Técnicas DNA recombinante II AULA PCR versus RT PCR 2015.2 (1)

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27/09/2015
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MÉTODOS PARA ANÁLISE DA 
EXPRESSÃO GÊNICA: PCR & PCR em 
Tempo Real
Disciplina: Biologia Molecular –
Curso: Farmácia 2015.2
Profa Michelly Cristiny Pereira
PORQUE SABER ESTAS 
TÉCNICAS?
ETAPAS DO PROCESSO P&D DE NOVOS 
MÉTODOS
Guido et al. (2010)
Análise dos alvos 
moleculares e vias 
de sinalização 
envolvidas no 
mecanismo de ação
Escolha do alvo terapêutico - etapa crucial do 
processo
- inspirará a estratégia mais adequada ao desenho 
estrutural dos novos padrões moleculares necessários 
ao eficiente reconhecimento molecular pelo alvo 
terapêutico eleito.
APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS
BUSCA DE NOVOS MARCADORES
PROGNÓSTICODIAGNÓSTICO PREDITIVO
FARMACODINÂMICO RECORRÊNCIA
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RELEMBRANDO ...
E para entender estas técnicas é 
necessário lembramos A ESTRUTURA 
DO DNA e os processos de 
REPLICAÇÃO
DNA & REPLICAÇÃO
Watson & Crick (1953) = definem estrutura DUPLA 
HÉLICE DO DNA
DNA & REPLICAÇÃO
 O Ácido 
Desoxirribonucléico é um 
polinucleotídeo formado 
por duas “fitas” ou hélices 
ligadas entre si por pontes 
de hidrogênio entre as 
bases nitrogenadas.
 O pareamento das bases 
sempre segue a mesma 
ordem: Adenina com 
Timina e Guanina com 
Citosina.
CARACTERÍSTICAS DO DNA (imprescindível 
para a REPLICAÇÃO
A estabilidade da dupla fita:
as pontes de hidrogênio
Molécula dupla helicoidal
Sempre com a adenina se
ligando a timina através de
duas pontes de hidrogênio e
a guanina se ligando a
citosina por três pontes de
hidrogênio
REPLICAÇÃO
ETAPAS:
1. Desenrolamento do DNA
2. Rompimento por ação enzimática (pontes de 
hidrogênio)
3. Incorporação de nucleotídeos do meio por 
complementaridade com formação de duas novas 
cadeias
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• O DNA é capaz de se autoduplicar
para conservar a informação
genética.
• Por ação de uma enzima chamada
DNA-polimerase novos nucleotídeos
são acrescidos
• Ao final se tem duas “moléculas-
filhas” que conservam a metade da
“molécula-mãe”.
• A duplicação é, portanto,
semiconservativa.
• Por convenção, a extremidade que
tem o fosfato é chamada 5’ e a que
tem o açucar é chamada 3’.
• O sentido de leitura e síntese é
sempre 5’ 3’.
REPLICAÇÃO
PCR - CONVENCIONAL
Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)
 Idéia de Kary B. Mullis, 1985
A descoberta trouxe enormes benefícios e 
desenvolvimento científico:
 o diagnóstico rápido de doenças infecciosas; 
 sequenciamento de genomas;
 a expressão de genes em sistemas recombinantes;
 o estudo de genética molecular;
 a determinação rápida da paternidade .
Reação em Cadeia pela Polimerase 
(PCR)
FASES:
DESNATURAÇÃO (95ºC)
ANELAMENTO (50-60ºC)
EXTENSÃO (37 = 72ºC – Taq polimerase termoestável)
Amplificação ocorre em escala logarítmica 
Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)
Esta técnica permite amplificar um segmento específico de uma
molécula de DNA usando dois primers ou iniciadores
(sequências curtas de nucleotídeos) complementares às
extremidades do segmento que se quer amplificar e uma DNA
polimerase.
Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)
Termociclador
automático
• dNTPs
• Taq polimerase (Thermus aquaticus)
• INICIADORES (PRIMERS)
• AMOSTRA - MOLDE
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• Antes de iniciar o ciclo o tubo com os reagentes é mantido a 
94 oC para garantir a desnaturação inicial de todo DNA alvo.
• Da mesma forma, ao terminar o ciclo, a manutenção do tubo a 
72 oC garante que todos as fitas tenham exatamente o mesmo 
número de bases.
Ciclo padrão de uma PCR
Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)
É importante observar que o conjunto de primers
escolhido é o responsável pela definição do segmento 
de DNA que vai ser amplificado. 
Outros fatores influenciam a especificidade da 
reação:
 temperatura de pareamento 
 a concentração de magnésio 
 o conteúdo de bases C e G do primer
A visualização por eletroforese em gel.
• gel de poliacrilamida = bandas de DNA coradas com 
nitrato de prata
- polímero de ligação cruzada de acrilamida. Polímero 
dependem da concentração usada (3,5 a 20%)
- possuem baixa capacidade de separação mas alta 
capacidade de resolução (fragmentos de menos de 500 bp.
- separa com diferença de apenas 1 base
• gel de agarose = bandas de DNA coradas com brometo 
de etídeo - visualiza as bandas por transiluminação UV, 
- polissacarídeo extraído de alga marinha. 
- Usada em concentrações de 0,5 to 2%. Não-tóxico.
- ampla capacidade de separação mas baixa resolução (200-
50000pb)
Análise dos produtos amplicados por PCR
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O menor dos produtos migra mais rápido
O gel de agarose separa bem fragmentos entre 
150 pb e 1000 pb
LIMITAÇÕES DA PCR convencional
• Intensa padronização
• Baixa sensibilidade e resolução
• Colorações não são quantitativas
• Contaminação com Brometo
• Discriminação baseado apenas no tamanho do 
amplicon
• Pobre discriminação entre tamanho dos amplicons
• Não automatizado (análise por eletroforese)
• Necessidade de pós-processamento do produto da 
PCR
• Resultados não são expressos em números
RT – PCR ou PCR em 
Tempo Real
A técnica denominada RT-PCR permite amplificar os 
trechos codificantes diretamente a partir de moléculas 
de mRNA
Mais sensível para a detecção e quantificação de 
mRNA atualmente disponível.
Técnica é sensível o suficiente para permitir a 
quantificação aproximada de RNA a partir de uma única 
célula. 
RT - PCR
ETAPAS PARA RT-PCR
Extração de RNA 
total da amostra
Tratamento com 
Dnase I
Síntese de cDNA
(Transcriptase
reversa)
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TIPOS DE QUANTIFICAÇÃO
ABSOLUTA
• Trabalha com unidades 
palpáveis
• Determina nº de cópias, 
quantidade em 
nanogramas
• Necessária CURVA 
PADRÃO para cada alvo
• Utilizado para quantificar 
amostras desconhecidas 
interpolando sua 
quantidade a partir de uma 
curva padrão
RELATIVA
• Avalia mudanças na 
expressão gênica de uma 
determinada amostra em 
relação a outra amostra 
referência (ex amostra 
controle não tratada)
• Resultados expressos em 
ordem de grandeza
• Análise através dos Cts
das amostras, gerando 
resultados relativos
• Dispensa curva padrão
Sistemas de Detecção: SYBR® Green e sondas 
de hidrólise (Taqman®)
 SYBR® Green
•Intercalante de DNA dupla fita;
•Fluoróforo em suspensão na
master mix;
•Inespecífico;
•Permite análise da curva de
dissociação (melting curve);
•Não permite multiplex (NÃO É
ESPECÍFICO)
 Curva de dissociação
•Ferramenta utilizada para detectar e discriminar moléculas
de ácido nucléico dupla-fita resultantes da reação de PCR;
•Temperatura de melting (Tm): temperatura na qual metade
do produto da PCR está dissociado (desnaturado);
•O Tm depende do tamanho do fragmento amplificado e
%CG;
•Quantidades diferentes de amostra amplificadas utilizando o
mesmo par de primers apresentam a mesma Tm.
SYBR® Green
 Curva de dissociação
 Curva de dissociação
•Produtos inespecíficos (dímeros) 
são comuns nos controles 
negativos (NTCs) e facilmente 
diferenciados pela curva de 
dissociação;
•Produtos inespecíficos (dímeros) 
também são comuns quando há 
excesso de primers em uma 
reação ou quando houve falha no 
desenho dos primers;
•Amplificação de produtos 
inespecíficos nas amostras em 
estudo pode alterar a qualidade 
dos resultados obtidos.
Sondas de hidrólise: Taqman®
• empresa Applied Biosystems desenvolveu
A PCR inclui além dos iniciadores (primers),
- uma sonda conjugada com um fluorocromo “repórter”
(emite fluorescência)
- e uma molécula “quencher” (absorve a fluorescência
emitida pelo“repórter” quando a sonda está intacta;
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•Baseia-se na atividade 5’-3’ exonuclease da
Taq polimerase;
•Altamente específico e sensível;
•Não precisa (nem permite) a análise da curva
de dissociação;
•Permite multiplex.
Sondas de hidrólise: Taqman®
•Tm da sonda deve ser ~10ºC maior que o Tm dos primers.
PARÂMETROS IMPORTANTES 
PARA ANÁLISE DA RT-PCR
Threshold (LIMIAR)
Nível arbitrário de fluorescência estabelecido acima do baseline e
dentro da região de amplificação exponencial.
Baseline (RUÍDO)
Fase onde a intensidade de sinal do produto amplificado ainda não
ultrapassou a intensidade de fluorescência encontrada no meio.
Threshold cycle (CT)
Número do ciclo da PCR no qual a fluorescência atinge o
threshold;
A posição de cada curva depende do número inicial de cópias de
DNA presentes em cada amostra;
O CT aumenta 1 (um) ciclo quando o número inicial de cópias na
reação é a metade.
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Amplification plot
Platô
Linear
Exponencial
Baseline
+
NTCs
Baseline
CONTROLE ENDÓGENO
Qual é o ideal?
Aquele cuja expressão gênica não tenha grandes 
variações entre os tecidos analisados!
GADPH 18S B-Actina
Glyceraldehyde 3-fosfato 
desidrogenase
Subunidade 
menor do ribossomo
Isoforma da actina
CONTROLE ENDÓGENO
Utilizado para corrigir variações relacionadas:
Quantidade de tecido utilizado na extração 
(número de células total)
 Eficiência de extração de RNA (p ex. tecidos 
diferentes)
 Eficiência da transcrição reversa (RT) e da 
amplificação (PCR)
Quantificação de RNA/cDNA inicial
 Pipetagem de RNA/cDNA nas reações
 Degradação de RNA/cDNA
Eficiência de amplificação
Depende de:
Pipetagem;
Qualidade da amostra;
Presença de inibidores (qualidade de extração);
Desenho dos primers;
Condições de termociclagem;
Qualidade e concentração dos reagentes;
Tamanho do amplicon (50-150pb).
ANÁLISE DOS RESULTADOS RT-PCR
CÁLCULOS
A expressão relativa 
calculada pela seguinte 
fórmula:
2-Ct, 
onde: Ct = ciclo de início de 
quantificação do transcrito; 
Ct = Ct do gene de 
interesse menos o Ct do 
gene referência; Ct = Ct
médio da amostra de 
interesse menos Ct médio 
da amostra referência.
PCR versus PCR EM TEMPO REAL
A reação de PCR no Taqman emprega em geral apenas 
duas temperaturas (94 oC para desnaturação e 60 oC, 
para hibridização e extensão)
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APLICAÇÕES
PCR 
convencional
RT-PCR
Genotipagem
Inserções/Deleções
Translocações
Eficácia de Quimioterapia
Detecção de Patógenos
Farmacogenômica
Carga Viral
Expressão Gênica
Transgênicos
MicroRNAs
siRNA knockdown
Farmacogenômica
Referências Bibliográficas
http://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.h
tml
Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of 
the Cell. 5th edition. New York: Garland Science; 2010.
Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time 
quantitative PCR. Genome Res, v.6, p.986-994, 1996.
http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAfQkAB/pcr-tempo-real
PRÁTICA DE ANÁLISE
ESTUDO PRÉ-CLÍNICO DE UMA NOVA MOLÉCULA 
DERIVADOS 
TIAZOLIDÍNICOS
CITOTOXICIDADE/SELETIVIDADE
SCREENING EM LINHAGENES 
TUMORAIS E NORMAIS (MTT)
ANÁLISE DE GENES MODULADOS POR 
ESTA NOVA MOLÉCULA
SERÁ QUE ELA DIMINUI A EXPRESSÃO DE GENES 
INDUTORES DA PROLIFERAÇÃO?
INDUZ MORTE CELULAR/ APOPTOSE?
INIBE INFLAMAÇÃO?
RT-PCR – ANÁLISE 
QUANTITATIVA
TRATAMENTO 
EXTRAÇÃO 
DE RNA
SINTESE 
DE cDNA
PCR CONVENCIONAL
(Avaliar qualidade)
RT-PCR
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OBRIGADA
Michelly Cristiny Pereira
Dep Fisiologia e Farmacologia
Email: michelly2305@yahoo.com.br