 (1986) Inibiçªo apoptose 136 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 10 Quimioterápicos radiação Lesão da mitocôndria ßß ßß ß liberação de citocromo c, pró-caspases-3, -2 e -6 ßß ßß ß citocromo c se liga apaf-1 na presença de ATP ßß ßß ß pró-caspase-9 ativada Caspases efetoras, -3, -2, -6, -7 Caspases agem em seus substratos e levam as células à morte por apoptose Agentes antiapoptóticos bcl-2, IAPs Fas/CD95, TNF, Apo3L, Apo2L/TRAIL Receptores de morte ßß ßß ß pró-caspase-8 ativada Fig. 10.1 Esquema da ativaçªo das caspases. Família de Proteínas do bcl-2 (B-cell Lymphoma/leukemia Gene Product-2) As proteínas da família bcl-2 foram descritas como homólogas daquelas determinadas pelo gene ced-9 no modelo do C. elegans. Nesta família te- mos 15 proteínas divididas em trŒs classes, simila- res a bcl-2, que promovem a vida, e bax e bik que levam a cØlula à morte. O mecanismo pelo qual es- sas proteínas impedem a morte pode ser por inati- var alguns adaptadores necessÆrios para a açªo das caspases, como a molØcula de apaf-1, ou a libera- çªo do citocromo c da mitocôndria. O mecanismo pelo qual elas podem levar à morte Ø a formaçªo de poros em membranas lipídicas, tais como da mito- côndria. TambØm Ø proposta a ativaçªo da caspase- 1 diretamente pelas proteínas da família bax. P53 Um outro gene bastante conhecido no pro- cesso de apoptose Ø o gene supressor de tumor que codifica a proteína p53. Esta proteína estÆ intimamente ligada com a manutençªo da inte- gridade do DNA durante a divisªo celular, mais especificamente com o checkpoint em G1/M quando a cØlula decide entrar ou nªo na fase de síntese de uma nova dupla fita. Se o DNA estÆ integro a cØlula entra em S e a divisªo segue o seu curso normal. Por outro lado, se alguma le- sªo Ø encontrada durante a divisªo, o gene p53 Ø rapidamente ativado pela proteína codificada pelo gene ATM (Ataxia-telangiectasia-mutated). A proteína p53 checa o DNA e decide se a divi- sªo deve continuar, ou devem ser ativadas pro- teínas de reparo, ou ainda ocasionar a ativaçªo do mecanismo de morte celular. Quando isto Ø decidido, uma proteína p21 Ø estimulada, e esta por sua vez se liga ao complexo ciclinaD/cdc2 e nªo permite que este complexo fosforile um ou- tro complexo formado pela proteína Rb-E2F. TambØm inativa a proteína PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), atuando durante a divi- sªo celular, e desta maneira impede a continua- 137 MECANISMOS DE MORTE CELULAR: APOPTOSE VERSUS NECROSE Cap. 10 çªo do ciclo. As cØlulas entram em apoptose por ativaçªo de genes da família bax ou ativando o ciclo das caspases, como via final comum. DIVERSAS MANEIRAS DE SE QUALIFICAR OU QUANTIFICAR APOPTOSE E NECROSE Necrose Morfologicamente Uma das maneiras mais comuns de se quan- tificar necrose Ø morfologicamente, observando- se as mudanças que a cØlula sofreu, e isto nªo Ø muito eficaz. Caracterizar uma cØlula necrótica por microscopia eletrônica Ø a melhor maneira. Tabela 10.4 Família das Proteínas estÆ Dividida em Pró-vida e Pró-apoptótica Pró-vida Pró-apoptótica Subfamília da bcl2: Subfamília bax: Bcl-2, bcl-xL, bcl-W, Bax, bak, bok mcl-1, A1, NR-13, BHRF1, LMW5-HL, ORF16, KS-bcl-2, E1B-19K Subfamília BH3/bik: Bik, blk, hrk, BNIP3, BimL, Bad, Bid, EGL-1 Um outro mØtodo, bastante usado em mØ- todos in vitro, Ø a dupla marcaçªo das cØlulas, ou seja, um marcador para apoptose e um para viabilidade celular, ou integridade da membra- na. Por exclusªo, se as cØlulas tŒm baixa taxa de apoptose e baixa viabilidade celular estas cØlulas morreram de necrose. Ao contrÆrio, se estas cØ- lulas tŒm alta taxa de apoptose, conseqüentemen- te morreram por apoptose, e podem ou nªo ter sua taxa de viabilidade celular comprometida, dependendo da fase em que ela se encontra. Os corantes utilizados para verificar a viabi- lidade da membrana nos mØtodos de exclusªo sªo o trypan blue, o iodeto de propídeo e o bro- meto de etídeo. A membrana plasmÆtica só serÆ permeÆvel a estes corantes caso haja compro- metimento de sua integridade. Apoptose Praticamente todas as tØcnicas de detecçªo de apoptose se baseiam nas modificaçıes nu- cleares que ocorrem nas cØlulas, diminuiçªo de tamanho, condensaçªo da cromatina ou frag- mentaçªo do DNA. Deve-se lembrar que para quantificar apoptose ao menos dois mØtodos devem ser utilizados. Morfologicamente Pode-se qualificar ou mesmo quantificar as cØlulas apoptóticas com tØcnicas morfológicas, por Tabela 10.3 Localizaçªo dos Receptores da Família do TNF e dos seus Ligantes Receptor Local Receptor Local Ligante Ligante TNFR Tecidos em geral Macrófagos TNF ou linfotoxina a Linfócitos T Fas, apo1, CD95 Tecidos em geral Linfócitos T FasL Apo3, Dr3, TRAMP, Baço, timo, sangue perifØrico Tecidos em geral Apo3L, TWEAK LARD Ativados por cØlulas T Apo2, DR5, TRAIL-2, Tecidos Tecidos, ativados TRICK, KILLER pelas cØlulas T Apo2L, TRAIL DR4 Idem DR5 Idem DR5 Apo2L, TRAIL CAR1 Nªo identificado 138 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 10 identificaçªo das modificaçıes nucleares. Uma das mais simples Ø a coloraçªo com hematoxilina. Este corante marca o nœcleo e permite que se identifique os corpos apoptóticos, ou mesmo os nœcleos com cromatina condensada e de pe- queno tamanho. A microscopia eletrônica per- mite avaliar perfeitamente as modificaçıes que ocorrem nas cØlulas, no entanto este mØtodo Ø mais utilizado para confirmar as outras tØcni- cas,pois quantificar apoptose por esta tØcnica seria muito demorado devido a magnificaçªo conseguida. Alguns corantes fluorescentes que se ligam especialmente ao DNA nuclear ou à cromatina e podem ser utilizados. Sªo eles: o Hoechst 33342 ou 33258, o DAPI. O Hoechst (excitaçªo em 346 e emissªo em 460nm) e o DAPI (excitaçªo em 350.3 e emissªo em 461nm) se ligam a ade- nina-timidina e marcam tanto cØlulas normais como apoptóticas, que podem ser diferenciadas pelas mudanças morfológicas e pela intensidade da fluorescŒncia. Em cØlulas LLC-PK1 tratadas com cisplati- na e coradas com Hoechst 33342, pode-se no- tar nœcleos de cØlulas normais e apoptóticos (Fig. 10.2 setas). Imuno-histoquímica A tØcnica conhecida como TUNEL (Termi- nal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling). Esta tØcnica histoquímica marca a fragmentaçªo de DNA in situ, quando digoxigenina-deoxiuridina (dUTP) Ø inserido na terminaçªo 3-OH pela enzima deoxinucleotídeo terminal transferase (TdT) que Ø biotinilada, e depois pode ser reconheci- da pela estreptoavidina complexada com uma enzima (horseadish peroxidase ou fosfatase al- calina) e esta enzima após quebrar seu subs- trato deixa marcada a lâmina em marrom, permitindo desta maneira o reconhecimento das cØlulas apoptóticas. CØlulas mesangiais de camundongo imor- talizadas tratadas com cisplatina, fixadas e ana- lisadas quanto a fragmentaçªo do DNA pelo mØtodo de TUNEL. As cØlulas marcadas em marrom apresentam fragmentaçªo e, portan- to, sªo consideradas apoptóticas (Fig. 10.3). Detecçªo da Fragmentaçªo do DNA por Eletroforese em Gel de Agarose Durante o processo de apoptose o DNA Ø quebrado em fragmentos mœltiplos de 180-200 pares de bases. Isto porque as DNAses ativadas cortam a fita de DNA entre os nucleossomas, dando aos fragmentos esta característica de mœl- tiplos. Quando este DNA Ø extraído e aplicado a um gel de agarose num sistema de eletroforese, ele apresentarÆ um aspecto de escada. Quando ocorre a necrose, tambØm hÆ a quebra de DNA, mas essa quebra se dÆ de uma maneira desorde- nada e o aspecto do DNA na eletroforese Ø de um esfregaço. As bandas podem ser quantificadas com um densitômetro, desde que a mesma quantida- de de DNA tenha sido utilizada. Citometria de Fluxo Outros mØtodos utilizados para quantificar apoptose sªo aqueles que se utilizam do citôme- tro de fluxo. Nestas tØcnicas se utilizam corantes fluorescentes e nelas pode ser analisado a frag- mentaçªo do DNA (iodeto de propídeo, Hoechst, DAPI) ou alguns marcadores de membrana como a anexina V. MECANISMOS MOLECULARES ENVOLVIDOS NA APOPTOSE O estudo de eventos que ocorrem antes da fragmentaçªo do DNA e que sªo identificados como os possíveis mecanismo moleculares da apoptose sªo estudados de diversas maneiras. Fig. 10.2 Nœcleos de cØlulas normais e apoptóticas. 139 MECANISMOS DE MORTE CELULAR: APOPTOSE VERSUS NECROSE Cap. 10 Fig. 10.3 CØlulas opoptóticas marcados pelo mØtodo de TUNEL. VÆrias metodologias da biologia molecular podem ser utilizadas para este fim, como transfecçªo de cØlulas, TR-PCR (Transcriptase Reverse-polymerase Chain Reaction), constru- çªo de animais knockout ou que superexpres- sem alguns genes. Receptores de TNF/CD95 O estudo do envolvimento destes receptores nas vias de apoptose pode ser feito atravØs da marca- çªo destes por imuno-histoquímica, para averi- guar se houve aumento de sua expressªo durante o insulto, tornando desta forma a cØlula mais susceptível a entrar em contato com seu ligante apresentado pelas cØlulas de defesa. TambØm para averiguar a capacidade de determinada li- nhagem de cØlula em experimento in vitro pode se incubar as mesmas com anticorpo anti-fas (CH-11) ou TNF e observar se as mesmas en- tram em apoptose. Estas cØlulas entrarªo, ou nªo, em maior ou menor grau em apoptose depen- dendo do tipo de receptores que elas expressam. Caspases O envolvimento das caspases na via morte pode ser estudado com inibidores destas enzi- mas, reversíveis ou nªo, ou atravØs da determi- naçªo de sua atividade adicionando ao meio reacional o seu substrato. TambØm se pode veri- ficar a expressªo das caspases atravØs de seu RNAm ou mesmo atravØs da avaliaçªo da pre- sença destas proteínas ou de seus substratos modificados por western blot. Fig. 10.4 CØlulas com características de tœbulo proxi- mal renal tratadas com fator de necrose tumoral (TNFa/ 10ng/ml/24horas) apresentando padrªo de esfregaço característico de necrose1; tratadas com estaurosporina (0,1mM/8 horas) apresentando padrªo de degraus ca- racterístico de cØlulas apoptóticas2; cØlulas-controle apre- sentando o DNA intacto3. Proteínas da Família do Bcl-2 Existem anticorpos para vÆrias das proteí- nas desta família, e pode-se avaliar a expressªo delas por imuno-histoquímica ou por western blot. Pode-se avaliar a expressªo do RNAm tam- bØm por PCR. Em estudos in vitro pode-se pro- duzir animais transgŒnicos que superexpressam ou mesmo animais knockout para estas proteí- nas. TambØm se pode fazer a transfecçªo de cØ- lulas, e desta maneira estudar a seu envolvimento na apoptose causada por determinado insulto ou patologia. P53 A expressªo e o papel do gene p53, assim como outros genes supressores de tumor (gene retinoblastoma, Rb) e genes envolvidos no ciclo celular, tŒm sido bastante estudados quanto a sua capacidade de induzir a cØlula a entrar em apoptose. Em específico o gene p53, que codifi- ca a proteína p53, pode ser estudado por imu- no-histoquímica; hÆ no mercado seis anticorpos monoclonais (ab-1 a -6) e um policlonal (ab-7), 140 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 10 que podem detectar a proteína selvagem ou mutada, dependendo das condiçıes do teste (a proteína estar denaturada ou nªo). TambØm se pode avaliar a quantidade de RNAm da p53. Em experimentos in vitro pode-se produzir animais transgŒnicos que superexpressam esta proteína ou animais knockout. BIBLIOGRAFIA 1. Ashkenazi, VM Dixit. Death receptors: signaling and modulation. Science, 281(5381): 1305-8, 1998. 2. B Dietrich. Apoptosis and anti-apoptosis genes in the Bcl-2 family. 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