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163 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 HÆ pouca dœvida que a PCR (polymerase chain reaction; reaçªo em cadeia de polimerase) Ø uma das tØcnicas que mais revolucionou a medicina nos œltimos tempos, tornando a medi- cina molecular um verdadeiro ramo da clínica mØdica. A maior parte deste capítulo serÆ devo- tada a esta ferramenta, embora outras tØcnicas indispensÆveis serªo abordadas. PCR Esta tØcnica possui grande utilidade porque: Permite que o Æcido nuclØico-alvo seja espe- cificamente selecionado. Amplifica por milhares de vezes o alvo sele- cionado. É realizada em poucas horas, levando a re- sultados rÆpidos. A especificidade da PCR Ø obtida atravØs do uso de um par de primers (iniciadores) compos- to de oligonucleotídeos que, por terem um com- primento mínimo ( » 21 bases) de uma seqüŒncia de bases œnica, seguramente anelarªo no DNA- alvo somente em um dado ponto, visto que as condiçıes de temperatura e força iônica da so- luçªo estejam apropriadas. A amplificaçªo da PCR Ø exponencial e Ø obtida pelo emprego de polimerases de DNA termoestÆveis que, a partir do par de primers, copiam as regiıes do DNA-alvo mœltiplas vezes Biologia Molecular como Instrumental MØdico numa sØrie de ciclos. Estes princípios sªo ilus- trados na Fig. 13.1. Supondo que se deseje amplificar uma re- giªo específica de DNA com comprimento de 400bp no genoma de uma œnica cØlula humana. Começa-se com duas cópias iniciais pois a cØlu- la Ø diplóide e realizamos 40 ciclos de reaçªo; o fator de amplificaçªo Ø 240 = 1,1 · 1012 e, assu- mindo um eficiŒncia de 80%, a massa do produ- to da PCR produzida serÆ de 0,38 m g de DNA, a qual Ø facilmente visualizada em um gel de aga- rose corado com brometo de etídio. Usando as condiçıes-padrªo de PCR, man- tendo as concentraçıes de Mg2+, desoxinucleo- tídeos, DNA-alvo e primers dentro de limites típicos, a maioria das PCRs funciona bem. Na ausŒncia de produto final, ou se mais de um pro- duto for gerado, os seguintes fatores devem ser considerados: O desenho dos primers e suas temperaturas de anelamento; atualmente programas de computador auxiliam na escolha dos primers. O uso de polimerases termoestÆveis diferen- tes. A concentraçªo de Mg2+ e a força iônica na reaçªo. Anelamento nªo-específico ocorrendo du- rante o preparo da reaçªo, que pode ser evi- tado usando manobras como polimerases recombinantes termoativadas, anticorpos Martin R. Whittle 164 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 contra a polimerase, preparo no frio, seqües- trantes de Mg2+, as quais travam a enzima nesta fase inativa antes da amplificaçªo. A presença de inibidores da polimerase na reaçªo, especialmente se a fonte do DNA- alvo estiver suja. Na PCR, o Æcido nuclØico-alvo Ø o DNA. As fontes de DNA sªo vÆrias; no caso de DNA ge- nômico humano, elas atualmente incluem: Leucócitos obtidos de uma amostra de san- gue. CØlulas bucais obtidas usando uma escova e/ou saliva. Biópsia, especialmente no caso de tumor. Tecido em bloco parafinado. Blastômeros ou glóbulos polares isolados nos casos de fertilizaçªo in vitro. Amostras forenses tal como osso cadavØri- co, esperma, ponta de cigarro usado. Lembramos que o DNA mitocondrial (mtDNA) tambØm Ø estudado, tanto em funçªo das doenças causadas por mutaçıes que ocor- rem nos genes mitocondriais, quanto pelas infe- rŒncias feitas em relaçªo ao vínculo genØtico matrilinear. Atualmente Ø possível purificar DNA de pra- ticamente qualquer fonte biológica, e o mesmo deverÆ estar íntegro e limpo para uso na biolo- gia molecular. Todavia, atualmente Ø simples utilizar RNA como objeto de estudo, transfor- mando-lo em cDNA por transcriçªo reversa e diretamente usando este alvo, em um procedi- mento denominado RT-PCR. Isso Ø obrigatório nas anÆlises de vírus de RNA, como HCV e HIV; em outros casos existe a opçªo entre usar os ti- pos de Æcido nuclØico. AlØm de requerer um pas- so enzimÆtico adicional, o manuseio de RNA Ø mais difícil e Ø necessÆrio trabalhar com amos- tras clínicas frescas. Por outro lado, toda ou a maioria da parte codificadora do gene Ø exami- nada numa só PCR. Mesmo assim, Ø comum que mutaçıes em um gene levem a transcritos mais instÆveis do que o normal, que refletirÆ na habili- dade da RT-PCR amplificar esses alelos (convØm lembrar que Ø estimado que 15% das mutaçıes clinicamente relevantes ocorrem nos íntrons e outras regiıes nªo-codificadoras dos genes). Um outro ponto pertinente se refere às ob- servaçıes de transcritos ilegítimos: foi a PCR que Fig. 13.1 Amplificaçªo exponencial de DNA-alvo. O trecho a ser amplificado Ø especificamente definido por um par de primers, cada um sendo incorporado no produto de PCR resultante. As duas fitas de DNA original sªo estendi- das alØm do primer oposto, mas, após alguns ciclos, o pro- duto da reaçªo predomina. HÆ sempre um excesso de primers em relaçªo o DNA-alvo. Note que na Figura estÆ mostrado uma molØcula de DNA-alvo dupla fita, enquanto numa reaçªo normal, haveria milhares de molØculas-alvo. DNA-alvo Ciclo 1 desnaturar e anelar primers Estender a partir dos primers Ciclo 2 desnaturar e anelar primers Estender a partir dos primers Ciclo 3 desnaturar e anelar primers Estender a partir dos primers 165 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 possibilitou a descoberta destas molØculas. A conclusªo Ø que, na maioria dos tecidos, hÆ ex- pressªo gŒnica da maioria dos genes, embora em níveis baixíssimos. A relevância deste fenô- meno para fisiologia humana permanece des- conhecida. PorØm, esses transcritos fornecem um acesso à anÆlise dos seus respectivos genes, in- dependentemente do tecido estudado. Em alguns casos esses transcritos ilegítimos foram amplifi- cados por RT-PCR para se obter informaçıes sobre mutaçıes nos genes em questªo. Todavia nªo foi estabelecido se esses transcritos fielmente refletem a situaçªo dos genes mutados. O produto da PCR pode ser submetido a vÆrios procedimentos e usado em diversas ma- neiras na medicina molecular, como mostrado na Fig. 13.2. Confirmaçªo da Presença/AusŒncia do Produto da PCR O produto da PCR normalmente possui um comprimento esperado que Ø visualizado após amplificaçªo atravØs de eletroforese em gel. A presença da banda no gel indica a existŒncia do DNA-alvo na amostra clínica original, enquanto sua ausŒncia confirma a nªo-existŒncia do DNA- alvo. As seguintes situaçıes exemplificam a gran- de utilidade deste procedimento na microbiologia clínica e na oncologia: O diagnóstico de tuberculose Ø confirmado pela cultura da bactØria responsÆvel, Myco- bacterium tuberculose, que normalmente leva de quatro a seis semanas para crescer em cultura in vitro. A PCR permite que este pas- so seja realizado em poucas horas. O diagnóstico de encefalite devido ao vírus herpes simplex deve ser feito o mais rÆpido possível para poder tratar com os antivirais e evitar a possível morte do paciente. Antes da PCR, esse diagnóstico era de difícil reali- zaçªo, tanto clinicamente quanto nos labo- ratórios. A detecçªo e o rastreamento de alguns tipos de tumores pelos genes, os quais sªo por eles Fig. 13.2 Os usos da PCR. As fontes de DNA-alvo para PCR sªo diversas, bem como as manipulaçıes posteriores do produto resultante. Se desoxinucleotídeos marcados (com radioisótopo ou com grupos fluorescentes) forem usados durante a amplificaçªo, o produto resultante tambØm ficarÆ marcado. RT significa transcriçªo reversa. As outras siglas sªo defini- das no texto que segue. RNA (mRNA de tecido, RNA de vírus) Purificar Pu rifi ca r, R T PCR Presença ou ausência do produto Comprimento do produto Uso do produto como sonda Análise doproduto usando: • digestão • ASO hybridization • extensão de primer • OLA e LCR • ensaio de nuclease 5’ • SSCP • análise de heterodúplex • DGGE • PTT • seqüenciamento direto DNA (genômico, mitocondrial, produto de PCR) 166 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 expressos. O fenótipo tumoral Ø associado com a ativaçªo e desativaçªo anormal de muitos genes. Melanoma e adenocarcinoma da próstata sªo cânceres nas quais sªo ati- vados genes que normalmente permanecem silenciosos que entªo produzem transcritos e produtos protØicos em quantidade aumen- tada e portanto detectÆvel; esses sªo a tiro- sinase e a PSA (prostate-specific antigen), respectivamente. Esses transcritos podem ser detectados no sangue após RT-PCR e usados tanto para confirmar o diagnóstico, quanto para o seguimento dos pacientes após a ci- rurgia e/ou radioterapia realizadas para ex- tirpar o tumor primÆrio. RT-PCR Ø usada rotineiramente para ampli- ficar o produto de fusªo entre o gene ABL e parte do gene BCR quando hÆ a transloca- çªo cromossômica t(9:22) em leucemia mielóide crônica. Desta maneira uma cØlula leucŒmica pode ser detectada entre 106 cØ- lulas normais da medula óssea. Esta meto- dologia Ø œtil no acompanhamento de pacientes que fizeram transplante da medu- la óssea para detectar uma recorrŒncia das cØlulas neoplÆsticas pós-operatória. A exfoliaçªo de cØlulas tumorais em urina (no caso de câncer de bexiga) e em fezes (no caso de câncer do pâncreas e do colo intestinal) pode ser acompanhada por PCR. Nessas situaçıes, o nœmero de cØlulas tu- morais representa uma fraçªo pequena de todas as cØlulas presentes e a PCR Ø realiza- da de um modo para seletivamente enrique- cer o DNA mutante. Para isso, primers sªo utilizados para que introduzam um sítio de restriçªo quando uma seqüŒncia normal Ø am- plificada, mas nªo quando a seqüŒncia Ø mu- tante; a base deste princípio Ø discutida no item Digestªo com enzima de restriçªo. Após PCR, os amplicons sªo tratados com a respectiva enzima de restriçªo; um enrique- cimento de duas ordens de magnitude Ø con- seguido dessa maneira. Os produtos de PCR sobrando sªo novamente submetidos a uma segunda amplificaçªo para aumentar o sinal. Obviamente, esta abordagem pressupıe co- nhecimento da mutaçªo em questªo, e foi aplicada a mutaçıes no gene K-ras em cân- ceres do trato digestivo. A utilizaçªo de rigorosos controles em to- dos os passos laboratoriais Ø imprescindível neste tipo de ensaio, a fim de que sejam evitados re- sultados falso-positivos ou falso-negativos. No laboratório, vÆrios cuidados devem ser adota- dos para evitar a contaminaçªo das PCRs: no mínimo, o espaço onde as amostras sªo recebi- das e preparadas deve ser fisicamente separado daquele onde a amplificaçªo Ø feita. O uso de ponteiras que nªo permite que um aerossol da soluçªo que estÆ sendo manipulado entre nos pipetadores, em si, Ø recomendado. AlØm disso, Ø possível utilizar dUTP em vez de dTTP na PCR, cujo produto resultante pode ser clonado e ana- lisado normalmente. PorØm, DNA de fita sim- ples ou dupla contendo esta base Ø degradado pela enzima uracil N-glicosilase (UNG) e os polinucleotídeos resultantes nªo conseguem mais participar da amplificaçªo. Sendo assim, UNG estÆ presente na fase prØ-PCR para remover qual- quer produto sobrando de amplificaçıes ante- riores; ao iniciar a PCR, UNG Ø desativada pelo aumento na temperatura e a PCR prossegue nor- malmente. Uma variante mais moderna deste ensaio con- siste no monitoramento em tempo real do apareci- mento do produto da PCR durante a amplificaçªo, dispensando sua eletroforese posterior. Se um dos primers for fluorescente, o produto resultante tam- bØm serÆ fluorescente e o aumento desta fluores- cŒncia pode ser monitorado durante a ciclagem. Este princípio serÆ discutido posteriormente no item Monitoramento do aparecimento do produto da PCR em tempo real. Uma extensªo deste ensaio leva à PCR quan- titativa que se utiliza da natureza exponencial da amplificaçªo, tal que o grau da amplificaçªo seja proporcional à quantidade do DNA-alvo presente na amostra inicial. Usando DNA-alvo controle de quantidade conhecida, Ø possível construir uma curva-padrªo que permite inferir a quanti- dade de DNA-alvo nas amostras clínicas. Este tipo de ensaio Ø usado rotineiramente na quan- tificaçªo do vírus HIV no sangue dos pacientes infectados por ele. A PCR monitorada em tem- po real facilita ainda mais esta quantificaçªo, como descrito no item Monitoramento do apa- recimento do produto da PCR em tempo real. A visualizaçªo da presença ou ausŒncia do produto da PCR Ø tambØm usada para revelar a existŒncia de mutaçıes específicas na DNA-alvo. O princípio desta metodologia se baseia no fato de que, se a œltima base do primer no seu extre- 167 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 mo 3 nªo estiver pareada com a base comple- mentar no DNA-alvo, nªo ocorrerÆ extensªo pela polimerase. Portanto pode-se utilizar um pri- mer cuja sua œltima base 3 hibridiza com uma base do alvo, sofrendo uma mutaçªo pontual co- nhecida. Neste caso, a amplificaçªo nªo prosse- guirÆ, como ilustrado na Fig. 13.3. É costume usar dois pares de primers nes- te tipo de ensaio para aumentar a certeza do resultado: um par que permite a amplificaçªo da seqüŒncia normal, mas nªo da mutaçªo, e um outro em que um dos primers anela na mu- taçªo, permitindo sua amplificaçªo, mas nªo a amplificaçªo da seqüŒncia normal. Na prÆti- ca, um dos primers dos dois pares Ø o mesmo. Existem kits comerciais que utilizam esta es- tratØgia, denominada ARMS (amplification re- fractory mutation system) ou PASA (PCR amplification of specific alleles), para detec- tar uma sØrie de mutaçıes conhecidas em ge- nes causadores de doenças genØticas mais freqüentes. Nestes kits, vÆrios produtos de PCR sªo ne- cessÆrios para realizar esta genotipagem, e Ø co- mum amplificar mais de um produto na mesma PCR. Nesta PCR multiplex, existem exemplos em que 15 produtos diferentes sªo amplificados simultaneamente no mesmo tubo, para serem se- parados por eletroforese posteriormente. Nªo obstante, montar uma PCR multiplex dessa com- plexidade requer bastante tentativa e erro, pois, alØm de todas as temperaturas de anelamento dos primers precisarem ser semelhantes, a con- centraçªo de cada primer tem que ser alterada individualmente quando um novo par de primers for introduzido na reaçªo. Fig. 13.3 PCR alelo-específico. O painel superior mostra a competŒncia da DNA polimerase estender a partir do primer quando suas bases 3 forem parcialmente pareadas. O painel inferior mostra como isto Ø aproveitado para seletiva- mente amplificar, em PCR alelo-específico, regiıes contendo variantes usando trŒs primers diferentes. Primer 1 Ø comum nas duas reaçıes. Primer 2 anela completamente na seqüŒncia normal mas nªo na seqüŒncia variante pela sua base 3, enquanto o inverso Ø o caso para o primer 3. Após PCR, os produtos sªo visualisados em gel após eletroforese. VÆrios alvos podem ser amplificados simultaneamente em PCR multiplex. Pareamento completo Extensão máxima Extensão mínima Nenhuma extensão Extensão razoável Última base 3’ não-pareada 5’ 3’ Últimas duas bases 3’ não-pareadas Penúltima base 3’ não-pareada 1 1 1 1 2 2 3 3 REAÇÃO PARA O ALELO VARIANTE Base normal Base normal Base variante Base variante Amplificação por PCR Amplificação por PCR Não há amplificação Não há amplificação REAÇÃO PARA O ALELO NORMAL 168 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 AnÆlise do Produto da PCR pelo seu Comprimento HÆ situaçıes em que pacientes possuem lo- cos no seu DNA genômico que sªo menores ou maiores do que normal. AlØm disso, todos indiví- duospossuem locos polimórficos onde o polimor- fismo Ø devido a uma sØrie de repetiçıes de bases, exemplificado pelos microssatØlites (STRs: short tandem repeats) e os minissatØlites (VNTRs: va- riable number of tandem repeats); veja o Capítulo 11. Estes locos sªo analisÆveis usando PCR para amplificar os locos em questªo e medir o compri- mento dos produtos resultantes. Mutaçıes causadas por pequenas deleçıes ou inserçıes no DNA sªo detectÆveis por PCR. A mutaçªo DF508 no gene CFTR compıe uma deleçªo de 3bp e Ø a principal mutaçªo causa- dora da doença genØtica recessiva fibrose císti- ca, presente aproximadamente em 70% dos pacientes no norte da Europa, e em 40% dos afetados no Brasil. O ensaio mais usado para identificar essa lesªo envolve uma PCR da re- giªo genômica contendo a mutaçªo que normal- mente resulta em um produto de 98bp. Na presença da deleçªo o produto possui 95bp. As duas possíveis bandas sªo visualizadas após ele- troforese em gel de poliacrilamida, onde sempre Ø aconselhÆvel incluir um indivíduo heterozigo- to para interpretar os resultados com maior se- gurança. HÆ vÆrias doenças neurológicas e neuro- musculares causadas pela expansªo de trincas de bases dentro dos genes e quando a expansªo ultrapassa um determinado limite, a funçªo do gene Ø perdida (Tabela 13.1). A PCR Ø a ferramenta ideal para investigar essas doenças, bastando somente fazer uma am- plificaçªo da regiªo genômica contendo as trin- cas e observando se o tamanho do produto re- sultante Ø anormalmente maior que esperado. PorØm, a expansªo de CGG no gene FMR1 exem- plifica bem algumas das limitaçıes da PCR e al- gumas das soluçıes usadas para contornÆ-las. Indivíduos normais possuem em mØdia 29 repetiçıes de CGG no gene FMR1, enquanto pacientes com a síndrome podem ter milhares dessas repetiçıes e, nestes casos, o alvo nªo Ø amplificÆvel. Mesmo assim, regiıes contendo um alto conteœdo de G e C como essas sªo difíceis de amplificar devido à tendŒncia das fitas de DNA se reanelarem nas temperaturas usadas. Para re- produtivelmente amplificar esses alelos (CGG)15 a (CGG)300, as seguintes modificaçıes sªo in- troduzidas na PCR: Assegurar a desnaturaçªo das fitas de DNA, aquecendo-as a 95°C durante 10 minutos e iniciando a amplificaçªo neste ponto. Utilizar DMSO 50% na reaçªo (outros com- postos incluem betaine e trimetil cloreto de amônia). Utilizar o desoxinucleotídeo modificado 7- deaza-2·-dGTP na razªo para dGTP de 0,75:0,25, em vez de 100% dGTP. Utilizar Pfu polimerase em vez da conven- cional Taq polimerase. Isso mostra que as polimerases sªo capazes de introduzir bases modificadas durante a síntese de DNA. Desta maneira Ø possível gerar produ- tos da PCR marcados com grupos moleculares, os quais permitem que os produtos sejam usa- dos em outras situaçıes, como descrito posteri- ormente. A amplificaçªo de locos polimórficos se tor- nou rotineira na identificaçªo humana e animal, bem como na investigaçªo de vínculo genØtico Tabela 13.1 Doenças Causadas pela Expansªo de Trincas de Bases Doença Gene e sua Localizaçªo Trinca que Cromossômica Expande Síndrome de X-frÆgil FMR1: Xq27 CGG Doença de Huntington Huntingtina: 4p16 CAG Ataxia espinho-cerebelar tipo I SCA1: 6p22 CAG Distrofia miotônica Miotonina: 19q13 CTG 169 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 nessas espØcies. As STRs sªo os locos genØticos mais usados atualmente. Estes locos tambØm sªo extremamente importantes para o mapeamento de genes defeituosos nas famílias que os trans- mitem, bem como nos projetos-genoma, onde mapas dos genomas sªo gerados atravØs de es- tudos de ligaçªo genØtica. AlØm disso, em alguns tipos de cânceres (por exemplo, câncer nªo-poli- pose do colo intestinal) esses locos demonstram instabilidade no tumor, o que jÆ indica a presen- ça de genes defeituosos (hMLH1, hMSH2), que sªo responsÆveis pelo reparo de DNA na cØlula. Quando ocorre perda de heterozigose no tumor, esses locos sªo ideais para expor esse fato, com- parando os alelos de alguns locos de uma regiªo cromossômica no tumor e em tecido normal. Existem milhares desses locos de STRs ao longo do genoma humano, que podem ser emprega- dos desta maneira. Nestes casos, os alelos dos locos sªo comu- mente amplificados usando um par de primers onde um deles Ø marcado com um grupo fluo- rescente no seu tØrmino 5. Os alelos amplifica- dos sªo fluorescentes e sªo fracionados durante eletroforese em gØis desnaturantes de poliacrili- maida. Os alelos podem ser visualizados por ins- trumentos que varrem o gel para detectar a fluorescŒncia durante ou após a eletroforese. Com a disponibilidade de quatro grupos fluo- rescentes diferentes, que foram desenvolvidos para os seqüenciadores automÆticos de DNA, Ø possível visualizar alelos de locos genØticos dis- tintos, embora com tamanhos iguais na mesma posiçªo do gel. Por esse motivo, esses mesmos seqüenciadores de DNA sªo usados para ler os genótipos dos indivíduos estudados. Quando os alelos a serem distinguidos dife- rem por duas ou trŒs bases em tamanho entre um e os outros, Ø necessÆrio ficar atento para um fenômeno que pode atrapalhar a leitura cor- reta dos tamanhos: Ø comum a polimerase acres- centar um nucleotídeo adicional (quase sempre um A) no tØrmino 3 do produto a ser gerado embora nªo exista esta base no alvo. Nªo exis- tem regras claras que permitem a prediçªo desta ocorrŒncia, mas Ø possível minimizÆ-la: Prolongando o œltimo passo de extensªo a 72°C para 30-60 minutos. Acoplando uma molØcula especial no tØrmi- no 5 do outro primer do par para impedir esta adiçªo. AnÆlise do Produto da PCR por Outras Metodologias Crescentemente um dos objetivos na medi- cina molecular Ø a caracterizaçªo de mutaçıes ou polimorfismos no DNA genômico (ou em mRNA) e sua correlaçªo com prognósticos. Isso Ø realizado em trŒs níveis: No nível populacional com objetivo de en- contrar mutaçıes ou polimorfismos para efeitos de screening genØtico, para prevenir as doenças genØticas mais comuns. No nível de famílias transmitindo doenças hereditÆrias, para definir a mutaçªo respon- sÆvel e prestar aconselhamento genØtico, bem como o diagnóstico prØ-natal ou mesmo prØ- implantaçªo, como discutido no item PCR no diagnóstico genØtico prØ-implantaçªo (DGP), de doenças monogŒnicas. No nível de tumores onde as mutaçıes nos oncogenes ou genes supressores de tumor sªo caracterizadas. Essa Ø uma Ærea promissora, dado que os primeiros estudos, realizados com o gene p53 e câncer de mama, tŒm de- monstrado que existe correlaçıes entre a po- siçªo no gene de algumas mutaçıes e o comportamento do tumor nos pacientes; isso influi no tratamento que as pacientes deve- rªo receber, por exemplo, se radioterapia ou quimoterapia Ø mais indicada. AlØm disso, os estudos moleculares complementam as anÆ- lises histopatológicas do tecido tumoral; no caso da p53, que Ø quantificada por imuno- histologia, os estudos moleculares fornecem informaçıes adicionais quando o primeiro tem resultado negativo. A anÆlise de produto de PCR para esse fim tem se desenvolvido muito nos œltimos tempos, tal que existem vÆrias opçıes. No entanto, Ø im- portante distinguir entre metodologias que bus- cam alteraçıes definidas, que entªo fazem o diagnóstico, e aqueles que varrem o produto bus- cando alteraçıes desconhecidas; nessa œltima, o produto terÆ de ser analisado mais para caracte- rizar a alteraçªo especificamente. Em virtude do maior volume de exames efetuado, ensaios di- agnósticos deverªo: Ser rÆpidos e baratos. Ser realizadas por automaçªo. Ser 100% eficazes. Evitar o uso de radioisótopos e reagentes tóxicos. 170 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 MØtodos Diagnósticos DIGESTˆO COM ENZIMA DE RESTRI˙ˆO Se um polimorfismo ou mutaçªoaltera o DNA-alvo e cria ou destrói um sítio de restri- çªo, essa alteraçªo pode ser detectada usando a enzima de restriçªo em questªo. Portanto este ensaio consiste em amplificar por PCR a regiªo do DNA-alvo que contØm a alteraçªo, digerin- do-a com a enzima e analisando os fragmentos resultantes por eletroforese em gel. É bastante desejÆvel que o alvo amplificado inclua um sítio de restriçªo constante que sirva como controle da açªo da enzima, se nªo um outro tipo de con- trole terÆ de ser usado. Uma outra desvantagem desta abordagem Ø que, freqüentemente, a alte- raçªo nªo modifica sítios de restriçªo e, por esse motivo, as estratØgias da ARMS (vide supra) e de ARIP (vide infra) sªo mais versÆteis. AN`LISE DE RESTRI˙ˆO INTRODUZIDA POR PRIMER (ARIP) Aqui uma base que nªo pareia Ø incorpora- da no primer, sendo situada próximo ao sítio da mutaçªo. A regiªo incluindo a mutaçªo Ø ampli- ficada por PCR e o produto resultante Ø digeri- do por uma enzima de restriçªo apropriada. A combinaçªo da alteraçªo no primer e daquela no sítio da mutaçªo cria um novo sítio de restriçªo, como mostrado na Fig. 13.4. Esta abordagem pode ser utilizada para criar um novo sítio de restriçªo, tanto no alelo nor- mal quanto no alelo mutado. Em alguns casos nªo Ø possível criar um novo sítio de restriçªo perto da mutaçªo. AlØm disso, uma outra des- vantagem Ø que a diferença em tamanho entre o produto de PCR nªo digerido e digerido Ø pe- quena, sendo em torno do tamanho do primer e, por esse motivo, o tamanho do produto terÆ de ser inferior a 300bp. HIBRIDIZA˙ˆO COM OLIGONUCLEOT˝DEOS ALELO-ESPEC˝FICOS (ASO: ALLELE SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE HYBRIDIZATION OU DOT-BLOT) O produto de PCR Ø fixado numa membrana e hibridizado com oligonucleotídeos marcados que anelarªo somente se a seqüŒncia comple- mentar estiver presente nas condiçıes da hibri- dizaçªo. Oligonucleotídeos que detectam a se- qüŒncia normal e a seqüŒncia mutante sªo usa- dos. Para cada mutaçªo diferente uma hibridizaçªo nova Ø necessÆria. A dificuldade ex- perimental Ø acertar as condiçıes de hibridiza- çªo e lavagem para cada oligonucleotídeo, porØm Ø uma metodologia œtil para procurar um nœme- ro pequeno de mutaçıes definidas em um gran- de nœmero de amostras. No sistema inverso (reverse dot blot) quan- do o produto de PCR marcado Ø usado como sonda para hibridizar com oligonucleotídeos contendo as seqüŒncias de interesse fixados numa membrana, vÆrias mutaçıes ou polimor- fismos conhecidos podem ser buscados simul- taneamente a partir de um produto de PCR. Isso Ø utilizado para procurar as mutaçıes mais co- muns causadoras de fibrose cística e para realizar a tipagem dos alelos no sistema HLA humano. Um exemplo Ø mostrado na Fig. 13.5. Obvia- mente o produto de PCR deve hibridar com to- dos os oligonucleotídeos com igual eficiŒncia nas mesmas condiçıes, a fim de se obter um resultado confiÆvel. EXTENSˆO DO PRIMER POR NUCLEOT˝DEO ÚNICO Um primer Ø anelado em um produto de PCR, adjacente à posiçªo de uma mutaçªo ou polimorfismo conhecida: a DNA polimerase Ø utilizada para acrescentar um nucleotídeo adi- cional no tØrmino 3 do primer, dependendo da presença ou nªo da alteraçªo. O nucleotídeo adi- cionado Ø marcado com radioatividade ou com fluorescŒncia e, portanto, a reaçªo pode ser quan- tificada em termos da incorporaçªo da marca- çªo, nªo necessitando eletroforese em gel. Normalmente duas reaçıes paralelas sªo feitas: uma com nucleotídeo marcado que seja com- plementar à base normal, e outra onde ele seja complementar à base presente na alteraçªo. Ho- mozigotos sªo identificados por incorporaçªo em somente uma das reaçıes, enquanto heterozigo- tos tŒm incorporaçªo nas duas reaçıes. É con- veniente realizar os passos em fase sólida: o produto da PCR contendo a regiªo de interesse Ø acoplado, via uma das fitas que possui o grupo biotina, a uma superfície de estreptavidina, co- mumente em placas de microtitulaçªo. A fita complementar Ø removida e o primer a ser es- tendido Ø anelado. O nucleotídeo marcado Ø in- troduzido junto com a DNA polimerase para 171 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 Fig. 13.4 AnÆlise de restriçªo introduzida por primer. Um dos primers usados na PCR contØm uma base alterada em relaçªo a seqüŒncia do DNA-alvo complementar. O produto resultante da amplificaçªo da seqüŒncia variante possui um sítio de restriçªo, enquanto aquele resultante da seqüŒncia normal nªo possui este sítio. Esta Ø a abordagem inicial descrita para detectar o polimorfismo G20210A no gene da protrombina que leva a efeitos clínicos. Fig. 13.5 Reverse dot-blot. Cinco mutaçıes no gene CFTR causadoras da fibrose cística sªo detectadas neste exemplo. Produtos de PCR diferentes e marcados (normalmente com radioisótopo ou com biotina), correspondendo às posiçıes das mutaçıes no gene, sªo gerados e hibridizados aos oligonucleotídeos fixados na membrana. Para assegurar a hibridizaçªo homogŒnea de todos os produtos com todos os oligonucleotídeos, Ø necessÆrio utilizar tetrametil cloreto de amônia (TMAC) na soluçªo. Os oligonucleotídeos sªo fixados na membrana atravØs de caudas de poli-dT para que eles sejam mais disponíveis para anelamento. É comum ter que variar a quantidade de cada oligonucleotídeo fixado na membrana para se obter sinais de hibridizaçªo uniformes no fim do procedimento. Este sistema Ø um precursor dos chips de hibridizaçªo descritos no item Chips e seqüenciamento por hibridizaçªo. SEQÜÊNCIA NORMAL SEQÜÊNCIA VARIANTE Amplificar por PCR Não há digestão Digerir com enzima de restrição Hind III Produtos de digestão 5’ 5’3’ 3’ Oligonucleotídeo mutante Oligonucleotídeo normal D F50 8 G55 1D N13 03K G54 2X R11 7H Oligonucleotídeos fixados em membrana de náilon Hibridizados com produtos de PCR Normal Heterozigoto composto N1303K/ D F508 Heterozigoto normal/G542X Homozigoto D F508 172 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 efetuar a extensªo, sendo tal a incorporaçªo medida posteriormente. Estes passos sªo diagra- mados na Fig. 13.6. Esta tØcnica permite a de- tecçªo de alelos que estªo presentes com freqüŒncias menores que 50%; como exemplo, foi utilizado com sucesso para detectar mutaçıes (no códon 12 de K-ras) presentes em tumores onde cØlulas mutantes ocorrem numa fraçªo de 0.05% em relaçªo às cØlulas normais. OLA (OLIGONUCLEOTIDE LIGATION ASSAY: ENSAIO DE LIGA˙ˆO DE OLIGONUCLEOT˝DEO) E LCR (LIGASE CHAIN REACTION: REA˙ˆO EM CADEIA DE LIGASE) O princípio do OLA tem por base a obser- vaçªo de que, quando dois oligonucleotídeos estªo anelados na mesma fita de DNA e perfei- tamente justapostos, eles podem ser ligados pela enzima DNA-ligase. Uma base nªo-pareada na junçªo entre os dois oligonucleotídeos Ø sufi- ciente para impedir essa ligaçªo. Na prÆtica, o ensaio utiliza dois oligonucleotídeos marcados e mede a formaçªo de uma molØcula œnica criada pela açªo da ligase. As duas molØculas hibridizam em um produto de PCR produzido para fornecer a regiªo de interesse. Como ilus- trado num exemplo da Fig. 13.7, um dos oligo- nucleotídeos Ø marcado com um fluoróforo no seu tØrmino 3 enquanto o outro possui no bio- tina seu extremo 5. Se os dois oligonucleotídeos forem ligados pela ligase, uma œnica molØcula fluorescente Ø gerada, a qual pode ser captada por uma su- perfície de estreptavidina (em um poço de uma placa de microtitulaçªo). Caso contrÆrio, o oli- gonucleotídeo fluorescente Ø removido por la- vagem. Quando dois fluoróforos diferentes sªo usados, um acoplado no oligonucleotídeo com- plementar à seqüŒncia normal e o outro com- plementar à seqüŒncia mutante, somente uma reaçªo Ø feita e um controle interno da reaçªo estÆ presente. Sendo assim, OLA Ø uma meto- dologia ideal para lidar com grandes volumes de testes comsistemas automatizados. LCR representa uma modificaçªo do OLA. Aqui hÆ amplificaçªo dos oligonucleotídeos li- gados devido a ciclos repetidos de desnatura- çªo, anelamento dos oligonucleotídeos e ligaçªo usando uma DNA ligase termoestÆvel. Ao con- trÆrio da PCR, nªo hÆ síntese nova de DNA. Na LCR, seis oligonucleotídeos sªo necessÆ- rios: dois para cada fita-alvo e mais dois que detectam a seqüŒncia variante, como mostrado na Fig. 13.8. O aumento do produto da LCR Ø exponen- cial, como na PCR. Portanto, na LCR hÆ am- plificaçªo e anÆlise combinadas em um passo, enquanto na PCR seguido de OLA, dois passos sªo necessÆrios. AlØm disso, LCR exibe algu- mas dificuldades específicas: a principal Ø a li- gaçªo alvo-independente que pode servir como alvo nos ciclos seguintes, resultando em um resultado falso-positivo. Este fenômeno Ø de- terminado mais pela concentraçªo dos oligo- nucleotídeos presentes. SEQÜENCIAMENTO DO PRODUTO DE PCR Veja item Seqüenciamento de DNA na me- dicina nuclear. MONITORAMENTO DO APARECIMENTO DO PRODUTO DA PCR EM TEMPO REAL Duas metodologias semelhantes sªo usadas: Ensaio de Nuclease 5 A atividade 5fi 3 exonuclease da Taq poli- merase Ø aproveitada para remover um oligonu- cleotídeo especial, ou sonda, situado entre os dois primers de amplificaçªo. A sonda Ø marcada com dois grupos fluorescentes diferentes: um deles (quencher) oculta a fluorescŒncia do segundo (reporter) pela proximidade entre ambos. A son- da tambØm possui seu tØrmino 3 fosforilado, o que impede que ela atua como primer. Quando os dois grupos na sonda sªo separados pela açªo 5 fi 3 exonuclease da polimerase, a fluorescŒn- cia do reporter Ø desmascarada, o que reflete a amplificaçªo ocorrida especificamente do pro- duto em questªo, como mostra a Fig. 13.9. A fluorescŒncia Ø estimulada (por laser) e medida durante a amplificaçªo, necessitando um termociclador modificado para tal. O gran- de impacto dessa metodologia na medicina molecular serÆ na Ærea de PCR quantitativa, e o nœmero de molØculas de DNA-alvo no iní- cio da amplificaçªo poderÆ ser determinado sem a realizaçªo de outros procedimentos pós- 173 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 PCR e que, portanto, Ø idealmente apropriado para automaçªo. AlØm disso, a disponibilida- de de vÆrios grupos fluorescentes permite a realizaçªo de PCR multiplex e, dessa forma, a possibilidade de incluir controles internos. PorØm essa metodologia pode ser adaptada para detecçªo de mutaçıes conhecidas, ba- seando-se nas tØcnicas descritas aqui, como ARMS, por exemplo. Ou seja, nªo seria ne- cessÆrio realizar eletroforese após a PCR, e os dois possíveis alelos numa amostra podem ser detectados simultaneamente com o uso de fluo- róforos diferentes. FARÓIS MOLECULARES (MOLECULAR BEACONS) Este ensaio Ø semelhante ao anterior em- bora ele nªo utilize a atividade exonuclease da polimerase; ele requer um termociclador modi- ficado. As sondas nesse caso tambØm possuem um grupo quencher e reporter em cada extremo do oligonucleotídeo, mas este, no início do en- saio, Ø dobrado sobre si, formando um laço com uma haste, aproximando os dois grupos que, conseqüentemente, nªo emitem fluorescŒncia. Durante a PCR, a sonda abre-se e hibridiza-se especificamente com o produto que estÆ sendo gerado, e passa a emitir fluorescŒncia propor- cional ao nœmero de amplicons presentes, como apresentado na Fig. 13.10. Se nªo houver am- plicons suficientes, os faróis moleculares reas- sumem sua conformaçªo original rapidamente quando a temperatura diminui durante a cicla- gem, atØ o ciclo seguinte. Esta tØcnica foi mais aplicada a genotipagem em tempo real em vez da quantificaçªo da amplificaçªo da PCR. O uso simultâneo de vÆrios fluoróforos numa PCR mul- tiplex permite a genotipagem de diferentes va- riantes ao mesmo tempo, de uma maneira sujeita à automatizaçªo. Fig. 13.6 Extensªo do primer por nucleotídeo œnico. Esta metodologia Ø tambØm denominada minisseqüenciamento. O produto de PCR biotinilado Ø transferido para uma placa de microtitulaçªo cujos poços possuem uma camada de estreptavidina para captar a molØcula amplificada. Esta molØcula Ø desnaturada usando hidróxido de sódio e a fita nªo presa Ø removida por lavagem. Um terceiro primer anela na fita restante e Taq polimerase Ø usada para acrescentar uma œnica base se existir pareamento da œltima base 3· do primer. Lavagem Ø feita para remover o nucleotídeo nªo-incorpora- do e o primer Ø desligado usando hidróxido de sódio e quantificado. Para cada variante sendo analisada, duas extensıes correspondentes sªo realizadas. Amplificação por PCR usando um primer biotinilado Estensão pela polimerase incorporando nucleotídeo marcado Captação por estreptavidina Remoção de uma fita Anelamento do terceiro primer Desligamento e quantificação do primer marcado A A 174 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 Fig. 13.7 OLA (oligonucleotide ligation assay). Os oligonucleotídeos marcados sªo anelados no produto de PCR. O oligonucleotídeo do lado direito possui um fluoróforo no seu tØrmino 3 e Ø comum para as duas situaçıes mostradas; este oligonucleotídeo Ø fosforilado no seu tØrmino 5·. O oligonucleotídeo do lado esquerdo, que Ø biotinilado no seu extremo 5·, ou anela completamente com o alvo, ou anela incompletamente, tendo seu tØrmino 3 nªo pareado. Na primeira situaçªo, a enzima DNA ligase Ø capaz de ligar de maneira covalente (usando ATP como substrato) as duas molØculas, criando uma nova molØcula, enquanto na segunda isto nªo ocorrerÆ. Após desnaturaçªo, a nova molØcula Ø capturada numa superfície de estreptavidina e quantificada atravØs do fluoróforo presente nela. Fig. 13.8 LCR (ligase chain reaction). Os oligonucleotídeos assinalados por asteriscos sªo aqueles em comum, enquan- to os quatro restantes detectam a seqüŒncia normal e a seqüŒncia variante. Somente quando um par de oligonucleotídeos estiver completamente anelados ao alvo Ø que ocorrerÆ a ligaçªo cíclica com aumento exponencial do produto da LCR. OLIGONUCLEOTÍDEO NÃO PAREADO NO TÉRMINO 3’ OLIGONUCLEOTÍDEO PAREADO Usar DNA ligase Capturar com estreptavidina Sinal ausente Sinal presente Biotina Fluoróforo OLIGONUCLEOTÍDEOS COMPLETAMENTE ANELADOS OLIGONUCLEOTÍDEOS INCOMPLETAMENTE ANELADOS Ligar e repetir 25 a 30 vezes Anelamento ao alvo desnaturado Ligase termoestável Desnaturar e anelar oligonucleotídeos 175 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 simplicidade de implantaçªo. PorØm, ela possui duas desvantagens importantes: o produto da PCR nªo deve ultrapassar uns 250bp, e a sua sensibili- dade Ø em torno de 50-95% para detectar as alte- raçıes comumente vistas no DNA genômico. O produto da PCR em questªo terÆ de ser seqüen- ciado posteriormente para identificar a alteraçªo. HA (HETERODUPLEX ANALYSIS) TambØm Ø uma tØcnica de varredura para de- tectar alteraçıes desconhecidas que existem em heterozigose nas regiıes estudadas. Aqui, o prin- cípio da tØcnica se baseia no fato de que fitas sim- ples de DNA com seqüŒncias diferentes se re-anelam após desnaturaçªo, e fitas duplas de DNA híbridas formadas migram com velocida- des anômalas durante eletroforese em gØis nªo- desnaturantes, como ilustrado na Fig. 13.12. Apesar de sua simplicidade, estudos recen- tes tŒm demonstrado que esta metodologia Ø superior à SSCP em detectar alteraçıes desco- nhecidas no DNA-alvo, com uma sensibilidade de 80% a 100%. O produto da PCR deve ficar inferior a 1.000bp. O produto da PCR em ques- tªo terÆ de ser seqüenciado posteriormente para definir a alteraçªo. DGGE (GENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS) É uma tØcnica de varredura para detectar al- teraçıes no DNA-alvo, com uma sensibilidade de quase 100% para produtosde PCR de tama- nho entre 100 e 500bp. A tØcnica permite a se- paraçªo de fragmentos de DNA que se diferem por um par de bases entre si. Esta separaçªo ocorre por causa das diferenças nas temperatu- ras de separaçªo das fitas das molØculas nor- mais e mutantes. Quando esses fragmentos migram no gel por eletroforese, eles encontram uma concentraçªo crescente de desnaturante (urØia, formamida); ao serem expostos a um ní- vel crítico de desnaturante, a fitas começam a se separar, entªo reduzindo significativamente sua mobilidade. O ponto no qual a mobilidade dimi- nui serÆ diferente para a molØcula normal e a mutante, como indicado na Fig. 13.13. O comportamento de molØculas de DNA em gØis DGGE pode ser modelado em computado- res e, portanto, a identificaçªo de mutaçıes em um dado fragmento pode ser prevista com con- Fig. 13.9 Ensaio de nuclease 5·. Na PCR estÆ presente uma sonda composta de um oligonucleotídeo contendo um fluoróforo R (reporter) no seu tØrmino 5· e um grupo apa- gador Q (quencher). Nesta situaçªo o grupo Q impede que o fluoróforo R emita fluorescŒncia. Esta sonda anela entre os dois primers de amplificaçªo em uma das duas fitas de DNA e Ø deslocada e digerida pela açªo 5·fi 3· exonucle- olítica da Taq polimerase que se aproxima. O fluoróforo passa a fluorescer quando for afastado do grupo Q, refle- tindo o progresso da amplificaçªo. MØtodos de Varredura SSCP (SINGLE STRAND CONFORMATION ANALYSIS) Ao contrÆrio das metodologias anteriores, esta nªo pressupıe a existŒncia de uma alteraçªo es- pecífica no produto amplificado e, portanto, Ø uma tØcnica de varredura para detectar alteraçıes des- conhecidas que existem em heterozigose nas re- giıes estudadas. O princípio da tØcnica se baseia no fato de que fitas simples de DNA com seqüŒn- cias diferentes enovelam de maneiras diferentes e migram com velocidades distintas em condiçıes apropriadas de eletroforese. Os dois produtos da PCR, um deles contendo uma alteraçªo, sªo des- naturados e submetidos à eletroforese em gØis nªo-desnaturantes, como ilustrado na Fig. 13.11. Essa metodologia Ø bastante usada devido à sua Digestão da sonda Extensão a partir do primer pela Taq polimerase Deslocamento da fita da sonda Clivagem da sonda 176 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 fiança. No entanto, por esse mesmo motivo, as condiçıes sªo diferentes para cada produto sen- do estudado, o que impede uma implantaçªo padronizada no laboratório clínico. Alteraçıes em DNA homodœplex e heterodœplex sªo detec- tadas nessa metodologia. PorØm, alguns equi- pamentos especializados sªo necessÆrios para realizar este procedimento. O produto da PCR em questªo terÆ de ser seqüenciado posterior- mente para determinar a alteraçªo. CLIVAGEM DE MISMATCH POR RIBONUCLEASE Um local numa fita dupla de RNA×RNA ou RNA×DNA onde existe uma base ou bases nªo- pareadas Ø suscetível a clivagem pela enzima RNase A. Isso forma a base de um ensaio para detectar variantes no produto de PCR quando hibridizado com uma fita de RNA complemen- tar, com seqüŒncia normal, marcada radioativa- mente ou com fluorescŒncia. Os produtos da clivagem sªo entªo fracionados por eletrofore- se, dando uma indicaçªo da posiçªo da discre- pância no produto de PCR. Mutaçıes em mRNA podem ser identificadas usando o mesmo prin- cípio quando hibridizados com um produto de PCR normal. Produtos de PCR tendo kilobases em tamanho podem ser examinados desta ma- neira e a taxa de detecçªo Ø em torno de 75%. As desvantagens incluem a dificuldade em pre- parar o RNA marcado e a manipulaçªo da amos- tra após tratamento com RNase. O produto da PCR em questªo terÆ de ser seqüenciado poste- riormente para estabelecer a alteraçªo. CLIVAGEM QU˝MICA DE MISMATCH Este mØtodo depende do uso de dois com- postos químicos em duas amostras do hetero- duplex formado entre o DNA mutante e o DNA normal. Um deles, hidroxilamino, reage com bases C nªo-pareadas, enquanto o outro, tetró- xido de ósmio, reage com bases T nªo-parea- das. As duas fitas do DNA normal devem estar presentes para fornecer as bases A e G que for- mam as molØculas heteroduplex quando houver Fig. 13.10 Faróis moleculares. O painel superior mostra como o farol molecular passa a emitir fluorescŒncia quando ele hibridiza com o DNA-alvo que Ø o produto de PCR sendo gerado. Quando fechado, o fluoróforo R (reporter) estÆ adjacente ao grupo apagador Q (quencher) e nªo fluoresce, mas ao abrir para hibridizar, os dois grupos se afastam, permitindo que o fluoróforo irradie. Durante a PCR, o farol molecular nªo Ø digerido pela açªo 5·fi 3· exonucleolítica da polimerase; isto se deve ao fato que a molØcula Ø construída de ribonucleotídeos ou porque, assim que a polimerase começa a deslocar o farol molecular, ele cai do alvo, escapando da digestªo. O painel inferior mostra dois faróis moleculares diferentes, cada um possuindo um fluoróforo distinto e que reconhecem seqüŒncias-alvo diferentes, por exemplo, uma normal e uma variante. Durante a PCR Ø fÆcil distinguir estes dois alelos claramente e os trŒs possíveis genótipos resultantes: dois homo- zigotos e um heterozigoto. 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 DNA-alvo Farol molecular Híbrido Fl uo re sc ên cia Ciclos térmicos 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 10 20 30 40 0 177 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 bases T e C, devido a mutaçıes nas fitas de DNA mutadas. Por esse motivo, a chance de detectar as mutaçıes Ø dobrada. A piperadina Ø utilizada para clivar o DNA nas posiçıes das bases modi- ficadas, como mostrado na Fig. 13.14. A PCR Ø usada para gerar os fragmentos de DNA em questªo; neste passo, se um dos primers forem marcados (com fluorescŒncia, por exemplo), os produtos da clivagem serªo visualizados após eletroforese e uma boa estimativa da localizaçªo da mutaçªo serÆ obtida. O produto da PCR em questªo terÆ de ser seqüenciado posteriormente para identificar a alteraçªo. As vantagens desse mØtodo incluem uma taxa de detecçªo de alte- raçıes na seqüŒncia de 100% e a possibilidade de examinar comprimentos de kilobases de DNA. Por outro lado, o mØtodo requer o emprego de compostos nocivos e uma sØrie de manipulaçıes das amostras. TESTE DE PROTE˝NA TRUNCADA (TPT) Alguns genes precisam sofrer mutaçıes se- veras, como deleçıes, inserçıes e mutaçıes Fig. 13.11 SSCP: Embora os dois amplicons mostrados diferem em somente uma base, as quatro fitas simples pos- suem seqüŒncias distintas. Em gØis nªo-desnaturantes as quatro molØculas assumem conformaçıes diferentes e, por- tanto, migram com velocidades diferentes durante a eletro- forese. As conformaçıes adotadas dependem de vÆrios fatores no gel, tal que a mobilidade de um dado fragmento muda de um gel para outro mesmo em condiçıes aparente- mente idŒnticas. A eletroforese Ø comumente realizada a 4°C para acentuar as diferenças nas conformaçıes. Fig. 13.12 HA (heteroduplex analysis). Os dois ampli- cons mostrados diferem em somente uma base. Quando eles sªo desnaturados e permitidos a reanelar, quatro mo- lØculas sªo geradas em proporçıes iguais: dois homodœ- plex como existia inicialmente e dois heterodœplex. Os heterodœplex sªo molØculas possuindo uma dobra ou um afrouxamento no ponto onde as seqüŒncias diferem. Du- rante eletroforese em gØis nªo-desnaturantes as duas mo- lØculas homodœplex migram com velocidades iguais; as duas molØculas heterodœplex migram mais lentamente, ou como uma banda só, ou como duas. Essa eletroforese Ø normal- mente realizada em gØis de MDE que Ø uma acrilamida modificada. nonsense, para resultar em um fenótipo anor- mal; os transcritos desses genes mutados sªo traduzidos para gerar proteínas menores que as normais e que provavelmente serªo nªo-fun- cionais. Mutaçıes pontuaisdo tipo missense nªo claramente levam a conseqüŒncias deletØrias e podem atØ ser consideradas como polimorfis- mos. Genes de importância clínica que aparen- temente precisam sofrer tais mutaçıes severas incluem: BRCA1 e BRCA2, envolvidos em cân- cer de mama e de ovÆrio hereditÆrio; APC, en- volvido em câncer de cólon hereditÆrio; NF1, mutado em neurofibromatose; e DMD, que cau- sa distrofia muscular de Duchenne quando mu- tado. O TPT foi desenvolvido para detectar essas mutaçıes severas diretamente. Ele con- siste em amplificar a regiªo de interesse por PCR, mas um dos primers usados contØm um Amplicon com seqüência normal Eletroforese em gel não-desnaturante para separar as quatro fitas simples Amplicon com seqüência variante Desnaturar e esfriar Amplicon com seqüência varianteAmplicon comseqüência normal Desnaturar e re-anelar OU E Eletroforese em gel não-desnaturante para separar as quatro moléculas (dois homodúplex e dois heterodúplex) 178 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 Fig. 13.13 DGGE. O painel superior mostra o que acontece quando uma amostra de DNA dupla fita Ø aplicada linearmente ao longo do início de gel e submetido a eletroforese num gel que possui um gradiente horizontal de desnatu- rante. As duas fitas permanecem aneladas e migram rapidamente onde hÆ pouco desnaturante, comparadas com fitas desnaturadas que se encontram em regiıes de alta concentraçªo de desnaturante. Na fita dupla, a desnaturaçªo começa em domínios distintos que refletem a seqüŒncia local; esses domínios crescem à medida que a desnaturaçªo progride. Uma diferença de uma base entre dois fragmentos de DNA altera o ponto de desnaturaçªo desses domínios. O painel inferior mostra a migraçªo diferencial de duas molØculas homodœplex e duas heterodœplex durante a eletroforese. Quando o paciente for sabidamente heterozigoto, uma quantidade suficiente de molØculas heterodœplex Ø gerada na PCR durante a ciclagem para ser visto na DGGE; porØm se o paciente for homozigoto para a variante, molØculas heterodœplex tŒm que ser formadas misturando produtos de PCR do paciente com aqueles normais. promotor da RNA polimerase T7 e um sinal de iniciaçªo de traduçªo eucariótico incorporado, como mostra a Fig. 13.15. O produto da PCR Ø submetido a um siste- ma comercial de transcriçªo/traduçªo in vitro junto com 35S-metionina; dessa maneira a pro- teína produzida Ø isotopicamente marcada e pode ser visualizada após eletroforese em gØis de SDS- poliacrilamida. Proteínas prematuramente trun- cadas devido a uma mutaçªo severa, que geram códons de parada anormais, migrarªo mais ra- pidamente durante eletroforese, e o tamanho Amostra aplicada linearmente aqui Gradiente de desnaturante Fitas desnaturadas Fitas parcialmente desnaturadas Fitas permanecem aneladas MáximoMínimo El et ro fo re se Máximo Mínimo El et ro fo re se Amostras aplicadas Fitas heterodúplex Fitas homodúplex normais e variantesG ra di en te d e de sn at ur an te 179 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 Fig. 13.14 Clivagem química de mismatch: A química desta tØcnica tem por base o mØtodo Maxam-Gilbert para seqüenciar DNA. Na reaçªo, as duas fitas de DNA contendo a seqüŒncia normal (colorido) sªo marcados (com radioisóto- po ou grupo fluorescente) e usados como sonda. Este DNA Ø anelado com a amostra de DNA sendo testado para gerar molØculas heterodœplex. No painel superior uma variante G fi T Ø detectada pela açªo de hidroxilamina (H) e de tetróxido de ósmio (OT) em somente uma das molØculas heterodœplex. No painel inferior uma variante C fi T Ø detectada pela açªo de H e de OT nas duas molØculas heterodœplex. PorØm, Ø importante perceber que o ensaio visualiza somente as fitas marcadas, após sua eletroforese em gel. Todas as possíveis mudanças de bases sªo detectÆveis utilizando este mØtodo. observado da molØcula encurtada fornece um in- dício da posiçªo da mutaçªo no DNA original, embora a mutaçªo responsÆvel pode estar longe no lado 5· desse códon. A vantagem deste mØ- todo em relaçªo alguns outros Ø que segmentos bastante compridos de um gene (maiores que 1kb) podem ser analisados em um ensaio. Por esse motivo Ø conveniente que o cDNA, produzi- do por RT-PCR, seja analisado, uma vez que ele contØm vÆrios trechos contíguos de seqüŒncia codificadora (o tamanho mediano de Øxons hu- manos Ø 200bp). Para assegurar sucesso no caso de produtos de PCR compridos, gerados a par- tir de RNA, talvez seja necessÆrio realizar duas amplificaçıes por PCR consecutivas. O produto da PCR em questªo terÆ de ser seqüenciado pos- teriormente para definir a alteraçªo. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Nessa tØcnica, utiliza-se uma concentraçªo alta de somente um primer específico, e a PCR Ø realizada em condiçıes de baixa temperatura e alta concentraçªo de Taq polimerase. Isso faz com que produtos de PCR sejam gerados após a hibridizaçªo do primer no alvo complementar, bem como em locais nªo-específicos. Quando feito com DNA genômico, o resultado Ø uma sØrie de produtos randômicos, porØm reprodutíveis, que sªo visualizados em gel após eletroforese, denominados impressªo digital. Na Ærea mØdi- ca essa tØcnica tem sido empregada no rastrea- mento de cepas de bactØrias e protozoÆrios, especialmente no contexto do surgimento de cepas resistentes a antibióticos no ambiente hos- pitalar; cepas diferentes levam a padrıes de ban- das distintas quando submetidas a RAPD. Esta tØcnica foi adaptada para detectar mudanças numa œnica base, em um trecho de um dado gene humano: o padrªo pode mudar dramaticamente nesses casos, mas a adaptaçªo terÆ de ser mais estudada a fim de definir a taxa de detecçªo de mutaçıes em qualquer segmento do DNA-alvo. PCR no Diagnóstico GenØtico PrØ-Implantaçªo (DGP) de Doenças MonogŒnicas A PCR e tØcnicas de fertilizaçªo in vitro tŒm sido combinadas para oferecer uma alternativa 180 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 ao diagnóstico prØ-natal tradicional que utiliza amniocentese ou anÆlise do vilo corial. O objeti- vo do DGP Ø o de transferir, após fertilizaçªo, somente zigotos sadios para o œtero, em casos em que o casal sabidamente possui mutaçıes causadoras de uma doença genØtica. HÆ duas abordagens, como ilustrado na Fig. 13.16. Uma envolve a retirada e anÆlise por PCR (para as mutaçıes em questªo) de um ou dois blastômeros do embriªo composto de oito cØlu- las; se for afetado, o embriªo nªo serÆ transferi- do para o œtero, caso contrÆrio serÆ implantado. Na segunda abordagem, o primeiro e o segundo glóbulo polar sªo removidos dos oócitos e anali- sados seqüencialmente por PCR; somente zigo- tos que nªo possuem mutaçıes maternas sªo transferidos (possíveis mutaçıes paternas nªo sªo procuradas nesta situaçªo). A anÆlise do pro- duto da PCR segue os mØtodos jÆ descritos aqui; porØm DGP representa um caso extremo do uso dessa ferramenta, porque o DNA-alvo estÆ pre- sente em, no mÆximo, duas cópias no início da PCR. Questıes de contaminaçªo sªo prioritÆ- rias, e o DNA do pessoal do laboratório nªo pode ser permitido a ser amplificado em vez do DNA da amostra. AlØm disso, um dos problemas mais importantes na anÆlise de blastômeros Ø a falha de amplificaçªo alelo-específico, que jÆ levou ao diagnóstico errado nesse campo. Todos esses casos ocorreram com heterozigotos compostos, e, provavelmente, somente um dos alelos mu- tantes foi amplificado. Esse fenômeno ocorre entre 7% e 30% das anÆlises, dependendo da cØlula a ser estudada. A anÆlise seqüencial dos dois glóbulos polares evita esse problema. Por- tanto, na anÆlise de blastômeros, Ø necessÆrio amplificar outros locos que sejam polimórficos (normalmente STRs) simultaneamente,para excluir a falha de amplificaçªo alelo-específico. Todavia para parcialmente contornar a dificul- dade de analisar o DNA de uma œnica cØlula, Ø possível efetuar uma prØ-amplificaçªo do geno- ma inteiro utilizando uma coleçªo de primers menos específicos, em um procedimento deno- minado PEP (primer extension preamplification). Aqui, primers de 15-mer sªo usados que sªo compostos de todas as possíveis combinaçıes de bases; ou seja, hÆ primers que contŒm 415 se- qüŒncias. Estudos preliminares mostram que essa manobra auxilia a anÆlise, embora nªo seja usa- da na rotina clínica atualmente. Fig. 13.15 Teste de proteína truncada. Neste ensaio, o DNA-alvo recomendado Ø cDNA que Ø composto de um trecho contíguo de DNA que codifica para um produto protØico; Øxons œnicos sªo, na maioria, pequenos demais para serem usados nesta metodologia. A PCR Ø realizada usando um primer (para a fita forward) que contØm a seqüŒncia de promotor da T7 RNA polimerase no seu lado 5·; na parte 3· gene-específico, o códon ATG de iniciaçªo deve estar em fase com a fase de leitura da seqüŒncia codificadora. ConvØm lembrar que, se o DNA-alvo for cDNA gerado a partir de mRNA por transcriçªo reversa, um alelo mutante poderÆ nªo ser detectado por causa de instabilidade do mRNA. 181 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 Novidades na PCR Duas serªo mencionadas: a primeira refere- se a novos termocicladores que estªo disponíveis para alguns setores, notavelmente na Ærea mili- tar. Atualmente, Ø possível realizar os ciclos de am- plificaçªo muito rapidamente, com um volume de reaçªo reduzido e com mudanças de temperatura que podem ser transmitidas quase que instantane- amente. Dessa maneira, amplificaçıes sªo com- pletadas em menos de 10 minutos, em vez dos 120 minutos típicos. As amplificaçıes podem ser acompanhadas em tempo real, como descrito. Os termocicladores disponíveis sªo levados ao campo para confirmar o diagnóstico de doenças infeccio- sas in loco. A segunda estÆ mais distante, mas jÆ Ø expe- rimental e se refere à PCR realizada em chips miniaturizados com volumes de reaçªo menor que 5ml. Tanto a amplificaçªo quanto a detec- çªo dos produtos resultantes podem ser feitas nesses dispositivos. SEQÜENCIAMENTO DE DNA NA MEDICINA MOLECULAR AtØ recentemente, seqüenciamento era con- siderado oneroso e difícil demais para ser rea- lizado rotineiramente na medicina molecular. Todavia, com a disponibilidade de seqüencia- dores automÆticos mais baratos, de kits que per- mitem seqüenciar DNA preparado de vÆrias fontes com alta reprodutibilidade e confiabili- dade sem o uso de radioisótopos e sem a obri- gatoriedade de clonar o DNA a ser seqüenciado, e de programas que facilitam a fÆcil manipula- çªo das seqüŒncias geradas, esta tØcnica tor- nou-se indispensÆvel nesta Ærea. AlØm disso, o seqüenciamento Ø considerado o mØtodo mais confiÆvel de detecçªo de mutaçıes, esperadas e inesperadas, no DNA-alvo. Qualquer varian- te encontrada usando os mØtodos de varredura jÆ descritos aqui, terÆ de ser seqüenciada para identificar a origem da variaçªo. Normalmente na medicina molecular o DNA-alvo de interesse Ø especificamente ampli- ficado por PCR e seqüenciado diretamente, ob- viando a necessidade de clonar o alvo. Isso quase elimina dois problemas vistos no passo da clo- nagem, erros de seqüŒncia causados pela Taq polimerase e aquele da heterozigose, alØm da dificuldade relativa de praticar a clonagem. A Taq polimerase incorpora bases erroneamente com a freqüŒncia mØdia de uma em cada 2.000 (ou- tras DNA-polimerases termoestÆveis, por exem- plo, Pfu polimerase, sªo mais fiØis ao realizar as cópias). Se um produto da amplificaçªo que contiver um desses erros for clonado, todos os plasmídeos provenientes dessa molØcula terªo esse erro e, ao serem seqüenciados, levarªo à conclusªo de que hÆ uma mutaçªo ou polimor- fismo. Quando o produto de PCR Ø seqüencia- do diretamente, esse tipo de erro artificial minoritÆrio Ø escondido pela maioria das molØ- culas-cópia normais, como se fossem uma œni- ca molØcula. Se o DNA genômico for amplificado, e, no caso de DNA humano, existem duas cópias do alvo, se faz necessÆrio que o seqüenciamento detecte variaçıes (por exemplo, mutaçıes pon- tuais) presentes em heterozigose. Nos pontos de heterozigose, o sinal de cada base no seqüencia- mento cai pela metade e Ø sobreposto pelo sinal dado pela base da outra fita, como demonstrado na Fig. 13.17. AtØ hÆ pouco tempo, seqüenciamentos de alta qualidade e difíceis de se realizar eram ne- cessÆrios para garantir a detecçªo destes hete- rozigotos, mas atualmente isso se tornou mais simples e reprodutível. PorØm, quando os pro- dutos sªo clonados antes de serem seqüencia- dos, Ø possível que somente um dos alelos seja seqüenciado, pelas mesmas razıes discutidas acima. Por esse motivo, nessas situaçıes Ø ne- cessÆrio seqüenciar no mínimo seis clones inde- pendentes para minimizar a chance de nªo observaçªo de heterozigotos. Embora o seqüenciamento direto de produ- tos de PCR tenha se tornado quase que rotinei- ro na medicina molecular, hÆ algumas situaçıes que se faz necessÆrio a obrigatoriedade do seqüen- ciamento de produtos clonados para detectar variantes. Essas sªo aquelas em que a seqüŒncia variante sabidamente existirÆ em minoria com- parada com a seqüŒncia normal, por exemplo em um tumor pequeno, ou quando cØlulas tu- morais estªo sendo procuradas em urina ou fe- zes. A purificaçªo e o seqüenciamento do DNA total nesses casos nªo revelarªo mutaçıes, que estarªo sub-representadas e escondidas na se- qüŒncia normal. Na PCR os dois alelos serªo amplificados com igual eficiŒncia correspondente à razªo das cØlulas normais para aquelas cance- 182 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 Fig. 13.16 Diagnóstico genØtico prØ-implantaçªo. AnÆlise de blastômero Ø mostrada no painel superior no caso de uma doença hereditÆria recessiva. As quatro possíveis fertilizaçıes entre espermatozóides e oócitos sªo consideradas, em que N e M significam os alelos normais e mutantes, respectivamente. Na etapa de oito cØlulas, uma biópsia do embriªo Ø feita para remover um ou dois dos blastômeros; isto nªo afeta o futuro desenvolvimento do embriªo. O DNA do blastômero Ø submetido à PCR para determinar a presença ou nªo dos dois alelos; a ausŒncia do alelo normal implica que o blastôme- ro Ø homozigoto para o alelo mutante e que o embriªo nªo deveria ser implantado para evitar o desenvolvimento de um indivíduo afetado. O painel inferior considera a anÆlise (por PCR) dos glóbulos polares, que sªo formados durante a meiose do oócito, em que a mulher Ø heterozigoto para a doença. MI e MII sªo a primeira e a segunda divisªo meiótica, respectivamente do oócito. Neste caso existem trŒs possibilidades em relaçªo ao primeiro glóbulo polar: se recombinaçªo nªo ocorrer, ele serÆ homozigoto normal ou homozigoto afetado. Se recombinaçªo ocorrer, o primeiro glóbulo polar serÆ heterozigoto. Se o primeiro glóbulo polar for homozigoto para o alelo normal, o oócito possui duas cópias do alelo mutante e o futuro embriªo certamente terÆ este alelo se fertilizaçªo acontecer. No caso inverso, o resultado oposto serÆ obtido. No caso de recombinaçªo, o segundo glóbulo polar terÆ de ser analisado para predizer qual alelo materno estarÆ presente no oócito maduro. As vantagens da anÆlise dos glóbulos polares sobre a dos blastômeros incluem o fato que somente material extra-embriônico Ø manipulado e que problemas de mosaicismo em embriıes sªo evitados. Por outro lado, esta abordagem nªo Ø aplicÆvel nas doenças autossômicas dominantes em que o pai Ø afetado, e na identificaçªo de sexo, em que a contribuiçªo paterna tem que ser conhecida. Após análise do blastômero, não implantar o embrião Após análise do blastômero, implantar o embrião Não-afetadoAfetado 183 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 rosas; quando a amostra tiver <30% cØlulas tu- morais, a detecçªo da mutaçªo nªo serÆ possí- vel. Se nªo utilizar um mØtodo de seletivamente enriquecer as seqüŒncias mutantes (veja item Confirmaçªo da presença/ausŒncia do produto da PCR), ou de seletivamente isolar o tecido tu- moral no início (por cuidadosa microdissecçªo), os produtos de PCR terªo de ser clonados e se- qüenciados para aumentar a chance de achar a seqüŒncia mutante. Utilizando sistemas fluorescentes, hÆ dois mØtodos para a realizaçªo de seqüenciamentos: em um deles, denominado dye-primer, o primer de seqüenciamento Ø marcado no seu extremo 5 com o fluoróforo e quatro reaçıes distintas sªo realizadas com os respectivos terminadores (ddNTPs) para cada DNA a ser seqüenciado. No segundo, chamado de dye-terminator, o primer de seqüenciamento nªo Ø marcado, e os quatro terminadores sªo acoplados ao(s) fluoróforo(s). AtØ recentemente, o mØtodo dye- primer era considerado necessÆrio para detec- çªo de heterozigotos com confiança, e os picos vistos no eletroferograma eram mais homogŒ- neos; porØm, com a introduçªo de polimerases de DNA modificadas (por tØcnicas de DNA re- combinante) e de fluoróforos mais eficientes, o mØtodo dye-terminator passou a ser mais utili- zado atualmente: a qualidade do seqüenciamento gerado Ø boa, os primers usados para fazer a PCR podem ser usados como primers de seqüencia- mento em vez de sintetizar primers fluorescen- tes para cada DNA-alvo a ser seqüenciado e, se quatro fluoróforos diferentes para cada um dos quatro ddNTPs forem usados, a reaçªo de seqüenciamento pode ser realizada em um œnico tubo. Presentemente, polimerases de DNA termoestÆveis e modificadas sªo empregadas para fazer seqüenciamento cíclico (vÆrios seqüencia- mentos alternados em um termociclador) usan- do o mØtodo dye-terminator que requer pouco DNA-alvo e que, portanto, Ø ideal para produ- tos de PCR no laboratório clínico. OUTRAS TECNOLOGIAS PARA AMPLIFICAR `CIDOS NUCLÉICOS Embora a PCR continue sendo a ferramen- ta mais empregada para amplificar especifica- mente e analisar pequenas quantidades de Æcidos nuclØicos, outras metodologias eficazes tŒm sido Fig. 13.17 Seqüenciamento de heterozigotos. Os ele- troferogramas mostram parte do seqüenciamento do Øxon 11 do gene BRCA2 obtido com a metodologia dye-termi- nator e seqüenciamento cíclico. O traço superior represen- ta a seqüŒncia normal enquanto o inferior representa um indivíduo heterozigoto na posiçªo 6382 do gene onde, em uma das cópias do gene, houve uma substituiçªo C fi T. Essa variante Ø denominada C6382T. Embora essa meto- dologia nªo produza picos de tamanho uniforme, ela Ø su- ficientemente confiÆvel para revelar heterozigotos. A existŒncia desta variante foi confirmada pelo seqüencia- mento da fita complementar posteriormente. desenvolvidas como alternativas. Uma das ra- zıes Ø devido à patente, que restringe o uso da PCR para fins comerciais; esta patente deve ter- minar em torno do ano 2006. As outras metodologias podem ser catego- rizadas em trŒs grupos: amplificaçªo do alvo, amplificaçªo da sonda e amplificaçªo do sinal. As tØcnicas que amplificam o alvo, as quais in- cluem PCR, NASBA (nucleic acid sequence-ba- sed amplification), SDA (strand displacement assay), TMA (transcription mediated amplificati- on) e RCA (rolling circle amplification), ofere- cem uma maior sensibilidade de detecçªo permitindo que uma molØcula do alvo possa ser detectada. Os mØtodos de amplificaçªo da son- da incluem LCR (descrito aqui), Qb-replicase e cycling probe reaction, tambØm permitindo que algumas molØculas da seqüŒncia alvo possam ser detectadas. Amplificaçªo do sinal Ø feita usando bDNA (branched DNA). Algumas dessas tØcni- cas serªo discutidas a seguir, e o restante delas estÆ em fase de introduçªo no mercado. 184 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 NASBA O alvo inicial Ø DNA ou RNA, o que jÆ limi- ta sua aplicabilidade. A esse, Ø anelado um pri- mer híbrido (primer 1), contendo um promotor de RNA polimerase no seu tØrmino 5, e entªo um cDNA Ø gerado usando transcriptase re- versa (RT). A enzima RNase H Ø usada para digerir a fita de RNA nessa fita dœplex de RNA×DNA, liberando uma fita simples de DNA. Essa fita simples Ø copiada por RT atravØs de um segundo primer (primer 2) que tambØm contØm um promotor de RNA polimerase no seu tØrmino 5, gerando uma fita dupla de DNA×DNA. Esses passos representam a fase inicial nªo-cíclica, como mostra a Fig. 13.18. A segunda fase Ø cíclica durante a qual a am- plificaçªo ocorre: cada fita do dœplex DNA×DNA serve como molde para T7 RNA polimerase (a terceira enzima usada nessa metodologia), que gera transcritos mœltiplos de RNA. Cada um des- ses, por sua vez, sªo transcritos pela RT a partir do primer 2, gerando mais cópias de DNA na for- ma de fitas dœplex de RNA×DNA. Após a açªo de RNase H, a RT atua novamente, a partir do primer 1, encerrando o ciclo. Todos os passos sªo efetuados a uma temperatura constante. Diferente da PCR, cada ciclo de amplificaçªo por transcri- çªo produz 40-100 cópias de RNA: uma amplifi- caçªo maior que um milhªo de vezes do produto de RNA Ø atingida dentro de uma hora. Esse pro- duto Ø detectado após hibridizaçªo com duas son- das (oligonucleotídeos) específicas que atuam simultaneamente: uma sonda contØm biotina para captar o produto, enquanto a outra Ø marcada com um composto que inicia uma reaçªo eletro- quimoluminescente, atravØs da qual Ø medido o grau da reaçªo. Essa tecnologia tem sido aplica- da à quantificaçªo de RNA de HIV1 em pacien- tes infectados. TMA É semelhante a NASBA, mas difere na me- dida que a RT Ø especial por possuir atividade de RNase H inerente. O mØtodo de detecçªo dos amplicons de RNA tambØm Ø diferente. Essa metodologia Ø usada para detectar Mycobacte- rium tuberculose. BDNA Somente o sinal Ø amplificado nessa meto- dologia, o que significa que resultados falso-po- sitivos por contaminaçªo local sªo mais raros. Sondas específicas que possuem estruturas pa- recidas com pentes (fornecidos pelo manufatu- rador) ligam-se no Æcido nuclØico-alvo. Cada pente fornece sítios para a hibridizaçªo de atØ 3.000 sondas acopladas a uma enzima, como fosfatase alcalina. O consumo de um substrato quimoluminescente pela enzima gera um sinal proporcional ao nœmero de molØculas-alvo pre- sentes, como diagramado na Fig. 13.19. Esse sistema Ø usado na quantificaçªo de DNA de HBV e RNA de HCV e HIV. HIBRIDIZA˙ˆO A maioria dos mØtodos descritos aqui, usa- dos na Ærea clínica para caracterizar variantes moleculares em Æcido nuclØico, refere-se a peque- nas mudanças, sejam mutaçıes pontuais ou pe- quenas inserçıes, deleçıes ou rearranjos. É importante lembrar que defeitos no DNA incluem lesıes drÆsticas, exemplificadas pela perda ou gan- ho de um cromossomo inteiro. Essas aberraçıes cromossômicas ocorrem em 0,6% dos nascimen- tos vivos humanos e em atØ 5% dos natimortos. A mutaçªo mais comum em humanos Ø a nªo- disjunçªo em meiose do cromossomo 21 que leva à síndrome de Down. Aberraçıes cromossômicas sªo tradicional- mente visualizadas realizando bandeamento dos cromossomos e cariótipo. Lesıes mais sutis po- dem ser vistas com o uso de FISH (fluorescent in situ hybridization) onde uma sonda de DNA (clo- nado em plasmídeo, bacteriófago ou cosmídeo) marcado (com biotina ou digoxigenina) Ø hibri- dizado com os cromossomos comumente em me- tÆfase. A sonda Ø observada posteriormente por fluorescŒncia. O limite de resoluçªo Ø em torno de 1Mb nesses casos, mas quando cromossomos em interfase sªo o alvo, duas sondas coradas em cores diferentes, e separadas por somente 50kb podem ser distinguidas. Lesıes menores devem ser detectadas pelo uso de Southern blotting e hi-bridizaçªo, que separam fragmentos de DNA de 500bp a 20kb em tamanho. Assim sendo, essa metodologia continua sendo usada para detectar, por exemplo, os rearranjos que ocorrem na leu- cemia mielóide crônica (t[9:22]), cromossomo Philadelphia) e no linfoma folicular (t[14:18]), bem como as expansıes de trincas observadas na síndrome de X-frÆgil (vide supra). Se a possibili- dade desse tipo de lesªo maior nªo for levada em 185 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 Fig. 13.18 NASBA. Essa metodologia possui duas fases: a nªo-cíclica e a cíclica, e utiliza dois primers híbridos, 1 e 2, cada um contendo um promotor de RNA polimerase no seu segmento 5. A fase nªo-cíclica usa RNA ou DNA como alvo e tem como objetivo a produçªo de vÆrias cópias de DNA dupla fita, onde cada fita contØm o promotor de RNA polimerase. Esta fase depende das enzimas transcriptase reversa (RT), e RNase H que remove a fita de RNA de uma molØcula híbrida RNA×DNA. Amplificaçªo por transcriçªo ocorre durante a fase cíclica quando um nœmero grande de fitas de RNA Ø gerado pela açªo das enzimas T7 RNA polimerase, RT e RNase H, e o consumo dos primers 1 e 2. As cópias de RNA sªo quantifi- cadas por uma reaçªo eletroquimoluminescente. consideraçªo, um diagnóstico atravØs de PCR e da anÆlise do produto resultante serÆ incorreto. Por exemplo, Ø estimado que 35% das mutaçıes no gene BRCA1 sªo devidos a deleçıes grandes (510bp a 14kb): porØm essas nªo serªo reconhe- cidas ao realizar PCR e seqüenciamento do pro- duto gerado. CHIPS E SEQÜENCIAMENTO POR HIBRIDIZA˙ˆO Com a tecnologia importada do uso de fotoli- tografia em chips de silício na fabricaçªo de semi- condutores, Ø possível sintetizar oligonucleotídeos, por exemplo, de 8-mer, numa superfície que nor- malmente Ø de vidro. As bases sªo acrescentadas seqüencial e controladamente, e a posiçªo de cada oligonucleotídeo, na pequena placa de vidro, com sua seqüŒncia, Ø conhecida. Trinta e dois ciclos de adiçıes específicas (ou seja, oito adiçıes de cada um dos quatro nucleotídeos) permitem a produ- çªo de todos os 65.536 possíveis oligonucleotí- deos de 8-mer. O conceito original dessa tecnolo- gia (25 anos atrÆs) baseia-se no blot de Southern, e molØculas de Æcido nuclØico marcadas poderiam ser usadas para interrogar molØculas de Æcido nu- clØico fixadas em um suporte sólido, inicialmente membranas de nitrocelulose. O uso de um suporte como vidro, que Ø impermeÆvel e rígido, faz com que as sondas encontrem e hibridizem com seus alvos mais rapidamente, sem entrar em poros de membranas. As lavagens sªo mais rÆpidas pelos mesmos motivos. AlØm disso, a planura, transpa- rŒncia e rigidez do vidro permitem uma melhor aquisiçªo e processamento de imagens, e as posi- çıes dos oligonucleotídeos ficam mais bem defini- das do que numa superfície flexível. Portanto, atualmente sªo produzidos agrupamentos conten- do 400.000 oligonucleotídeos diferentes, cada um no seu espaço de 20 m m2. Um produto de PCR, comumente marcado com um fluoróforo, Ø hibridizado com esse chip, que Ø lavado posteriormente para remover o produto nªo-anelado. Após estímulo com la- ser, as posiçıes de fluorescŒncia sªo lidas e in- Primer 1 RNA (+) DNA (+) FASE NÃO-CÍCLICA RT RT RT DNA-DNA RNA-DNA Desnaturar RNase H DNA (–) Primer 2DNA-DNA DNA (+) T7 RNA polimerase T7 RNA polimerase RT RNA (–) n RNA-DNA FASE CÍCLICA RNase H Primer 2 Primer 1 RT 186 VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENÉTICA E DA FARMACOLOGIA Cap. 13 Fig. 13.19 bDNA. O Æcido-nuclØico-alvo Ø capturado numa fase sólida usando sondas. Outras sondas de extensªo tambØm sªo hibridizadas ao alvo que, por sua vez, hibridizam ao bDNA. O bDNA possui formato de pente e Ø o multímero de amplificaçªo; esta molØcula Ø fornecida prØ-construída pelo fabricante. No próximo passo, outras sondas marcadas com uma enzima (comumente fosfatase alcalina) sªo hibridizadas ao bDNA. A enzima atua sobre um substrato (por exemplo, dioxetano), produzindo quimoluminescŒncia que Ø quantificada. terpretadas por computador, a partir da qual a seqüŒncia no produto de PCR Ø inferida. Produ- tos contendo variaçıes na seqüŒncia anelarªo em posiçıes sutilmente diferentes, e produtos ob- tidos de heterozigotos hibridizam em no míni- mo duas posiçıes simultaneamente. Essa tecnologia estÆ avançando rapidamente, tanto pelo aumento na densidade de oligonucleotí- deos colocados numa dada Ærea do chip, quan- to na habilidade de ler os sinais de fluorescŒncia mais compactados. Os problemas encontrados, como o auto-anelamento do produto nas con- diçıes de hibridizaçªo usadas, estªo sendo so- lucionados. Se os oligonucleotídeos que forem fixados no chip possuem seqüŒncias de cDNAs, esses chips podem ser usados para acompanhar a ex- pressªo de genes atravØs do mRNA obtido, por exemplo, de um tecido em estudo. A expressªo de genes de interesse em dois tecidos diferentes, ou em duas amostras de um tecido, uma sendo neoplÆstica, pode ser comparada. O tempo dirÆ se essa tecnologia serÆ adotada nos laboratórios de medicina molecular. BIBLIOGRAFIA 1. Arnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy. Annu Rev Biochem, 61:131-156, 1992. 2. Belgrader P et al. PCR detection of bacteria in seven minutes. Science, 284:449-450, 1999. 3. Cotton RGH. Mutation detection. Oxford University Press, 1997. 4. Kostrikis LG et al. Spectral genotyping of human alleles. Science, 279:1228-1229, 1998. Hibridizar sondas ao ácido nucléico-alvo e à fase sólida Sonda de captura Hibridizar bDNA (multímero de amplificação) Hibridizar sondas marcadas com enzima ao bDNA Ácido nucléico desnaturado Sonda de extensão Acrescentar substrato e medir quimoluminescência 187 BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MÉDICO Capítulo 13 Cap. 13 5. Nollau P, Wagener C. Methods for detection of point mutations: performance and quality assessment. Clin Chem, 43:1114-1128, 1997. 6. Tang YW, Procop GW, Persing DH. Molecular diagnostics of infectious diseases. Clin Chem, 43:2021-2038, 1997. 7. The chipping forecast. Suplemento a Nat.Genetics 21, janeiro 1999. 8. Williams C et al. Assessment of sequence-based p53 gene analysis in human breast cancer: mRNA in comparison with genomic DNA targets. Clin Chem, 44:455-462, 1998. 9. Winn-Deen ES. Automation of molecular genetic methods Part 2: DNA amplification techniques. J Clin Ligand Assay, 19:21-32, 1996.
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