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Curso Prático para Auxiliar de Análises Clínicas Microbiologia Laboratório de Microbiologia Nas aulas práticas de microbiologia o objetivo é ensinar os princípios e os métodos utilizados em um laboratório de microbiologia. Pelo fato de se trabalhar com uma diversidade de bactérias, sendo algumas delas patogênicas ao homem, é essencial seguirmos as normas de segurança estabelecidas em um laboratório de microbiologia, a fim de evitarmos a contaminação dos estudantes,professores e funcionários. Desta forma algumas normas iniciais devem ser estabelecidas antes de iniciarmos as nossas atividades: 1- Desinfetar a bancada de trabalho no início e término de cada aula prática. Para isso, utilizamos o álcool comercial (70%). Tal prática diminui a contaminação das nossas culturas na área de trabalho; 2- Não comer, beber, ou fumar no laboratório. Se a bancada, equipamentos ou instrumentos tiverem sido contaminados acidentalmente com quaisquer microrganismos, comer ou fumar é um meio eficiente para autocontaminação; 3- Usar sempre um jaleco. Este não deve ser utilizado fora do laboratório, pois pode estar contaminado; 4- Lavar as mãos antes de iniciar as atividades no laboratório e ao término das mesmas; 5- Avisar ao professor ao a pessoa responsável em caso de contaminação acidental; 6- Não colocar materiais contaminados (pipetas, lâminas, etc) sobre a bancada ou na boca. Esses materiais devem ser descartados em locais ou recipientes apropriados que serão dispostos em cada bancada, contendo ou não uma solução descontaminante; 7- Cada aluno será responsável pelo material que receber; 8- Seguir as normas de uso dos aparelhos. O microscópio é um instrumento de trabalho valioso e deve ser manipulado cuidadosamente. Desta forma o aluno deverá saber como manipulá-lo. 9- Deve-se ter cuidado ao acender o bico de Bunsen. Substâncias inflamáveis não podem estar por perto. 10- Alças, agulhas e pinças devem ser flambadas antes e após o uso. Preparo dos corantes do Gram A finalidade da coloração é facilitar a observação microscópica das bactérias e diferenciá-las de acordo com as suas características morfotinturiais. Na prática, os corantes são divididos em dois grupos: ácidos básicos. Técnica do preparo dos corantes 1) Cristal violeta: 1g de cristal violeta; 2g de ácido fênico; 10 mL de álcool absoluto; 100mL de água destilada. Diluir o cristal violeta no álcool e juntar aos pouco o ácido fênico, misturando sempre, de modo a obter uma mistura bem homogenia. Juntar a água, pouco a pouco, misturando bem. Filtrar em papel de filtro após 24h de repouso. 2) Lugol: 1g de iodo: 2 g de iodeto de potássio; 300 mL de água destilada. Diluir o iodo com o iodeto de potássio em água e misturar bem. Preparar a solução em quantidade que seja usada antes de 30 dias. 3) Álcool acetona: 800 mL de álcool; 200 mL de acetona. Misturar as duas soluções. Éter acetona: 500 mL de éter e 500 mL de acetona. Misturar as duas soluções. Guardar em um recipiente com vedação já que as duas substâncias são voláteis. 4) Fucsina: 2,5g de fucsina; 100mL de álcool etílico; 90 mL de água destilada. A solução estoque (fucsina e álcool etílico) deve ser prepaparada unindo-se os dois componentes e Gram-negativa (E. coli) Gram-positiva (S. aureus)misturando bem. Para usar juntar 10mL da solução estoque em 90 mL de água destilada, ou seja, diluir 10% em água destilada. Todos os corantes devem ser armazenados em frasco de vidro âmbar em local com a temperatura entre 20 e 25oC (TA) e sem umidade. Meios de Cultura Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microrganismos. Eles fornecem os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento bacteriano Meio líquido: é aquele em que os nutrientes estão envolvidos em uma solução aquosa; Meio semi-sólido: este meio possui na sua composição, além dos nutrientes, uma pequena porcentagem de agar; Meio sólido: é um meio que possui na sua composição nutrientes e uma quantidade de agar maior do que o semi-sólido. Em torno de 1,5% (1,5g em 100mL); Meio enriquecedor: é aquele que permite o crescimento de microrganismos exigentes que necessitam fatores de crescimento, mas não inibem o crescimento de outros. Este meio, além das fontes nutritivas usuais, mencionadas anteriormente, pode possuir sangue, soro, carne moída, etc; Agar sangue Meio contendo carne moída (chopped meat) Meio seletivo: é aquele que contém substâncias que inibem o crescimento de certos microrganismos, porém seleciona aquele de interesse. Dentre as substâncias inibidoras estão o cristal violeta, cloreto de sódio, etc.; Agar manitol salgado Meio diferencial: este meio possui substâncias que evidenciam uma característica que permite separar um grupo ou espécie de microrganismo. Como por exemplo, carboidratos (lactose; Meio MacConkey); MacConkey Meios de triagem : meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro, meio Instituto Adolfo Lutz, uréia, etc.); A maioria dos meios de cultura são vendidos na forma de pó ou granulados. Após misturar cada um dos ingredientes, estes devem ser bem misturados e terem o pH aferido. Só então devem ser esterilizadas em uma autoclave (121oC por 15 min). Os meios líquidos devem ser distribuídos antes de serem Autoclavados. Dentre os termos utilizados para a limpeza dos materiais estão: Sanitação: é o tratamento que leva à diminuição da vida microbiana nos utensílios alimentares e equipamentos de manipulação de alimentos até os níveis seguros de saúde pública. Este processo é realizado com agentes químicos que podem ser sabão ou detergentes e desinfetantes do tipo sanitizantes. Esterilização: é a eliminação total dos microrganismos e endoesporos (esporos). Métodos químicos e físicos podem ser usados. Desinfecção: é a eliminação parcial (ou redução) do número de microrganismos (principalmente patogênicos) presentes em um material inanimado. A desinfecção é feita por agentes químicos – os desinfetantes. Pode também, como na descontaminação, ser realizada por método físico com água em ebulição e máquina automática de água quente (60oC-90oC) Descontaminação: é a limpeza realizada com agentes físicos ou químicos com o objetivo de remover agentes contaminantes, como fluidos e secreções corporais com agentes infecciosos. Pode ser feita também por fricção com esponja, pano ou escova, embebidos em produtos químicos. Após a limpeza por desinfecção, os artigos devem ser secos, guardados ou processados para esterilização. NORMAS DE SEGURANÇA AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de jaleco no laboratório. O jaleco deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), Não beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente: (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientespróprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes. Terminados os trabalhos práticos: a)Esterilizar alças e fios de platina; b) Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; c) Desligar lâmpadas e microscópios; d) Limpar microscópios e cobri-los com a capa; e) Tirar o avental e guardar; f) Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico. Cultivando bactérias de forma didatica. Objetivo Mostrar a existência de micróbios e como eles contaminam o meio de cultura. Material (para o meio de cultura) • 1 pacote de gelatina incolor • 1 xícara de caldo de carne • 1 copo de água Dissolver a gelatina incolor na água, conforme instruções do pacote. Misturar ao caldo de carne Material (para a experiência) • Duas placas de petri (ou duas tampas de margarina ou dois potinhos rasos), com o meio de cultura cobrindo o fundo • Cotonetes • Filme plástico • Etiquetas adesivas • Caneta Obrigado!
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