POP - Setor de imunohematologia

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AGÊNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITÁRIO JÚLIO MULLER 
Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N – Jardim Alvorada 
CEP – 78048-902 Fone: 3615-7391 
TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA 
Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 1 de 21 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS PADRÃO 
 
NO 
 
SETOR DE IMUNOHEMATOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA 
Versão: 05 Código: ImunoHem 07 paginação: 2 de 21 
 
Elaborado: Hildenete Monteiro Fortes Assinatura: 
 
Data da Elaboração: 08.06.2004 
 
Aprovado e liberado por: Hildenete Monteiro Fortes 
 
Data da implantação: 
 
Data da Revisão: 10/11/11 
 
Periodicidade da Revisão: anual REVISADO: Hildenete Monteiro Fores 
 
Tempo de arquivo: 05 anos 
 
Setor: Setor de Imunohematologia 
 
Código do documento: Imunohem – 07 
 
Número da versão atual: 05 
 
Número total de Páginas: 21 
 
Número de cópias - distribuição: 02 – Original para a direção – arquivo 
 Setor de Imunohematologia da Agência Transfusional 
 
 
 
 
 
 
 
ESTE É UM DOCUMENTO CONTROLADO – Não deve ser copiado ou distribuído 
sem a autorização da chefia da agência transfusional do HUJM. 
 
 
 
 
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1. OBJETIVO E APLICAÇÃO: 
O objetivo da padronização é o melhor aproveitamento técnico dos reagentes, mais 
agilidade e confiabilidade nos exames realizados no setor de imunohematologia da 
agência transfusional do HUJM, obedecendo a (Portaria No1353 de 13 de Junho de 
2011). 
 
2. OBJETIVOS GERAIS: 
Identificar o Grupo Sangüíneo, realizar Coombs dirteo e pesquisar anticorpos 
irregulares dos pacientes do HUJM. 
 
3. OBJETIVO ESPECÍFICO: 
Apoio técnico nas investigações imunohematológicas para pacientes do HUJM. 
 
4. PRINCÍPIO: 
 Determinar o Grupo ABO: A tipagem sangüínea direta pesquisa a presença de 
antígenos ABO nas hemácias teste e a reversa seus anticorpos correspondentes 
utilizando hemácias conhecidas A1 e B. Caso haja necessidade será feita a pesquisa de 
subgrupos de A e AB. 
 
Determinar o Fator Rh: Na determinação do tipo Rho (D), é obrigatório o uso do soro 
anti-D e do controle Rh da mesmo fabricante e marca do soro Anti-D em uso, este 
último pela possibilidade da presença de auto-anticorpos e /ou proteínas séricas 
anormais. 
 
Pesquisar Anticorpos Irregulares: Visa detectar anticorpos irregulares clinicamente 
significantes no soro/plasma dos recém nascidos ou de suas mães, bem como de 
pacientes do HUJM, consiste em testar o soro teste com hemácias conhecidas 
(TRIACEL). Nos casos positivos deverão ser identificados os anticorpos através do uso 
de painel. 
 
5. TIPAGEM SANGÜÍNEA ABO/ Fator Rh/Subgrupos 
 
AMOSTRAS: Hemácias / soro ou plasma do doador 
 
O técnico do serviço de Hemoterapia - SETOR DE COLETA deverá colher às amostras 
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Identificação dos tubos de hemólise da amostra do doador será feita na triagem 
clínica com etiqueta de código de barra, constando iniciais, número do doador e data 
coleta. 
Colher em tubo de hemólise 120x100 mm com EDTA - de 04 ml de sangue (ABO, Rh, 
CRh) 
Colher em tubo de hemólise seco 150x100 mm - 10 ml de sangue sem anticoagulante 
para realização de PAI. 
As amostras hemolisadas ou lipêmicas devem ser desprezadas. 
 
MATERIAIS: 
 
Equipamentos / Outros: 
 
Centrífuga sorológica de mesa 
Estante porta tubos 
Banho Maria 37ºC 
Micropipetas: 50 µl, 100 µl e 1000 ul. 
Tubos de hemólise 120x100 mm e 150x100 mm. 
Negatoscópio ou aglutinoscópio 
 
REAGENTES: 
 
Soro mono ou policlonais anti-A, anti-B, anti-A,B. Caso seja utilizado anti-soros 
MONOCLONAIS, a utilização do soro anti-A,B não é necessária. 
Soro anti-D albuminoso (Rh), mono ou policlonais 
Soro anti-D salino 
Soro anti gama globulina = Coombs = Monoespecífico. 
Soro poliespecífico = Anti Humano. 
Controle de Rh, da mesma procedência do soro anti-D. 
Hemácias conhecidas de grupo A1 e B em suspensão salina 3 – 5%. 
Hemácias comerciais para triagem de anticorpos. 
Controle de Coombs 
Lecitinas anti-A1 e anti-H. 
 
PROCEDIMENTOS: 
 
Antes de iniciar o trabalho de o dia fazer o controle interno de todos os reagentes que 
serão utilizados na rotina para testes em tubo – modelo anexo. 
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MÉTODO EM TUBO 
 
PREPARAR SUSPENSÃO HEMÁCIAS: 
Identificar um tubo de hemólise 120x100 mm com número do Doador 
Hemácias suspensa em SALINA – 3 a 5% 
Identificar 01 tubo de hemólise 120x100 – número do doador 
Colocar - 1000 µl Salina – soro fisiológico 
Colocar - 75 µl Hemácias do Doador no tubo identificado 
 
SEPARAÇÃO DO SORO 
 
Centrifugar o tubo sem anticoagulante 3 min / 3400 rpm. 
Separar o soro do doador em um tubo de hemólise já identificado. 
 
CLASSIFICAÇÃO SANGUÍNEA ABO/Rh 
 
O sistema ABO primeiro sistema de grupo sangüíneo descoberto, é o único onde 
anticorpos estarão certamente presentes no soro de indivíduos que não possuam o(s) 
antígeno(s) correspondente(s). É o sistema mais importante para a prática 
transfusional. A classificação direta pesquisa a presença dos antígenos ABO nas 
hemácias testes, usando anti-soros, enquanto a reversa pesquisa seus anticorpos 
correspondentes no soro, utilizando hemácias comerciais. 
 
Identificar os tubos 120 x 100 mm com caneta de retro projetor 
 
 
1. Colocar 
 
 
A 
 
B 
 
AB 
 
Rh 
 
CR
h 
 
HA 
 
HB 
DIRETA REVERSA 
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• 50 ul Soro Anti A no tubo A 
• 50 ul Soro Anti B no tubo B 
• 50 ul Soro Anti A,B no tubo AB 
• 50 ul Soro Anti Rh (D) no tubo Rh 
• 50 ul Controle Rh no tubo CRh - Controle de Rh 
• 100 ul Soro teste (doador) nos tubos de HA e HB 
 
2. Colocar 
 
♦ 50 ul hemácias A1 no tubo HA 
♦ 50 ul hemácias B no tubo HB 
♦ 50 ul Suspensão Hemácias do doador nos tubos de A a CRh 
 
3. Homogeneizar bem os tubos 
4. Colocar para centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto 
5. Ressuspender o botão de hemácias formado agitando levemente 
6. Ler para aglutinação e hemólise, usando auxiliar ótico. 
7. Anotar os resultados em cruzes ou escore de acordo com a graduação apropriada 
 
� INTERPRETAÇÃO: 
 
 DIRETA REVERSA 
Reagentes / Grupo 
ABO 
Soro 
Anti-A 
Soro 
Anti-B 
Soro 
Anti-AB 
Hemácias 
A1 
Hemácias 
B 
A + - + - + 
B - + + + - 
AB + + + - - 
O - - - + + 
 
 
A presença de aglutinação nos tubos de hemácias teste e presença de hemólise nos 
tubos de soro teste indicam reações positivas. 
Hemácias suspensas, após leitura do botão de hemácias, correspondem a resultado 
negativo. 
Discrepâncias entre a classificação direta e reversa devem ser resolvidas antes da 
interpretação do grupo sanguíneo da amostra teste. Não deverão ser liberados antes 
da realização de testes adicionais necessários, incluindo-se testes com lecitinas anti-A1 e anti-H. 
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Qualquer discrepância entre a tipagem DIRETA e REVERSA deverá ser resolvida pelo 
responsável técnico do serviço que será informado imediatamente. 
 
Rh Positivo e Rh Negativo 
 
 O termo Rh positivo e Rh negativo, refere-se a presença (Rh positivo) ou 
ausência (Rh negativo) na membrana da hemácia do antígeno D, que é, após os antígenos 
A e B, o mais importante em transfusão de sangue. 
 O anticorpo anti-D não esta normalmente presente no soro/plasma dos pacientes 
Rh negativos. Seu desenvolvimento depende de uma exposição prévia ao antígeno, 80 % 
das pessoas Rh negativo que recebem pelo menos uma transfusão Rh positivo, poderá 
desenvolver o anticorpo anti-D. O antígeno é muito imunogênico determinando que 
grandes partes das pessoas expostas ao antígeno desenvolvam o anticorpo. Os 
mecanismos comuns de imunização é gestação e/ou transfusão anterior. 
 Outros antígenos do sistema Rh tem também importância clínica, entre eles C 
(grande) e c (pequeno), E (grande) e e (pequeno). A combinação dos 05 principais 
antígenos do sistema Rh, avaliando-se a partir da nomenclatura de Fisher e Race 
oferece ferramentas para a resolução de problemas diários. 
 
INTERPRETAÇÃO para tipagem Rh e Pesquisa de D-fraco: 
 
Quando a tipagem para D ou D-fraco resultar positivo o sangue será rotulado como Rh 
POSITIVO. 
 
Quando a tipagem para ambos resultar negativo o sangue será rotulado como Rh 
NEGATIVO. 
 
Para que a tipagem do fator Rh possa ser considerado como válido o resultado do 
controle de Rh é sempre NEGATIVO. 
 
Caso o controle de Rh (tubo CRh) seja POSITIVO não considerar o seu Rh e proceder 
da seguinte maneira: 
 
• Considerar INVÁLIDA a tipagem Rh. 
• Chamar o responsável para resolver o caso. 
• Nestes casos deverá ser utilizado o soro anti-D salino 
 
Todos os resultados Rh Negativo fazer a pesquisa de D-fraco 
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PESQUISA de D-fraco: 
 
• Pegar os 02 tubos de hemólise identificados Rh e CRh que deram negativos 
• Incubar os 02 tubos - Rh e CRh em Banho Maria a 37ºC durante 15 minutos 
• Retirar os tubos do BM e centrifuga-los a 3400 rpm por 15 segundos 
• Fazer a leitura para presença ou ausência de aglutinação 
• Quando negativo realizar a lavagem 3 x com soro fisiológico 
• Desprezar o sobrenadante e secar bem os tubos 
• Adicionar soro de Coombs (Anti IgG) 100 ul, homogeneizar bem os tubos 
• Centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos 
• Fazer a leitura 
• Se houver ausência de aglutinação nos 02 tubos: 
• Pingar Controle de Coombs 50 ul cada tubo 
• Homogeneizar, centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos e fazer a leitura. 
Para que o teste seja validado os tubos devem dar positivos, caso contrário reiniciar 
todos os procedimentos. 
 
D fraco 
A característica de reagir de modo atípico com anti-D apresentada por algumas células 
foi descrita por Stratton, em 1946, como sendo tais células portadoras do fenótipo 
D-fracas. De acordo com a descrição original, esse fenótipo não reagia ao método de 
aglutinação direta, mas podiam ser expressos com o uso da técnica de AGH indireto 
(Coombs Indireto). Atualmente sabemos que a diferença entre D Positivo e D-fraco é 
quantitativa, não qualitativa. A maioria dos soros monoclonais utilizados regularmente 
nas rotinas é capaz de detectar a maioria das amostras que foram até então 
classificadas como D-fraco. 
 
D Parcial 
As hemácias que ao ser testado com antisoros monoclonais apresentarem resultados 
negativos para o antígeno D, ou seja, Rh negativo deverão ser testadas novamente 
utilizando-se reagentes de origem humana, policlonais para determinação da 
possibilidade de tratar-se de um D categoria. Sabe-se que a presença de epitopos de 
um antígeno D parcial é capaz de determinar a formação de um anticorpo 
correspondente. 
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Os D parciais, fenótipos raros de antígeno D positivos, foram divididos em categorias 
numeradas de I a VII. As categorias III, IV e V, em face de algumas outras evidencias 
sorológicas foram subdivididas. 
 
RECOMENDAÇÕES: 
1. Utilizar um antissoro monoclonal que detecta o antígeno D parcial categoria VI 
(DVI- ou IgG) e um antissoro que não detecta o antígeno D parcial categoria VI 
(DVI- ou Ig M), quando houver discrepância nos resultados entre os dois 
antissoros utilizados deve-se investigar a presença de D fraco e D parcial na 
amostra. 
2. Em pacientes RhD-negativo recomenda-se a pesquisa de antígeno “C” e ”E” 
 
 
6. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES 
 
PRINCÍPIO: 
 
 Anticorpos ditos irregulares são aqueles formados por imunização devido a 
transfusões, gestação ou ingestão constante de material imunogênico, sendo de classe 
IgG ou IgM. É um teste de triagem onde em casos de pesquisa positiva, deve-se 
identificar a classe e especificidade do anticorpo. O teste emprega um KIT contendo 
no mínimo duas suspensões de hemácias O (hemácias de triagem), as quais possuem a 
maioria dos antígenos estudados em rotina de banco de sangue. 
Havendo presença de anticorpos irregulares no soro a ser testado, estes reagiram com 
os antígenos correspondentes, presentes nas hemácias de triagem. 
 Anticorpos da classe IgM são normalmente detectados em meio salino e temperatura 
ambiente, enquanto que anticorpos da classe IgG são detectados através da utilização 
do soro antiglobulina humana após a incubação a 37ºC. Quanto às enzimas 
proteolíticas, sabe-se que modificam os antígenos presentes na membrana 
eritrocitária, podendo retirá-los ou torná-los aglutináveis em suspensões salinas. Os 
antígenos sensíveis à ação enzimática são os dos sistemas MNS Duffy Xga. Os 
anticorpos cuja reatividade é aumentada pela ação de enzimas são os dos sistemas Rh, 
Kidd, Lewis e P. A ação enzimática inclui ainda modificações nas propriedades físicas 
da suspensão de hemácias, podendo causar auto-aglutinação sem presença de processos 
auto-imunes. 
 As técnicas enzimáticas podem ser associadas ao soro anti-gama globulina humana 
(soro anti IgG) e podem ser utilizadas em técnicas de 1 ou 2 estágios. Na primeira 
adiciona-se a enzima diretamente à mistura soro + hemácias, sendo mais bem indicada 
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para testes de triagem enquanto que no segundo procedimento as hemácias são 
previamente tratadas com enzimas e depois misturadas ao soro teste, sendo mais bem 
indicado para identificação de anticorpos. As principais enzimas utilizadas em testes 
imunohematológicos são: BROMELINA (abacaxi), PAPAINA (mamão), TRIPSINA 
(estômago de porco) e FICINA (ficus). As alíquotas de solução enzimáticas devem ser 
mantidas em freezer, devendo-se desprezá-las após o descongelamento e utilização. 
 
 
PESQUISA de ANTICORPOS: SALINA / ALBUMINA / A.G.H. 
 
Identificar 2 Tubos 
 
Soro desconhecido – Pingar 100 ul cada tubo 
Hemácias Triacel I – Pingar 50 ul no tubo I 
Hemácias Triacel II – Pingar 50 ul no tubo II 
Centrifugar 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto 
Ressuspender o botão de hemácias formado agitando levemente 
Ler para aglutinaçãoe hemólise, usando um auxiliar ótico. Interpretar 
Anotar os resultados em cruzes ou escore de acordo com a graduação apropriad 
 
CASO os tubos I e II seja: 
 
A. Negativo 
 
• Albumina Bovina 22% � acrescentar 100 ul cada tubo 
• Incubar em Banho-maria à 37ºC por período variando entre 15 minutos e 1 hora 
de acordo com a orientação do fabricante. 
• Centrifugar 3400 rmp por 15 segundos, ler e anotar os resultados. 
 
I II 
 
I II 
 
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• Lavar 03 vezes com soro fisiológico, desprezar o sobrenadante e secar os tubos. 
• Soro Anti Humano (Poli específico) � acrescentar 100 ul em cada tubo 
• Homogeneizar e centrifugar 3400 rpm por 15 segundos, ler e anotar os 
resultados. 
 
POSITIVO = presença de anticorpos irregulares encaminharem amostra ao MT 
HEMOCENTRO para identificação de anticorpos e comunicar ao responsável pelo 
Serviço. 
NEGATIVO = Ausência de anticorpos irregulares neste caso: 
Acrescentar Controle Coombs 1 gota em cada tubo, 
Homogeneizar e centrifugar os tubos a 3400 rpm por 15 segundos e ler, o resultado 
deverá ser POSITIVO com intensidade de 3 / 4+. 
 
Esta última etapa permite avaliar: 
 
Se as hemácias testes foram corretamente lavadas, caso contrário haverá 
neutralização dos anticorpos do reagente AGH pelas globulinas residuais presentes no 
soro do paciente, que não foram totalmente retiradas com a lavagem das hemácias, 
apresentando resultado falso-negativo, devendo-se assim repetir a pesquisa. 
Se o soro AGH que está sendo utilizado esta funcionando. Repetir a pesquisa caso não 
se observe aglutinação, utilizando um frasco novo de soro AGH. 
 
B. Positivo: Fazer a identificação de anticorpos 
 
7. IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES: 
 
OBJETIVO: Identificar e caracterizar o anticorpo, para fins de pesquisa de reações 
transfusionais e doença Hemolítica Peri-Natal. Seleção de sangue compatível antígeno 
negativo. 
 
PRINCÍPIO: Anticorpos ditos irregulares são aqueles formados por imunização devido 
a transfusões, gestações ou ingestão constante de material imunogênico, sendo de 
classe IgM ou IgG, Em testes pré-transfusionais, além da determinação ABO e Rh e 
prova de compatibilidade, é obrigatória também a realização da pesquisa de anticorpos 
irregulares em receptores de hemocomponentes (RDC No 153 de 14/06/04). Quando 
observada positividade no teste de triagem, deve-se identificar a classe e 
especificidade do anticorpo responsável e selecionar sangue compatível, antígeno 
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negativo para a transfusão. A identificação de anticorpos emprega um kit contendo no 
mínimo 10 suspensões de hemácias de adulto O e 01 suspensão de hemácia de cordão O. 
A determinação da especificidade se dá por comparação do resultado obtido com o 
soro teste e um diagrama listando os fenótipos das 11 hemácias, as quais possuem a 
maioria dos antígenos estudados em rotinas de banco de sangue. Anticorpos de classe 
IgM são normalmente detectados em meio salino e temperatura ambiente, enquanto 
que anticorpos IgG são detectados através da utilização do soro anti-humano 
(POLIESPECIFICO) após incubação a 37ºC. 
 
 
AMOSTRAS: 10 ml de sangue sem anticoagulante. Encaminhada ao MT-
HEMOCENTRO, não fazemos identificação de anticorpos. 
 
REAGENTES: 
 
Estojo contendo no mínimo 10 hemácias de adultos em pool de hemácias de cordão de 
grupo O, contendo a maior combinação de 3/5%, obtidas comercialmente ou preparadas 
diariamente no laboratório a partir de uma população de doadores locais (não 
aconselhável). 
Solução fisiológica. 
Soro anti-humano (poli específico). 
Reagente comercial de hemácias controle, recobertas por anticorpos IgG 
Albumina bovina a 22% (opcional). 
 
MATERIAIS: 
 
Centrífuga sorológica de mesa. 
Estante de metal, porta tubos. 
Pipeta automática 50 µl e 100 µl e 1000 µl. 
Tubos de ensaio 10 x 75 mm. 
Negatoscópio para leitura. 
 
PROCEDIMENTO: 
 
1. Identificação de Anticorpos Irregulares (método tubo) 
2. Identificar 11 tubos de 10x75 mm, dispensar 50 ul das hemácias de painel 
correspondente. Incluir também 01 tubo de autocontrole, dispensando 1 gota das 
hemácias testes, em suspensão de 3-5%. 
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3. Adicionar 100 ul do soro a ser testados aos tubos. 
4. Incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. 
5. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 
6. Realizar leitura e anotar os resultados. 
7. Não observando positividade, incubar os tubos a 37ºC por 60 minutos ou adicionar 2 
gotas de albumina bovina a 22%, reduzindo o período de incubação para 20 minutos. 
Em caso de presença de positividade nesta fase, resfriar os tubos a temperatura 
de 16ºC também por 60 minutos (não utilizar albumina bovina aqui, evitando-se 
resultados falsos positivos). 
8. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 
9. Realizar leitura e anotar os resultados. 
10. Lavar 03 vezes o conteúdo dos tubos com salina, decantando e secando bem as 
bordas destes na ultima lavada. 
11. Adicionar 100 ul de soro anti-humano (poli específico). 
12. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 
13. Realizar leitura, anotar e interpretar os resultados. 
14. Adicionar 50 ul de hemácias controle comercial (controcel), aos tubos onde se 
observou reação negativa. 
15. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 
16. Realizar leitura o resultado deverá ser positivo com intensidade de 3+/4+. 
 
Esta última etapa permite avaliar: 
 
 Se as hemácias testes foram corretamente lavadas, caso contrário haverá 
neutralização dos anticorpos do reagente AGH pelas globulinas residuais presentes no 
soro do paciente, que não foram totalmente retiradas com a lavagem das hemácias, 
apresentando resultado falso-negativo, devendo-se assim repetir a pesquisa. 
Se o soro AGH que está sendo utilizada esta funcionando. Repetir a pesquisa caso não 
se observe aglutinação, utilizando um frasco novo de soro AGH. 
 
INTERPRETAÇÃO: 
 
Ausência de aglutinação em todas as etapas do teste indica ausência de anticorpos 
irregulares contra os antígenos presentes nas hemácias de triagem. 
Presença de aglutinação em incubação em temperatura ambiente indica presença de 
anticorpos de classe IgM. 
Presença de aglutinação em incubação a 37ºC indica presença de anticorpo de classe 
IgM reativo e/ou anticorpo classe IgG. Anticorpos de classe IgM são considerados de 
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importância clinica quando são reativos a partir de temperaturas de 30ºC, devendo-se 
nesses casos selecionar sangue antígeno negativo para transfusão. 
Presença de aglutinação em fase de anti-gamaglobulina humana indica presença de 
anticorpos de classe IgG, os quais possuem importância transfusional, devendo-se 
sempre selecionar sangue antígeno negativo para transfusão. 
Casos inconclusivos ou com presença de múltiplos anticorpos deverão ser testados em 
outras técnicas descritas neste manual (P.E.G., D.T.T. enzimas), comparando-se os 
resultados da(s) técnica(s)apropriada(s) com o primeiro teste de identificação de 
anticorpos realizados. 
8. SELEÇÃO DE DOADORES DO GRUPO “O” COM BAIXO TÍTULO DE 
AGLUTININAS “O PERIGOSO” 
 
OBJETIVO: Seleção de sangue total ou plasma do tipo “O” em transfusões 
heterologa. Este procedimento está sendo realizado no MT-HEMOCENTRO. 
 
PRINCÍPIO: O sangue total de grupo O pode ser usado em pacientes com outros 
grupos sangüíneos, em uma quantidade que não exceda um litro e nas emergências. 
Nestes casos devem ser testados em salina e ter um título de aglutininas anti-A e anti-
B menor que 100. 
 
AMOSTRAS: 05 ml de sangue sem anticoagulante. 
 
MATERIAIS: 
Centrífuga sorológica de mesa. 
Estante de metal, porta tubos. 
Pipeta automática 50 µl e 100 µl e 1000 µl. 
Tubos de ensaio 10 x 75 mm. 
Negatoscópio para leitura. 
 
REAGENTES: 
Solução fisiológica. 
Suspensão de hemácias A1 e B, a 3-5%. 
 
PROCEDIMENTO: 
 
1. Em tubo de ensaio 10x75 mm, limpo preparar uma diluição do soro a ser testado a 
1/100 (diluição em solução fisiológica). 
AGÊNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITÁRIO JÚLIO MULLER 
Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N – Jardim Alvorada 
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2. Transferir 100 µl da diluição para dois tubos de ensaio 10x75mm, previamente 
identificados como, A1 e B. 
3. Adicionar aos tubos 50 ul das hemácias A1 e B, em seus respectivos tubos. 
4. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 
5. Realizar leitura e interpretar os resultados. 
 
INTERPRETAÇÃO: Aglutinação em um dos dois tubos, A1 e B indica presença de 
aglutininas salinas a um título maior que 1/100. 
Os soros que não aglutinarem é considerado de “baixo titulo” e este sangue pode ser 
usado para transfusão heteróloga. 
Os soros que aglutinarem para uma ou ambas as hemácias, deverão ser consideradas de 
“alto título” e não devem ser usados em transfusão Heteróloga. 
 
9. TITULAÇÃO DE ISOHEMAGLUTININAS 
 
OBJETIVO: Exame imunohematológico de auxilio no diagnóstico de incompatibilidade 
ABO materno-fetal. Este procedimento está sendo realizado no MT-
HEMOCENTRO. 
 
PRINCÍPIO: A titulação de isohemaglutininas anti-A e anti-B é realizada a fim de se 
obter a quantidade relativa de anticorpos presentes no soro ou plasma a ser testado. O 
titulo de um anticorpo é dado pela realização de diluições seriadas do soro contra 
hemácias contendo o antígeno correspondente. O resultado é obtido considerando-se a 
maior diluição do soro onde é observada a aglutinação. 
 
AMOSTRAS: 04 ml de sangue sem anticoagulante. 
 
MATERIAIS: 
Centrífuga sorológica de mesa. 
Estante de metal, porta tubos. 
Pipeta automática 50 µl e 100 µl e 1000 µl. 
Tubos de ensaio 10 x 75 mm. 
Negatoscópio para leitura. 
 
REAGENTES: 
Solução fisiológica. 
Hemácias de grupo A1 e B em suspensão de 2 a 5%, as quais podem ser obtidas 
comercialmente ou preparadas diariamente no laboratório. 
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PROCEDIMENTO: 
 
1. Preparar uma bateria de tubo 10x75 mm identificando-os como: 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 
1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024, 1/2048 e 1/4096, para uma titulação 
seriada. 
2. Com exceção do tubo 1/1, adicionar 100 µl de salina em todos. 
3. Adicionar 100 µl do soro a ser testado aos tubos 1/1 e 1/2. 
4. A partir do tubo 1/2 transferir 100 µl da mistura para o tubo seguinte 
sucessivamente. 
5. Reservar a ponteira no tubo 1/4096, caso seja necessário continuar as diluições. 
6. Com exceção do tubo 1/4096, adicionar 50 ul da suspensão de hemácias contendo o 
antígeno correspondente a tipagem reserva do soro teste. 
7. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos. 
8. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 
9. Realizar leitura e anotar os resultados. 
 
INTERPRETAÇÃO: Considerar como titulo a maior diluição do soro onde se observa 
aglutinação fidedigna. Em caso de soro teste O, efetuar uma bateria para Anti-A e 
outra para Anti-B. Soros de grupo AB, não terão titulo de isohemaglutininas. 
 
10. DIFERENCIAÇÃO ENTRE AGLUTINAÇÃO E FÊNOMENO DE ROLEAUX 
 
OBJETIVO: Descartar uma reação de falsa aglutinação 
 
PRINCÍPIO: O fenômeno de Roleaux, confundido com o de aglutinação, pode ser 
identificado microscopicamente e caracterizam-se por aderência das hemácias umas as 
outras se assemelhando uma pilha de moedas. É importante também conhecer o 
diagnóstico do paciente e o meio diluente dos reagentes usados (protéico ou salino). 
Pois, sabe-se que as globulinas normalmente estão aumentadas quando a proporção 2:1 
de albumina: globulina está invertida. 
 
MATERIAIS: 
Centrífuga sorológica de mesa. 
Estante de metal, porta tubos. 
Pipeta automática 50 µl e 100 µl e 1000 µl. 
Tubos de ensaio 10 x 75 mm e Negatoscópio para leitura. 
REAGENTES: Solução fisiológica. 
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PROCEDIMENTO (método tubo) 
 
1. Realizada a leitura do teste e detectado o fenômeno de Roleaux 
2. Recentrifugar o conteúdo do tubo por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 
1000 R.P.M.. 
3. Remover o soro do tubo teste e adicionar a mesma quantidade de salina (100 µl) 
homogeneizar. 
4. Centrifugar novamente por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 
5. Ressuspender o botão formado, realizando leitura. 
INTERPRETAÇÃO: Adicionando-se a salina o fenômeno de roleaux desaparece e 
havendo realmente aglutinação, esta permanecerá visível. 
Em caso de dúvida, observar em microscópio. 
 
11. TESTE DA ANTIGLOBULINA DIRETA (T.A.D.) 
 
OBJETIVO: Pesquisar sensibilização in vivo através de transfusão e gestação 
 
PRINCÍPIO: É utilizado para demonstrar-se a presença de hemácias recobertas por 
anticorpos in vivo, principalmente IgG e C3d. 
 
AMOSTRAS: 05 ml de sangue com anticoagulante. 
 
MATERIAIS: 
Centrífuga sorológica de mesa. 
Estante de metal, porta tubos. 
Pipeta automática 50 µl e 100 µl e 1000 µl. 
Tubos de ensaio 10 x 75 mm. 
Negatoscópio para leitura. 
 
REAGENTES: 
Soro anti-gama globulina humana poli específico (soro anti-humano). 
Soro anti-gama globulina humana mono específico (soro anti-IgG). O uso deste 
reagente é importante na diferenciação do tipo de globulinas presentes na superfície 
das hemácias a serem testadas 
Hemácias a serem testadas lavadas por no mínimo 03 vezes com solução fisiológica e 
preparadas em suspensão de 3-5%. 
Reagente comercial de hemácias controle, recobertas por anticorpos IgG. 
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PROCEDIMENTO (método tubo) 
 
1. Identificar 2 tubos de 10x75 mm um TESTE e um P “POSITIVO”), 
2. Pingar 1 gota das suspensão de hemácias (já lavada anteriormente) de 3-5% a ser 
testada “T” e o controle (controcel) no tubo “P” 
3. Pingar 2 gotas do soro de Coombs ou AGH em cada tubo 
4. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M ou 1 minuto a 1000 R.P.M, a fim de 
observar-se reação por anticorpos classe IgG e C3d (AGH). 
5. Realizar leitura e anotar os resultados. 
6. Observando-se ausência de aglutinação. 
7. Adicionar 1 gota de hemácias controle comerciais (controcel) no tubo T caso se 
observou reação negativa. 
8. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M ou 1 minuto a 1000 R.P.M. 
9. Realizar leitura, o resultado deverá ser positivocom intensidade de 3+/4+. 
 
Esta última etapa permite avaliar: 
 
Se as hemácias testes foram corretamente lavadas, caso contrário haverá 
neutralização dos anticorpos do reagente AGH pelas globulinas residuais presentes no 
soro do paciente, que não foram totalmente retiradas com a lavagem das hemácias, 
apresentando resultado falso-negativo, devendo-se assim repetir a pesquisa. 
Se o soro AGH que está sendo utilizada esta funcionando. Repetir a pesquisa caso não 
se observe aglutinação, utilizando um frasco novo de AGH. 
 
Interpretação 
Hemácias testes sem aglutinação e o controle com aglutinação indicam resultado 
negativo. Caso não seja observada aglutinação no tubo de hemácias controle devem-se 
desconsiderar os resultados do T.A.D. e realizar-se um novo procedimento. 
Em amostras com T.A.D. positivo, deverão ser realizados testes adicionais, incluindo-se 
eluição e pesquisa de frações de complementos e IgA. Não deverão ser liberados 
resultados antes da conclusão de toda a pesquisa. 
Reação Positiva: Presença de anticorpos. Presença de alo-anticorpos em casos de 
Doença Hemolítica do Recém-Nascido (D.H.R.N.) ou Reações Hemolíticas Pós-
Transfusionais. 
 
12. RESPONSABILIDADES: Dos colaboradores que executam as atividades neste 
setor. 
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Bioquímico 
Técnico de laboratório. 
Auxiliar de analises clinica. 
 
13. COMENTÁRIOS: Este manual foi elaborado e implantado para ser seguido por 
todos os profissionais envolvidos, padronizando todas as atividades desenvolvidas 
neste setor. 
 
 
14. NORMAS DE SEGURANÇA 
Os profissionais da área de saúde que manipulam materiais biológicos devem obedecer 
aos procedimentos básicos de biossegurança também deverão estar fazendo a 
segurança do meio ambiente. 
 
GERAIS: 
1. Descartar as lancetas, algodão e capilar dentro do descarpack. 
2. Nunca recapar as lancetas. 
3. Não abrir a centrífuga de microhematócrito antes da sua parada completa. 
4. Não jogar material biológico na pia. 
5. Fazer desinfecção concorrente no término de cada período e desinfecção terminal 
mensalmente. 
6. Lixo comum acondicionar em sacos escuros 
7. Lixo infectante acondicionar em sacos brancos leitoso 
8. Em caso de derramamento de material biológico, despeje hipoclorito de sódio 1% e 
deixe agir por 20 minutos, limpar com papel toalha e descartá-lo em recipiente 
apropriado. 
9. Todo material cortante, perfurante ou perfuro-cortante tais como ampolas, lâminas 
cortantes, agulhas e seringas, devem ser lacrados e enviados ao expurgo. Não 
despreze estes materiais em outros cestos de lixo. 
10. Caso ocorra algum ferimento durante seu trabalho, procure imediatamente o 
serviço médico dos funcionários para comunicar a ocorrência e receber orientação. 
11. Todo material cortante, perfurante ou perfuro-cortante tais como ampolas, lâminas 
cortantes, agulhas e seringas, devem ser lacrados e enviados ao expurgo. Não 
despreze estes materiais em outros cestos de lixo. 
12. As bolsas de hemocomponentes não devem ser colocadas diretamente nas latas ou 
depósitos de lixo; 
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13. Toda bolsa de sangue e hemocomponentes a ser descartada deve ser submetida a 
algum método que elimine a infectividade de patógenos eventualmente presentes; 
14. Depois de inativados as bolsas devem ser acondicionadas em sacos plásticos 
destinados a resíduos biológicos; 
15. É permitido o transporte de bolsas para serem incineradas em outros locais desde 
que, sejam transportados em recipientes rígidos, lacrados, identificados e em 
veículos apropriados; 
16. Os demais materiais que deverão ser desprezados tais como frascos de soros, 
seringas e equipos que não contenham sangue devem ser colocados em outro cesto 
de lixo. 
 
INDIVIDUAIS: 
1. Lavar as mãos antes e após qualquer procedimento. 
2. O papel utilizado para enxugar as mãos após a lavagem pode ser usado para fechar a 
torneira, evitando uma eventual "recontaminação". 
3. Troque as luvas imediatamente caso elas se contaminem com material biológico ou 
apresentem sinais de perfuração ou rompimento; 
4. Ao remover as luvas inverta-as completamente, evitando, que sua porção exterior 
entre em contato com qualquer superfície; 
5. Quando estiver utilizando luvas evitar tocar superfícies limpas, tais como 
telefones, mesas ou maçanetas de portas; 
6. Ao manipular o paciente utilize uma nova luva desprezando a anterior em local 
adequado. 
7. Utilizar os equipamentos de proteção individual. 
8. Trajar vestimentas totalmente brancas ou aventais longos brancos de mangas 
compridas, caso estejam trajando roupas que não sejam brancas; 
9. Troque o avental sempre que estiver sujo e/ou contaminado. 
10. Evitar sentar nas macas ou nas camas dos pacientes, sentar no chão, sentar nas 
mesas ou nos balcões existentes no ambulatório; 
11. É proibido comer, beber, fumar, cortar as unhas, passar cosmético ou colocar 
lentes de contato no setor; 
12. Cabelos longos devem ser presos; 
 
15. TREINAMENTO - Objetivo é o aprimoramento contínuo 
 
 Será dado treinamento a todos os colaboradores da AGÊNCIA 
TRANSFUSIONAL, antes da implantação deste manual de procedimentos, são 
responsabilidades dos colaboradores participarem dos treinamentos e implantá-los na 
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prática. A reciclagem será feita anualmente ou quando novos colaboradores sejam 
admitidos. 
 
16. FORMULÁRIOS/DOCUMENTOS RELACIONADOS 
 
Mapa para controle diário dos reagentes utilizados. 
 
17. CONTROLE DE REGISTRO: Deve-se ter registrado todos os exames 
realizados no setor e arquivados por 20 anos. 
 
18. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 
 
1. Issitt, Peter D. & Issitt, Charla H. “Applied Blood Group Serology”. Second Edition 
Second Repriting, jully 1977. Editora Spectra Biologicals (Division of Becton, 
Dickinson and Company B-D). 
2. Biotest S/A Industria E Comércio. “Triacel” Reagente de Glóbulos Vermelhos 
Humanos (bula). Médico Resp. Drº Jacob Rosenblit CRM 4313. 
3. Manual De Procedimentos Operacionais Padrão. “Fundação Pró-Sangue, São Paulo 
SP”. 
4. Padronização Laboratório de Compatibilidade UNICAMP 
5. Unidade de Pesquisa lmunohematológica HEMOAM 
6. Biotest s/a industria e comércio. “triacel” reagente de glóbulos vermelhos humanos 
(bula). médico resp. Drº Jacob Rosenblit CRM 4313. 
7. Manual de procedimentos operacionais padrão. “Fundação Pró-Sangue, São Paulo 
SP”. 
8. Marcelli. a. et alli. “Techniques en Imuno-hèmatologie”. mèdecine-sciences. 
flamarion. 1981. 
9. Lima, Callado Santos. “Curso de imunohematologia”. Faculdade de Medicina de 
Botucatu. UNESP. 1992. 
10. Technical Manual, American Association of Blood Banks 12 th edition, 1996. 
11. Conselho Federal de Enfermagem - Resolução COFEN – Nº 200 de 15 de Abril de 
1997 
12. ABO Revista de MEDICINA Transfusional, Número 12 – Dezembro de 2002 
13. Ministério de Estado da Saúde – Portaria No1353 de 13 de Junho de 2011.