11 Polimorfismos Genéticos Implicações Clínicas

Prévia do material em texto

141
POLIMORFISMOS GENÉTICOS: IMPLICA˙ÕES CL˝NICAS
Cap. 11
O fenômeno da existŒncia de duas ou mais
variantes de determinado gene, sem efeitos de-
letØrios como os que ocorrem nas mutaçıes, Ø
conhecido como polimorfismo genØtico.
Cada cØlula do organismo sintetiza inœmeras
proteínas diferentes, incluindo enzimas, hormô-
nios, receptores, e componentes estruturais res-
ponsÆveis por todos os processos do metabolismo
e desenvolvimento do organismo. A seqüŒncia co-
dificadora de bases de um determinado gene no
DNA especifica a seqüŒncia de aminoÆcidos na
cadeia polipeptídica da proteína correspondente.
A alteraçªo de um nucleotídeo na seqüŒncia do
gene, ou mutaçªo, pode levar à alteraçªo na es-
trutura e/ou funçªo da proteína. Quando as al-
teraçıes do DNA nªo modificam a seqüŒncia
primÆria de aminoÆcidos de um polipeptídeo ou
quando ocorrem em regiıes do gene nªo codifi-
cadoras de proteína, nªo se observa efeito fenotí-
pico. Portanto, nem todas as proteínas variantes
trazem conseqüŒncias clínicas. A ocorrŒncia de
mais de uma versªo de determinada proteína
numa populaçªo, ou seja, duas ou mais formas
estruturalmente distintas, geneticamente diferen-
tes e relativamente comuns Ø considerada um po-
limorfismo genØtico.
Os genes estªo em ordem linear ao longo
dos cromossomos, cada gene possuindo uma
posiçªo precisa denominada locus. Cada locus
genØtico abriga pelo menos um alelo, que Ø uma
Polimorfismos GenØticos:
Implicaçıes Clínicas
das possíveis formas de um gene. Como existem
duas cópias de cada cromossomo (exceto X e Y
nos homens), existem no mínimo dois loci, ou
seja, duas cópias de cada gene. Se os dois alelos
presentes em cada gene sªo idŒnticos, o indiví-
duo Ø considerado homozigoto. Se os alelos di-
ferem, Ø heterozigoto. Se a presença de um alelo
anormal resulta em doença, significa que existe
uma mutaçªo em tal alelo. O alelo mutante
pode ser dominante, co-dominante ou reces-
sivo. Entretanto se o alelo, apesar de nªo usual,
nªo causar nenhuma anormalidade, esta forma
alternativa do alelo Ø considerada um polimor-
fismo genØtico.
Em sua maioria os genes sªo mais comple-
xos do que apenas um locus por cromossomo
com um œnico alelo comum. Podem existir mœl-
tiplos alelos para um locus œnico, ou a funçªo
da proteína pode depender de mœltiplos loci.
Define-se entªo polimorfismo genØtico como
a ocorrŒncia de mœltiplos alelos em um locus,
onde pelo menos dois alelos aparecem com fre-
qüŒncias superiores a 1%. Loci polimorfos sªo,
por convençªo, aqueles nos quais pelo menos
2% da populaçªo sªo heterozigotos.
A determinaçªo dos tipos sangüíneos Ø um
dos primeiros exemplos de variaçªo de proteína
determinada geneticamente, onde existem mœl-
tiplos alelos para um locus œnico. No sistema
Ita Pfeferman Heilberg
142
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 11
ABO, um indivíduo pode possuir um dos trŒs
alelos, A, B ou O, em cada locus. Se o paciente Ø
homozigoto AA ou BB, o tipo sangüíneo Ø A ou
B, respectivamente. Se o indivíduo Ø heterozi-
goto para os alelos A ou B, o tipo sanguíneo nªo
serÆ A nem B e sim AB. Neste exemplo, ambos
alelos sªo expressos e as proteínas derivadas des-
tes genes sªo expressas como antígenos na su-
perfície da hemÆcia. O tipo sangüíneo AB Ø um
exemplo de herança co-dominante num sistema
de alelos mœltiplos. Se o indivíduo Ø heterozigo-
to para A e O (ou B e O), o fenótipo O Ø silen-
cioso, e apesar de ser um heterozigoto o indivíduo
demonstra o fenótipo A ou B. Como os diferen-
tes tipos sangüíneos nªo sªo doenças, estes mœl-
tiplos alelos sªo considerados polimorfismos.
No curso da evoluçªo, a ocorrŒncia cons-
tante de variaçıes de nucleotídeos confinada nªo
só às seqüŒncias codificadoras, mas tambØm em
regiıes nªo codificadoras dos cromossomos e
atØ mesmo em seqüŒncias extragŒnicas, tem ga-
rantido um alto grau de diversidade genØtica
entre os indivíduos. Como os produtos de mui-
tas vias metabólicas interagem, outra conse-
qüŒncia importante do polimorfismo de proteínas
Ø propiciar uma constituiçªo química genetica-
mente singular, que responde de maneira œnica
a influŒncias ambientais, dietØticas e farmacoló-
gicas.
Os polimorfismos tŒm valor principalmente
por seu uso como “marcadores” genØticos para
distinguir diferentes formas hereditÆrias de um
gene em estudos de famílias. Em genØtica mØdi-
ca, estes marcadores tŒm servido para: a) mape-
amento de genes nos cromossomos por anÆlise
de ligaçıes; b) diagnóstico prØ-sintomÆtico e prØ-
natal de doenças genØticas; c) detecçªo de hete-
rozigotos portadores de doenças genØticas; d)
testes de paternidade e aplicaçıes forenses; e)
combinaçªo de pares doador-receptor para
transplante de tecidos e órgªos.
Na prÆtica clínica, a avaliaçªo dos polimor-
fismos tem sido œtil na identificaçªo de indiví-
duos de alto risco, ou seja, com predisposiçªo
para desenvolvimento de determinadas doenças
como diabetes melito, câncer, hipertensªo arte-
rial, osteoporose, etc. Tem sido sugerido que al-
gumas variantes genØticas contribuem para
diferenças na vulnerabilidade ao alcoolismo e
abuso de substâncias. Considerando que cada
polimorfismo tem um impacto individual peque-
no no fenótipo, a identificaçªo de genes indivi-
duais contribuindo para determinada doença
representa um desafio maior do que grandes
anormalidades cromossômicas ou mutaçıes de
um gene específico. A presença de alelos sus-
ceptíveis em mœltiplos alelos nªo leva necessa-
riamente à doença porque a interaçªo com
fatores ambientais tambØm tem papel impor-
tante na patogŒnese. O conhecimento dos po-
limorfismos genØticos pode auxiliar a selecionar
os pacientes candidatos a prevençªo de deter-
minadas patologias.
POLIMORFISMOS DO COMPRIMENTO DE
FRAGMENTOS DE RESTRI˙ˆO
O polimorfismo das proteínas, conforme jÆ
mencionado, pode ocorrer em regiıes codifica-
doras, que correspondem a 5% do DNA genô-
mico total. JÆ a diversidade genØtica de regiıes
nªo codificadoras, que nªo tŒm efeito sobre a
expressªo gŒnica, Ø ainda maior, uma vez que se
processa em 95% do DNA. O polimorfismo se
torna um “polimorfismo do comprimento dos
fragmentos de restriçªo” ou RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism) quando a alte-
raçªo na seqüŒncia específica do DNA decor-
rente de mutaçªo hereditÆria ou adquirida faz
com que um sítio de clivagem para uma enzima
de restriçªo apareça ou desapareça em determi-
nado alelo. Enzimas de restriçªo, tais como a
BsmI , EcoRV, ApaI, TaqI etc. reconhecem se-
qüŒncias específicas no DNA, cortando-o em
fragmentos e o tamanho dos fragmentos de DNA
depende entªo da presença ou ausŒncia do sítio
de clivagem.
POLIMORFISMO DO GENE DO RECEPTOR DA
VITAMINA D (VDR)
Na Fig. 11.1 Ø mostrada a identificaçªo do
polimorfismo do VDR decorrente da variaçªo
num sítio de clivagem para a enzima BsmI. Por
convençªo, quando o sítio de clivagem estÆ pre-
sente, o alelo recebe a denominaçªo da letra
minœscula correspondente à enzima de restri-
çªo utilizada (b), e letra maiœscula quando o sí-
tio de clivagem estÆ ausente no alelo (B). No
alelo polimórfico, devido à alteraçªo de um nu-
cleotídeo, a enzima BsmI nªo reconhece a se-
qüŒncia e o sítio de clivagem desaparece. Após
amplificaçªo da regiªo do DNA que contØm o
143
POLIMORFISMOS GENÉTICOS: IMPLICA˙ÕES CL˝NICAS
Cap. 11
Fig. 11.1 — Polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restriçªo. O polimorfismo do receptor de vitamina D (VDR)
decorre da variaçªo num sítio de clivagem para a enzima BsmI; no alelo b o sítio estÆ presente, e no alelo B, devido à
alteraçªo de um nucleotídeo, a enzima BsmI nªo reconhece a seqüŒncia e o sítio de clivagem desaparece. No indivíduo BB,
o resultante fragmento de restriçªo detectado pela digestªo do produto do PCR com a BsmI Ø maior (tem 800 pares de
base), devido à ausŒncia de corte nos dois alelos. No indivíduo bb os fragmentos resultantesdos cortes em ambos alelos
tŒm 650 e 150 pares de base, respectivamente.
polimorfismo, o produto do PCR Ø submetido à
digestªo com a enzima de restriçªo BsmI e as
bandas obtidas podem ser visualizadas em ele-
troforese em gel de agarose corado com brome-
to de etídio. No indivíduo homozigoto BB, o
resultante fragmento de restriçªo detectado pela
digestªo do produto do PCR com a BsmI Ø maior
(tem 800 pares de base), devido à ausŒncia de
corte nos dois alelos. No indivíduo homozigoto
bb os fragmentos resultantes dos cortes em am-
bos alelos tŒm 650 e 150 pares de base, respecti-
vamente. O indivíduo heterozigoto Bb possui um
alelo com corte e um sem corte. O polimorfis-
mo do comprimento dos fragmentos de restri-
çªo tambØm pode ser evidenciado por southern
blot e hibridizaçªo com sonda específica.
O polimorfismo para BsmI do VDR ocorre
no íntron 7 e tem sido relacionado com a massa
óssea em alguns estudos. Indivíduos com o ge-
nótipo bb parecem ter densidade óssea melhor
do que indivíduos BB.
POLIMORFISMO DOS GENES DO SISTEMA
RENINA-ANGIOTENSINA (SRA)
Um dos polimorfismos conhecidos deste sis-
tema Ø o polimorfismo da enzima de conversªo
da angiotensina I (ECA) ou cininase II, que se
caracteriza pela presença ou ausŒncia de um
fragmento de 287 pares de bases que ocorre no
íntron 16 do gene da ECA. A presença do frag-
mento define o alelo de inserçªo, alelo I, e sua
ausŒncia, a deleçªo, alelo D. O genótipo hete-
rozigoto Ø, portanto, denominado ID.
O polimorfismo I/D da ECA parece se relaci-
onar com os níveis intracelulares e plasmÆticos
de enzima conversora. Esta diferença funcional,
que nªo seria característica dos polimorfismos,
de modo geral resulta do fato de que a inserçªo
dentro da regiªo reguladora do gene da ECA,
contØm um elemento silenciador, cuja deleçªo
ativaria o gene. Tem sido descrito que indiví-
duos com o genótipo DD possuem maior risco
de infarto do miocÆrdio e maior associaçªo com
miocardiopatia hipertrófica do que os demais
genótipos. No que tange às doenças renais, o
polimorfismo I/D da ECA tambØm tem sido as-
sociado ao prognóstico da nefropatia por IgA
(doença de Berger). O genótipo DD tem sido
relacionado com maior comprometimento da
funçªo renal alØm de maior progressªo para
insuficiŒncia renal crônica. VÆrios estudos ten-
taram relacionar o polimorfismo I/D da ECA
com nefropatia em diabetes nªo-insulinodepen-
dente mas os resultados, com exceçªo à popu-
laçªo asiÆtica, nªo confirmaram tal associaçªo.
144
VOL. 1 — BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA
Cap. 11
Outros polimorfismos do SRA sªo os do
gene do receptor AT1 da angiotensina II e do
gene do angiotensinogŒnio. O polimorfismo do
receptor AT1 decorre da substituiçªo de um Æci-
do nuclØico (A por C) na posiçªo 1166
(A1166C) da regiªo 3’UTR de um exon do gene
AT1. Homozigose para A1166C nªo tem sido
considerada como valor preditivo isolado para
maior risco de infarto do miocÆrdio mas teria
efeito sinØrgico com o polimorfismo I/D da ECA
e pode representar um marcador de um locus
variante funcional. A hipertensªo essencial nªo
segue uma herança mendeliana simples, e os po-
limorfismos da ECA, renina e do receptor AT1
nªo tŒm sido associados com hipertensªo. Dife-
rentemente, a mutaçªo na qual a treonina Ø subs-
tituída por metionina no resíduo 235 do gene
do angiotensinogŒnio (M235T) se associa nªo
só com concentraçıes plasmÆticas mais eleva-
das de angiotensinogŒnio quanto com hiperten-
sªo arterial.
POLIMORFISMOS DAS VNTRS
Outra classe de polimorfismos caracterizados
por inserçªo/deleçªo consiste numa sØrie de com-
primentos de fragmentos alØlicos, relacionados
entre si por um nœmero hipervariÆvel de seqüŒn-
cias curtas de DNA, tipicamente de seis a oito
pares de bases, que se repetem de seis a 20 vezes
(Variable Number of Tandem Repeated, VNTR).
A funçªo destas repetiçıes Ø desconhecida, mas
a sua repetiçªo ao acaso e peculiar a cada indiví-
duo, ao longo do genoma, fornece o equivalente
a um nœmero serial ou “código de barras” para
identificaçªo dos indivíduos. Os marcadores mais
informativos de VNTR apresentam atØ vÆrias dœ-
zias ou mais de alelos. Desta forma, conforme Ø
mostrado na Fig. 11.2, os marcadores podem ser
utilizados para anÆlise de ligaçıes genØticas e iden-
tificaçªo individual (medicina forense e verifica-
çªo de paternidade) jÆ que provavelmente nªo
existem dois indivíduos nªo aparentados que com-
partilhem os mesmos alelos.
FINGERPRINTING DE DNA
Ao se usar como “sonda” uma seqüŒncia
repetida compartilhada por diferentes polimor-
fismos de VNTRs, demonstra-se que o padrªo
de hibridizaçªo de cada indivíduo Ø œnico e ser-
ve como uma impressªo digital (fingerprinting)
de DNA (Fig. 11.2), como se fosse um código
de leitura de barras, conforme jÆ mencionado.
Somente gŒmeos idŒnticos mostram um padrªo
indistinguível um do outro.
Fig. 11.2 — Mapeamento do padrªo de VNTR em trŒs regiıes diferentes (A, B e C) de dois indivíduos para fingerprinting
de DNA. Uma enzima de restriçªo reconhece e corta seqüŒncias entre dois sítios de restriçªo liberando fragmentos de DNA
contendo as VNTRs. Por exemplo, na regiªo A, o paciente I apresenta seis repetiçıes, enquanto o paciente II apresenta
somente duas repetiçıes.
Regi o Paciente
Pacientes
145
POLIMORFISMOS GENÉTICOS: IMPLICA˙ÕES CL˝NICAS
Cap. 11
ASSOCIA˙ˆO DE GENÓTIPOS COM
PROGNÓSTICOS DE DOEN˙AS
Existem algumas razıes pelas quais um
determinado genótipo pode nªo se tornar um
preditor suficientemente acurado de prognósti-
cos. No caso do polimorfismo I/D da ECA, a
amplificaçªo do alelo I por PCR Ø menos efici-
ente do que a do alelo D, levando à superesti-
mativa da freqüŒncia do alelo D e, portanto, do
genótipo DD. Este problema pode ser contor-
nado com a repetiçªo da genotipagem atravØs
de um PCR utilizando um primer específico para
a regiªo de inserçªo. AlØm deste fator tØcnico,
outros fatores tambØm sªo importantes. Dife-
rentemente de distœrbios mendelianos simples,
o processo de progressªo de vÆrias doenças re-
nais resulta da interaçªo de fatores genØticos com
fatores ambientais. Adicionalmente, o impacto de
determinado genótipo pode ser tŒnue e quanti-
tativo em vez de marcante e qualitativo, sendo
por vezes tecnicamente difícil de se identificar
um papel funcional direto. Por exemplo, se um
locus de susceptibilidade para uma determinada
doença for procurado em mais do que 20 sítios
polimórficos de um gene, pelo menos um serÆ
provavelmente estatisticamente significante. De
maneira anÆloga, se mais do que 20 doenças fo-
rem investigadas para um determinado locus po-
limórfico do DNA, este locus servirÆ de marcador
significante de susceptibilidade para pelo menos
uma doença. Portanto, uma vez que a anÆlise es-
tatística revela uma associaçªo significante entre
um genótipo e um fenótipo de doença, Ø muito
importante que estenda a amostra da populaçªo
estudada, usando os mesmos critØrios de defini-
çªo de um fenótipo específico, para que se ele-
vem as chances de uma associaçªo biológica
verdadeira.
BIBLIOGRAFIA
1. Cooper GS, Umbach DM. Are vitamin D receptor
polymorphisms associated with bone mineral
density? A meta -analysis. J Bone Miner Res 11:
1841-1849, 1996.
2. Genetic Diseases, in Introduction to Molecular
Medicine, edited by Ross, DW Springer-Verlag, New
York, 2nd edition, 1996, pp. 85-110.
3. Kunz R, Bork JP, Fritsche L, Ringel J Sharma AM .
Association between the angiotensin-converting
enzyme insertion/deletion polymorphism and
diabetic nephropathy: a methodological appraisal
and systematic review. J Am Soc Nephrol 9:1653-
1663, 1998.
4. Morrison NA, Qi JC, Tokita A, Kelly PJ, Crofts L, Nguyen
TY, Sambrook PN, Eisman JA : Prediction of bone
density from vitamin D receptor alleles. Nature
367:284-287, 1994.
5. Variaçªo genØtica, polimorfismo e mutaçªo, em
Thompson & Thompson: GenØticaMØdica, editado
por Thompson MW, McInnes RR, Willard HF,
Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 5a ediçªo, 1993,
pp. 82-99.