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Fisiologia 1 Microbiologia Larissa Silva dos Santos 1ª e di çã o Microbiologia DIREÇÃO SUPERIOR Chanceler Joaquim de Oliveira Reitora Marlene Salgado de Oliveira Presidente da Mantenedora Wellington Salgado de Oliveira Pró-Reitor de Planejamento e Finanças Wellington Salgado de Oliveira Pró-Reitor de Organização e Desenvolvimento Jefferson Salgado de Oliveira Pró-Reitor Administrativo Wallace Salgado de Oliveira Pró-Reitora Acadêmica Jaina dos Santos Mello Ferreira Pró-Reitor de Extensão Manuel de Souza Esteves DEPARTAMENTO DE ENSINO A DISTÂNCIA Gerência Nacional do EAD Bruno Mello Ferreira Gestor Acadêmico Diogo Pereira da Silva FICHA TÉCNICA Texto: Larissa Silva dos Santos Revisão Ortográfica: Rafael Dias de Carvalho Moraes & Christina Corrêa da Fonseca Projeto Gráfico e Editoração: Antonia Machado, Eduardo Bordoni, Fabrício Ramos e Victor Narciso Supervisão de Materiais Instrucionais: Antonia Machado Ilustração: Eduardo Bordoni e Fabrício Ramos Capa: Eduardo Bordoni e Fabrício Ramos COORDENAÇÃO GERAL: Departamento de Ensino a Distância Rua Marechal Deodoro 217, Centro, Niterói, RJ, CEP 24020-420 www.universo.edu.br Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Universo – Campus Niterói Bibliotecária: Informamos que é de única e exclusiva responsabilidade do autor a originalidade desta obra, não se r esponsabilizando a ASOEC pelo conteúdo do texto formulado. © Departamento de Ensi no a Dist ância - Universidade Salgado de Oliveira Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta publicação pode ser reproduzida, arquivada ou transmitida de nenhuma forma ou por nenhum meio sem permissão expressa e por escrito da Associação Salgado de Oliveira de Educação e Cultura, mantenedor a da Univer sidade Salgado de Oliveira (UNIVERSO). Microbiologia Palavra da Reitora Acompanhando as necessidades de um mundo cada vez mais complexo, exigente e necessitado de aprendizagem contínua, a Universidade Salgado de Oliveira (UNIVERSO) apresenta a UNIVERSO EAD, que reúne os diferentes segmentos do ensino a distância na universidade. Nosso programa foi desenvolvido segundo as diretrizes do MEC e baseado em experiências do gênero bem-sucedidas mundialmente. São inúmeras as vantagens de se estudar a distância e somente por meio dessa modalidade de ensino são sanadas as dificuldades de tempo e espaço presentes nos dias de hoje. O aluno tem a possibilidade de administrar seu próprio tempo e gerenciar seu estudo de acordo com sua disponibilidade, tornando-se responsável pela própria aprendizagem. O ensino a distância complementa os estudos presenciais à medida que permite que alunos e professores, fisicamente distanciados, possam estar a todo momento ligados por ferramentas de interação presentes na Internet através de nossa plataforma. Além disso, nosso material didático foi desenvolvido por professores especializados nessa modalidade de ensino, em que a clareza e objetividade são fundamentais para a perfeita compreensão dos conteúdos. A UNIVERSO tem uma história de sucesso no que diz respeito à educação a distância. Nossa experiência nos remete ao final da década de 80, com o bem- sucedido projeto Novo Saber. Hoje, oferece uma estrutura em constante processo de atualização, ampliando as possibilidades de acesso a cursos de atualização, graduação ou pós-graduação. Reafirmando seu compromisso com a excelência no ensino e compartilhando as novas tendências em educação, a UNIVERSO convida seu alunado a conhecer o programa e usufruir das vantagens que o estudar a distância proporciona. Seja bem-vindo à UNIVERSO EAD! Professora Marlene Salgado de Oliveira Reitora. Microbiologia 4 Microbiologia 5 Sumário Apresentação da disciplina ..................................................................................................7 Plano da disciplina ................................................................................................................. 9 Unidade 1 – Introdução à Microbiologia: Os aspectos gerais da célula bacteriana.....................................................................................................................13 Unidade 2 – Metabolismo e genética bacteriana ...........................................................39 Unidade 3 – Fatores de agressão bacteriana, análise laboratorial e antibacteriana. ........................................................................................................................ 63 Unidade 4 – Propriedades gerais dos vírus ......................................................................87 Unidade 5 – Patogênese das infecções virais e diagnóstico laboratorial das viroses. ...............................................................................................................................109 Unidade 6 – Micologia: uma visão geral ...........................................................................133 Considerações finais ..............................................................................................................155 Conhecendo a autora ............................................................................................................157 Referências ...............................................................................................................................159 Anexos.......................................................................................................................................161 Microbiologia 6 Microbiologia 7 Apresentação da disciplina Ao estudar microbiologia, será apresentado a você o mundo microscópico que nos cerca. Você passará a conhecer a classificação, as formas de identificação, a morfologia e a estrutura dos microrganismos. Através desta disciplina, você será capacitado a compreender os aspectos gerais da célula bacteriana, da partícula viral e dos agentes fúngicos. O estudo da microbiologia permite fazer conexões sobre a etiologia das doenças e os agentes causadores das mesmas. Motivos pelos quais, desde o século XVII, a microbiologia vem sendo investigada com tanta dedicação. Os conhecimentos sobre microbiologia estão aumentando com muita rapidez, conforme novos estudos são realizados em diversas áreas. Cada unidade deste material foi cuidadosamente confeccionada, a fim de abranger o que será útil para você obter um claro entendimento da importância dos microrganismos e de suas doenças associadas. O texto foi escrito de forma direta e simplificada, o que facilita a apreensão de novas informações por meio do ensino à distância. É importante ressaltar que a busca de material complementar irá auxiliar o seu processo de aprendizagem e ampliará sua visão sobre o mundo microbiano. No próprio ambiente virtual de aprendizagem, poderá ser encontrada uma biblioteca virtual com títulos que podem ser consultados. Aproveite ao máximo o conteúdo disponibilizado e bom estudo! Microbiologia 8 Microbiologia 9 Plano da disciplina A disciplina de microbiologia tem como objetivo fornecer conhecimentos sobre os aspectos gerais dos diversos microrganismos que integram o mundo microbiano que nos rodeia. Ela está dividida em 6 unidades, que vão dos aspectos estruturais bacterianos ao estudo das características gerais dos agentes fúngicos. Para que você possa compreender de forma ampla o que será encontrado na disciplina, foi confeccionado um resumo de cada unidade. Assim, você pode buscar fontes que complementemseus estudos. Unidade 1 – Introdução à Microbiologia: Os aspectos gerais da célula bacteriana Em nossa primeira unidade, vamos estudar a estrutura das células procariontes. Objetivos: Compreender a composição básica da estrutura celular bacteriana; Conhecer as diferentes funções dos componentes das células procariontes; Aprender a técnica de coloração de Gram; Diferenciar os tipos de parede celular bacteriana; Entender o processo de multiplicação bacteriana; Identificar em que condições as bactérias produzem esporos. Microbiologia 10 Unidade 2 – Metabolismo e genética bacteriana Na segunda unidade, iremos conhecer os processos que a bactéria utiliza para obter energia e caracterizar sua genética. Objetivos: Conhecer os elementos essenciais para o metabolismo bacteriano; Compreender os processos que a bactéria utiliza para obter energia; Entender o fluxo genético da célula bacteriana; Diferenciar os tipos de transferência genética entre bactérias. Unidade 3 - Fatores de agressão bacteriana, análise laboratorial e antibacteriana. Na unidade 3 conheceremos as características bacterianas de virulência, as técnicas mais utilizadas para o diagnóstico laboratorial em bacteriologia e o mecanismo de ação de alguns antibióticos. Objetivos: Compreender como as bactérias promovem agressão no hospedeiro; Compreender como são realizadas a esterilização e a desinfecção de materiais; Conhecer as principais técnicas empregadas no diagnóstico laboratorial de bactérias; Entender quando cada método diagnóstico deve ser aplicado; Identificar as diversas formas de ação dos antibióticos. Microbiologia 11 Unidade 4 - Propriedades gerais dos vírus Na unidade 4, estudaremos a estrutura viral e como os vírus se multiplicam. Objetivos: Conhecer a nomenclatura principal associada à virologia; Identificar as estruturas que compõem a partícula viral; Compreender as diferentes etapas da replicação viral. Unidade 5: Patogênese das infecções virais e diagnóstico laboratorial das viroses. Nesta unidade, veremos alguns aspectos da patogênese das infecções promovidas por vírus e as principais técnicas diagnósticas em virologia. Objetivos: Compreender como os vírus são transmitidos e disseminados; Conhecer as exigências para que uma infecção viral ocorra; Diferenciar os padrões e períodos da infecção viral; Identificar as diversas técnicas utilizadas no diagnóstico laboratorial em virologia. Microbiologia 12 Unidade 6: Micologia: uma visão geral Na unidade 6, estudaremos as características da célula fúngica, a patogênese das infecções por fungos e o diagnóstico laboratorial das micoses. Objetivos: Conhecer as estruturas que compõem a célula fúngica; Compreender como os fungos se multiplicam; Identificar as diversas características do fungo que podem levar ao surgimento de doenças; Conhecer algumas técnicas laboratoriais aplicadas no diagnóstico das micoses. Bons estudos! Microbiologia 13 Introdução à Microbiologia: Aspectos Gerais da Célula Bacteriana 1 Microbiologia 14 Em nossa primeira unidade vamos estudar a estrutura das células procariontes, aprender um pouco sobre a coloração de Gram e compreender como as bactérias se multiplicam e formam esporos. Objetivos da unidade: Compreender a composição básica da estrutura celular bacteriana; Conhecer as diferentes funções dos componentes das células procariontes; Aprender a técnica de coloração de Gram; Diferenciar os tipos de parede celular bacteriana; Entender o processo de multiplicação bacteriana; Identificar em que condições as bactérias produzem esporos. Plano da unidade: A célula bacteriana, sua multiplicação e formação de esporos Microbiologia: uma introdução Aspectos gerais da célula bacteriana Divisão celular bacteriana Esporos bacterianos Concluindo Bons estudos! Microbiologia 15 A célula bacteriana, sua multiplicação e formação de esporos 1.Microbiologia: uma introdução O mundo microbiano que o biólogo holandês Anton van Leeuwenhoek observou em uma gota de água, em 1674, através de suas lentes de microscópio, viria a ser, mais tarde, estudado com detalhes e grande interesse. Conforme a variedade grandiosa de seres microscópicos é estudada, pode-se conhecer melhor a origem das doenças infecciosas, bem como as formas de preveni-las, desenvolver antimicrobianos e técnicas diagnósticas, compreender processos epidemiológicos. A microbiologia é o ramo da ciência que estuda os seres microscópicos. Tais seres podem ser divididos em 4 grupos gerais: bactérias, vírus, fungos e determinados parasitas. Cada grupo apresenta seu próprio grau de complexidade. 2.Aspectos gerais da célula bacteriana Comparando células eucariontes e procariontes Todos os organismos vivos da Terra podem ser compostos por apenas um dos dois tipos de células existentes: células procariontes e eucariontes. As células procariontes exibem características como núcleo não delimitado por membrana, ausência de organelas membranares e cromossomo diferenciado. Todas as bactérias e algas cianofíceas são células procariontes. As células eucariontes possuem núcleo delimitado por uma membrana (carioteca), além de diversas organelas, tais como retículos endoplasmáticos liso e rugoso, aparelho de Golgi, dentre outras (Tabela 1.1). Microbiologia 16 Figura 1.1: Principais características de células procariontes (A) e eucariontes (B). (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 10) As bactérias apresentam tamanho muito pequeno e sua unidade de medida encontra-se na casa dos micrômetros (μm). Microbiologia 17 Tabela 1.1: Principais características das células eucariontes e procariontes. (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 11) Microbiologia 18 O formato e a disposição espacial das bactérias Dependendo de sua forma (figura 1.2), as bactérias podem ser classificadas em cocos, bacilos ou bastonetes, espirilos, espiroquetas e vibrios: Cocos: células de formato esférico. Bacilos ou bastonetes: células alongadas, de formato cilíndrico. Algumas bactérias podem apresentar comprimento semelhante à largura sendo assim denominadas cocobacilos. A identificação do cocobacilo deve ser realizada de forma cuidadosa. Vibrios: células curvadas, em formato de "vírgula". Espirilos: apresentam formato helicoidal ou espiral rígido. Espiroquetas: células em forma de espiral tortuosa. As bactérias podem se apresentar em arranjos ou agrupamentos celulares característicos. O tipo de arranjo depende do plano no qual as bactérias se dividem, bem como da tendência de ligação entre bactérias-filhas. Figura 1.2: Morfologia bacteriana: 1- Coco, 2- Bacilo, 3- Vibrio, 4- Espirilo e 5- Espiroqueta. (KUMAR, S., 2012, p. 19) Microbiologia 19 A disposição espacial dos cocos (figura 1.3) é classificada em: Diplococos: cocos dispostos em pares. Cadeias: cocos formando longas fileiras (por exp.: Estreptococos). Agrupamentos semelhantes a cachos de uva: cocos agrupados aleatoriamente (por exp.: Estafilococos) Tétrades: grupos de 4 células, formando, espacialmente, um "quadrado". Arranjos cúbicos: grupos de 8 cocos, formando, espacialmente, um "cubo". Os bacilos, por sua vez, assumem uma variedade limitada de arranjos, como o de cadeia (Estreptobacilos) e de diplobacilos.Figura 1.3: Disposição espacial dos cocos: 1- em cadeia, 2, 3, 4 e 5- diplococos, 6- tétrades, 7- arranjos cúbicos e 8- agrupamentos em "cachos de uva". (KUMAR, S., 2012, p. 20) Microbiologia 20 A estrutura bacteriana Componentes citoplasmáticos O citoplasma bacteriano contém várias estruturas, como DNA, RNA mensageiro (RNAm), ribossomos, produtos do metabolismo e proteínas. Grande parte do material genético bacteriano encontra-se organizada em um único cromossomo, diferentemente dos eucariontes. Esse cromossomo trata-se de uma fita dupla e circular de DNA e o local em que se encontra, na célula procarionte, é denominado nucleoide. Outra diferença em relação à célula eucarionte é que nesse material genético não são encontradas histonas. A ausência de membrana nuclear agiliza o processo de síntese de proteínas, havendo acoplamento da transcrição e da tradução, ou seja, os ribossomos se ligam livremente ao RNAm, fazendo com que as proteínas sejam sintetizadas à medida que esse RNA é formado. Outra estrutura que pode estar presente no citoplasma bacteriano é denominada plasmídeo. Os plasmídeos são moléculas menores de DNA circular extracromossomal. Essas formas genéticas podem ser compartilhadas entre bactérias podendo conferir-lhes vantagens como, por exemplo, resistência a um ou mais antibióticos. O citoplasma bacteriano possui ribossomos em grande quantidade, a concentração dessas estruturas é tão alta que acaba conferindo uma característica granular a esse citoplasma. O ribossomo bacteriano é formado pelas subunidades 30S+50S, originando o ribossomo 70S (o ribossomo eucarionte é 80S - 40S+60S). As proteínas e o próprio RNA ribossômico são diferentes dos contidos nos eucariotos, o que os torna alvos em potencial para a ação dos antibióticos. Microbiologia 21 Figura 1.4: Esquema representando as estruturas celulares de bactérias Gram positivas e Gram negativas. (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 10) Por fim, o citoplasma bacteriano é preenchido por uma substância aquosa, espessa e semitransparente. Essa substância é constituída, em sua maioria, por água, mas também possui proteínas, carboidratos, lipídios, íons. Nela também podem ser encontrados produtos do metabolismo bacteriano. Envoltórios bacterianos Membrana citoplasmática A membrana citoplasmática da célula procarionte apresenta uma bicamada lipídica semelhante à de células eucariontes, no entanto, não possui colesterol (os micoplasmas são exceção a essa regra). Além de lipídios, esse envoltório contém proteínas transportadoras para captura e liberação de substâncias, bombas iônicas, para a manutenção do potencial de membrana e enzimas. Microbiologia 22 Funções da membrana plasmática: I- Permeabilidade seletiva: controle da passagem de metabólitos II- Ação enzimática: na membrana encontram-se enzimas que participam da síntese de componentes celulares bem como da secreção de substâncias. III- Monitoramento de mudanças químicas e físicas através de proteínas quimiotáticas e sensoriais. IV- Participação na geração de energia química (ATP) V- Motilidade celular VI- Mediação da segregação cromossômica durante a multiplicação. Figura 1.5: Esquema representativo da membrana plasmática bacteriana. A parte interna está voltada para o citoplasma e a parte externa para o meio extracelular. (MADIGAN, MARTINKO, PARKER, 2008, p. 63) Parede celular Microbiologia 23 A estrutura e os componentes da parede celular bacteriana permitem a diferenciação das mesmas em Gram positivas ou Gram negativas. A maioria das células procariontes possui camada(s) de peptideoglicano (mureína) na parede celular, o que confere rigidez a esse componente. Funções da parede celular: I- Dar forma e rigidez à célula procarionte; II- Dar suporte à membrana plasmática para que a célula suporte a alta pressão osmótica interna; III- Manter o formato característico da bactéria; IV- Auxiliar a divisão celular; V- Auxiliar no processo de interação com outras bactérias e células animais; VI- Disponibilizar receptores protéicos e açúcares. A coloração de Gram O método de coloração de Gram é utilizado em larga escala como parte do diagnóstico laboratorial de quadros associados a infecções bacterianas. A técnica é simples e permite a diferenciação de bactérias Gram positivas e negativas de acordo com a coloração que as mesmas adquirem como resultado do método. A observação de determinada cor, após visualização em microscópio óptico, implica informações a respeito da constituição da parede celular da bactéria em questão. Bactérias coradas com roxo são denominadas Gram positivas e aquelas coradas com rosa/vermelho são Gram negativas. Descrição da técnica de coloração de Gram: 1- Sob condições adequadas, realizar o esfregaço bacteriano em lâmina estéril. 2- Cobrir o esfregaço com violeta-de-metila ou cristal violeta e deixar o corante agir por aproximadamente 1 minuto; 3- Lavar rapidamente em água destilada; Microbiologia 24 4- Cobrir a lâmina com lugol (mordente) e deixar agir por cerca de 1 minuto; 5- Lavar rapidamente em água destilada; 6- Lavar a lâmina com álcool etílico (99,5º GL); descorando-a, até que não se desprenda mais corante (aproximadamente 15 segundos)da mesma; 7- Lavar em água destilada; 8- Cobrir a lâmina com safranina ou fucsina e deixar agir por aproximadamente 30 segundos; 9- Lavar em água; 10- Deixar a lâmina secar ao ar livre, ou seque-a suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo; 11- Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço; 12- Visualizar a lâmina na objetiva de imersão (100 X) de um microscópio óptico. A coloração de Gram não somente permite a classificação bacteriana de acordo com os componentes de parede celular como também possibilita a caracterização da morfologia da bactéria, o que facilita a identificação da mesma. Figura 1.6: Esquema representativo da técnica de coloração de Gram. (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 12) Microbiologia 25 Bactérias que possuem paredes celulares atípicas ou não as possuem poderão não ser bem coradas através da técnica de Gram, exigindo o uso de métodos alternativos a esse. Bactérias Gram positivas A bactéria Gram positiva é aquela que se cora de roxo ao final da coloração de Gram. Sua parede celular (figura 1.7) é constituída por uma espessa camada de peptideoglicano, esse composto é similar ao exoesquelo dos insetos e é poroso o suficiente para permitir a passagem de substâncias para a membrana plasmática. Figura 1.7: Diagrama ilustrativo da parede celular bactérias Gram positivas. A parede celular encontra-se representada na parte superior da membrana plasmática. (MADIGAN, MARTINKO, PARKER, 2008, p. 72) O peptideoglicano é fundamental para a estrutura, a multiplicação e a sobrevivência a condições hostis por parte das bactérias, no entanto, pode ser degradado por uma enzima denominada lisozima. A lisozima pode ser encontrada Microbiologia 26 na lágrima e no muco humanos. A remoção dos peptideoglicanos promove a lise bacteriana, já que a célula é desestabilizada osmoticamente. As bactérias Gram positivas incluem em sua parede celular, além dos peptideoglicanos, os ácidos teicoico e lipoteicoico, e polissacarídeos complexos. O ácido teicoico é essencial para a viabilidade celular, já que se encontra ligado covalentemente aos peptideoglicanos. O ácido lipoteicoico contém um ácido graxo e ancora-se à membranaplasmática. Ambos os ácidos podem agir como toxinas e são ativadores da resposta imunológica. Bactérias Gram negativas A parede celular da bactéria Gram negativa (figura 1.8) é bem diferente da presente na Gram positiva. Ela é bem mais complexa e é constituída por uma camada de peptideoglicanos e uma membrana externa, entre esses dois estratos está o espaço periplasmático. Os peptideoglicanos estão presentes nessa parede celular formando uma fina camada, eles encontram-se ligados a lipoproteínas da membrana plasmática e da membrana externa. O espaço periplasmático encontra-se preenchido por um fluido em gel que contém uma alta concentração de enzimas e proteínas transportadoras. As lipoproteínas ligam-se aos peptideoglicanos por sua porção protéica e à membrana por sua porção lipídica, elas estabilizam a membrana externa e se ancoram à camada de peptideoglicanos. A membrana externa pode ser encontrada mais externamente à camada de peptideoglicanos. Sua constituição é de uma bicamada, a parte interna é formada por fosfolipídios e a externa por lipopolissacarídeos (LPS). Funções da membrana externa: I- Barreira protetora: previne ou retarda a entrada de sais, antibióticos e outras toxinas que podem promover danos à bactéria; Microbiologia 27 II- Proteínas transmembrana ou porinas: além do LPS, a membrana externa também contém várias proteínas fundamentais para o transporte seletivo de nutrientes para a célula. O lipopolissacarídeo, um componente exclusivo de parede celular de bactérias Gram negativas, é uma molécula complexa e importante ativadora da resposta imunológica. Uma vez no organismo humano, o LPS age como endotoxina e promove os mais diversos efeitos no hospedeiro, podendo variar de febre ao choque e à morte do indivíduo. Figura 1.8: Diagrama ilustrativo da parede celular das bactérias Gram negativas. A parede celular encontra-se situada mais externamente à membrana plasmática. (MADIGAN, MARTINKO, PARKER, 2008, p. 75) Microbiologia 28 - Cápsula Muitas bactérias sintetizam uma grande quantidade de polímeros extracelulares, quando esses polímeros formam uma camada condensada e bem definida, ela é denominada cápsula. A cápsula é geralmente composta por polissacarídeos, algumas bactérias apresentam cápsula polipeptídica. Funções da cápsula: I- Fator de virulência: cápsulas podem proteger as bactérias da fagocitose; II- Proteção da parede celular: a cápsula pode proteger a parede celular de diversos agentes antibacterianos, como bacteriófagos, sistema complemento e enzimas líticas; III- Identificação e tipificação bacteriana: o antígeno capsular é específico para cada bactéria e pode ser utilizado para a identificação da mesma. Estruturas externas -Flagelo As bactérias móveis possuem um ou mais filamentos longos e sinuosos, denominados flagelos. Os flagelos são estruturas que conferem à bactéria a capacidade de locomoção. Microbiologia 29 Figura 1.9: Flagelos bacterianos em números diversos em bactérias distintas (MADIGAN, MARTINKO, PARKER, 2008, p. 77 e 78). A estrutura do flagelo é descrita como filamentos helicoidais longos, geralmente bem mais compridos que a célula em si. Ela consiste em uma base protéica, a flagelina, a qual pertence ao mesmo grupo químico da miosina, a proteína contrátil dos músculos. Os flagelos podem estar presentes em bacilos Gram positivos e negativos. A maioria dos cocos é imóvel, enquanto metade dos bacilos e quase todos os espirilos possuem flagelos. Fímbrias (pili) Estruturas semelhantes a pelos, as fímbrias estão situadas na superfície externa da bactéria. Elas diferem dos flagelos pelo tamanho reduzido e são formadas por subunidades de proteínas denominadas pilinas. As fímbrias promovem adesão da bactéria a outras bactérias ou ao hospedeiro, elas estão associadas, inclusive, à conjugação, tipo de troca genética que ocorre entre bactérias (este tema será abordado na unidade seguinte). Exceções bacterianas Algumas bactérias são exceções ao modelo estrutural celular visto até então, as microbactérias, por exemplo, possuem uma camada de peptidoglicano ligada a Microbiologia 30 um polímero diferenciado e envolta por uma cobertura lipídica (ácido micólico, fator corda, cera D e sulfolipídeos). As micobactérias são consideradas álcool-ácido resistentes e devem ser corados por uma técnica diferente da de Gram. Os micoplasmas também são considerados exceções, já que não possuem parede celular de peptideoglicano, além de incluírem esteroides do hospedeiro em sua membrana. Tabela 1.2: Comparativo dos constituintes celulares bacterianos. (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 12) Microbiologia 31 3.Divisão celular bacteriana Para que as bactérias se multipliquem, a duplicação do cromossomo bacteriano dispara a divisão celular. Após a duplicação cromossômica, deve haver o crescimento e a extensão dos componentes da parede celular, seguidos da produção de um septo que separe a célula única em duas células-filhas. A divisão incompleta dos septos pode determinar a disposição espacial das bactérias (em cadeia, em cachos de uva etc.). Figura 1.10: Esquema representativo da divisão bacteriano, processo iniciado pela duplicação do cromossomo bacteriano. (MADIGAN, MARTINKO, PARKER, 2008, p. 129) Microbiologia 32 4.Esporos bacterianos Algumas bactérias Gram positivas têm como característica a produção de esporos (figura 1.11). Essas estruturas representam um estado de dormência, no qual a bactéria pode entrar em casos de condições inóspitas, como privação nutricional. Os esporos possuem vários envoltórios e são desidratados, o que permite que a bactéria persista no ambiente desfavorável. Além dessa capa, a estrutura contém uma cópia do cromossomo, quantidades mínimas de ribossomos e proteínas. O revestimento do esporo inclui uma membrana interna, 2 camadas de peptideoglicano e 1 envoltório protéico externo semelhante à queratina. Figura 1.11: Etapas da formação do esporo ou endósporo (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 21). Microbiologia 33 Nesta unidade iniciamos o estudo da microbiologia, bem como conhecemos os componentes da célula bacteriana. Na próxima unidade veremos como as bactérias obtêm energia para seus processos metabólicos e como seu material genético pode variar, o que implica a possibilidade de modificação das estruturas celulares procariontes. É hora de se avaliar Lembre-se de realizar as atividades desta unidade de estudo. Elas irão ajudá-lo a fixar o conteúdo, além de proporcionar sua autonomia no processo de ensino-aprendizagem. Microbiologia 34 Exercícios – unidade 1 1.Estruturas filamentosas, de natureza protéica, responsáveis pela locomoção bacteriana: a) Fímbrias b) Flagelos c) Cílios d) Pili e) Cápsula 2.A parede celular é uma estrutura externa à membrana plasmática e é importante para os organismos microbianos. Cada grupo de organismos tem peculiaridades na estrutura de sua parede celular. Assim, a opção que apresenta, respectivamente, os componentes exclusivos de parede de bactéria Gram-positiva e Gram-negativa é: a) ácido teicoico e peptideoglicano. b) ácido teicoico e mananas. c) peptideoglicano e membrana externa fosfolipídica. d) ácido teicoico e lipopolissacarídeo . e) peptideoglicano e enzimas 3.Em relação à estrutura física de bactérias, o grupo que se divideem dois ou três planos e permanece unido em grupos cúbicos de oito indivíduos é chamado: a) Estafilococos. b) Sarcina. c) Estreptococos. d) Diplococos. e) Diplobacilo Microbiologia 35 4.Em condições adversas, as bactérias podem formar internamente uma estrutura altamente resistente ao calor, falta de água e agentes físicos e químicos. Esta estrutura se chama: a) Flagelo b) Esporo ou endósporo c) Ácido teicoico d) Lipopolissacarídeo e) Pili 5.A coloração pelo método de Gram identifica as bactérias gram-positivas por apresentarem em sua parede celular, em relação às gram-negativas, um maior percentual de: a) Lipídeos; b) Proteínas citosólicas; c) Proteínas nucleares; d) Peptideoglicanos; e) Carboidratos. 6.Para que a divisão bacteriana seja deflagrada, o processo inicial é: a) Formação do septo celular; b) Alongamento da célula bacteriana; c) Intensa síntese de proteínas; d) Bipartição da parede celular; e) Duplicação do cromossomo bacteriano. Microbiologia 36 7.Dentre as funções da cápsula bacteriana encontra-se: a) Deflagração de transferência de material genético entre células bacterianas; b) Locomoção; c) Adesão a superfícies; d) Informação para síntese de proteínas; e) Produção de enzimas metabólicas. 8.Qual das opções a seguir apresenta termos associados exclusivamente a bactérias? a) eucarionte, cromossomo único, formato helicoidal b) procarionte, cromossomo único, plasmídeos c) intracelular obrigatório, procarionte, presença de aparelho de Golgi d) levedura, hifa, procarionte e) eucarionte, levedura, filamentoso 9- Ao realizar a coloração de Gram em uma amostra bacteriana, observou-se bactérias de cor roxa. O que isso significa em relação à estrutura das bactérias em questão? ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ Microbiologia 37 10- Faça um comparativo entre células eucariontes e procariontes. ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ Microbiologia 38 Microbiologia 39 , Metabolismo e Genética Bacterianos 2 Microbiologia 40 Nesta unidade, estudaremos os processos empregados pela bactéria para obter energia e como seu material genético pode sofrer variações. Objetivos da unidade: Conhecer os elementos essenciais para o metabolismo bacteriano; Compreender os processos que a bactéria utiliza para obter energia; Entender o fluxo genético da célula bacteriana; Diferenciar os tipos de transferência genética entre bactérias. Plano da unidade: As características metabólicas e genéticas da bactéria O metabolismo das bactérias Ciclo de crescimento bacteriano Genética bacteriana Bons estudos! Microbiologia 41 As características metabólicas e genéticas da bactéria 1.O metabolismo das bactérias Exigências do metabolismo bacteriano Para que as bactérias se multipliquem são necessárias fontes de energia e matéria-prima para a síntese de proteínas, estruturas e membranas que formam a célula procarionte. As bactérias diferem quanto às exigências metabólicas, algumas, ditas fastidiosas, requerem insumos metabólicos específicos para seu desenvolvimento. No entanto, de forma geral, as células procariontes precisam obter ou sintetizar aminoácidos, carboidratos e lipídios a fim de empregá-los na formação celular. O requisito mínimo para o crescimento é uma fonte de carbono e nitrogênio, uma fonte de energia, água e vários íons. Logo, existem elementos que são fundamentais para todas as bactérias. Quadro 2.1: Elementos fundamentais para o metabolismo bacteriano geral. Elementos essenciais para o metabolismo bacteriano Componentes de enzimas (Fe, Zn, Mn, Mo, Se, Co, Cu, Ni) Componentes de proteínas, lipídios e ácidos nucléicos (C, O, H, N, S, P) Íons fundamentais (K, Na, Mg, Ca, Cl) Considerando a necessidade de oxigênio, as bactérias podem ser classificadas como: I- Anaeróbios obrigatórios: quando o oxigênio age como veneno para a célula bacteriana. Os anaeróbios obrigatórios se desenvolvem apenas na ausência do gás, um exemplo dessa categoria inclui o Clostridium perfringens, causador da gangrena gasosa. Microbiologia 42 II- Aeróbios obrigatórios: bactérias que exigem a presença de oxigênio molecular para seu metabolismo e crescimento, sem o gás a célula procarionte entra em colapso e não sobrevive. A Mycobacterium tuberculosis, que causa a tuberculose, é considerada um aeróbio obrigatório. III- Anaeróbios facultativos: bactérias que crescem tanto na presença como na ausência de oxigênio. A maioria das bactérias pertence a essa categoria. De acordo com as exigências metabólicas bacterianas, e os produtos excretados pelas mesmas, pode-se classificar as bactérias, o que é essencial para a identificação laboratorial desses microrganismos. Testes laboratoriais conseguem determinar quais substratos as bactérias utilizam para a obtenção de energia (p. exemplo lactose), bem como quais substâncias secretam (p. exemplo etanol, ácido lático, ácido succínico). As bactérias que utilizam substâncias químicas inorgânicas como fonte de energia e carbono são ditas autotróficas (litotróficas), as que necessitam de fontes orgânicas são denominadas heterotróficas (organotróficas). Obtenção de energia Para que sobrevivam, todas as células necessitam de energia, até mesmo as procariontes. A unidade básica de energia utilizada por elas é a adenosina trifosfato (ATP), obtida a partir da quebra de vários substratos orgânicos (carboidratos, lipídios e proteínas). A parte do metabolismo em que ocorre a quebra de um substrato paraa obtenção energia é conhecida como catabolismo. Então, a energia produzida pode ser utilizada para a síntese de componentes estruturais da célula procarionte, como material genético, lipídios, proteínas), processo denominado anabolismo A obtenção de energia começa com a quebra de macromoléculas presentes no meio externo à bactéria, através de enzimas específicas. Essas macromoléculas são, então, reduzidas a moléculas menores (monossacarídeos, peptídeos curtos e ácidos graxos). As micromoléculas são transportadas através da membrana celular para o interior da bactéria, onde podem ser metabolizadas para a geração de energia (ATP). Microbiologia 43 Quadro 2.2: Micromoléculas necessárias aos seres vivosa. ((MADIGAN, MARTINKO, PARKER, 2008, p. 98) Elemento Função Celular Cromo (Cr) Requerido por mamíferos no metabolismo da glicose; microrganismos não o necessitam. Cobalto (Co) Vitamina B12; transcarboxilase (bactérias que metabolizam ácido propiônico). Cobre (Cu) Respiração; citocromo c oxidase; fotossíntese; plastocianina e algumas superóxido dismutases. Manganês (Mn) Ativador de muitas enzimas; presente em certas superóxido dismutases e na enzima que cliva a água, em fototróficos oxigênicos (Fotossistema II). Molibdênio (Mo) Certas enzimas contendo flavina; nitrogenase, nitrato redutase, sulfito oxidase, DMSO-TMAO redutases e algumas formato desidrogenases. Níquel (Ni) Maioria das hidrogenases; coenzima F430 de metanogênicos; monóxido de carbono desidrogenase; urease. Selênio (Se) Formato desidrogenase; algumas hidrogenases; no aminoácido selenocisteína. Tungstênio (W) Algumas formato desidrogenases; oxotransferases de hipertermófilos. Vanádio (V) Vanádio nitrogenase; bromoperoxidase. Zinco (Zn) Anidrase carbônica; álcool desidrogenase; RNA e DNA polimerases e muitas proteínas de ligação ao DNA. Ferro (Fe)* Citocromos; catalases; peroxidases; proteínas contendo ferro e enxofre; oxigenases; todas as nitrogenases. As moléculas obtidas do meio externo são metabolizadas, através de vias diversas, até um intermediário comum, o piruvato ou ácido pirúvico. Esse composto pode ser utilizado para obtenção de energia ou síntese de novos elementos. Para maiores detalhes sobre as reações bioquímicas que promovem a geração de energia, é aconselhada a consulta de um livro de bioquímica. Metabolismo da Glicose (Via Embden-Meyerhof-Parnas) As bactérias quebram a glicose através de diversas etapas para a geração de energia. São três as principais vias de catabolismo da glicose, a mais comum é a glicolítica (figura 2.1), ou via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), orientada para a conversão de glicose em piruvato. A via glicolítica ocorre tanto na presença quanto na ausência de oxigênio. Ela se inicia com a ativação da glicose para a síntese de glicose-6-fosfato. O saldo energético líquido da via glicolítica é de 2 moléculas de ATP (são geradas, no total, 4 moléculas de ATP por glicose utilizada na via, no entanto, duas dessas moléculas são empregadas na formação dos compostos intermediários do processo). No final da via há geração de piruvato. Microbiologia 44 Figura 2.1: Esquema representativo da via glicolítica. Ao final dessa via é obtido um saldo energético líquido de duas moléculas de ATP. (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 24). Microbiologia 45 Fermentação Em condições anaeróbias (ausência de oxigênio), o piruvato gerado pela glicólise, é empregado na fermentação. Nesse processo, o ácido pirúvico é convertido a vários produtos finais, dependendo da espécie bacteriana. São geradas, nessas reações, duas moléculas de ATP por glicose. A fermentação lática é a mais comum dentre as bactérias, já a alcoólica é observada com menos frequência. A conversão do ácido pirúvico em ácido lático é útil para a produção de iogurte e chucrute. Outras bactérias, através da fermentação, produzem álcoois, ácidos e gases frequentemente malcheirosos; esses produtos podem dar sabor a alguns queijos e vinhos, além de odores desagradáveis a feridas. Figura 2.2: Fermentação do ácido pirúvico por diversas bactérias. (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 25). Microbiologia 46 Ciclo dos ácidos tricarboxílicos Em condições aeróbias (presença de oxigênio), o piruvato é completamente metabolizado a água e gás carbônico, processo denominado ciclo dos ácidos tricarboxílicos. O ciclo dos ácidos tricarboxílicos é muito mais eficiente, em termos de geração de energia, do que a fermentação, podendo gerar até 38 moléculas de ATP. O ciclo também permite que carbonos derivados de lipídios sejam empregados na produção de energia e geração de produtos. Aminoácidos desaminados também podem entrar no ciclo. As vantagens do ciclo dos ácidos tricarboxílicos incluem a eficiência de geração de energia, a oxidação completa de aminoácidos, carboidratos e ácidos graxos, e a utilização de produtos intermediários para a síntese de outros compostos (lipídios, aminoácidos). Figura 2.3: O ciclo dos ácidos tricarboxílicos (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 25). Microbiologia 47 2- Ciclo de crescimento bacteriano O crescimento bacteriano em um recipiente fechado permite a confecção de uma curva representativa de dinâmica populacional (figura 2.4). Essa curva pode ser dividida em 4 fases: lag, log ou exponencial, estacionária e declínio. Figura 2.4: Curva de dinâmica populacional bacteriana (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 32). Fase lag Quando uma população bacteriana é inserida em um novo meio de cultura, ela não se multiplica imediatamente, primeiramente passa por um período de ajuste. Essa fase, em que as bactérias estão se adaptando ao novo meio, é denominada fase lag. Fase log ou exponencial A fase log ou exponencial é marcada pela divisão da célula bacteriana em duas, promovendo o aumento da população microbiana no meio de cultura. Normalmente, durante essa fase, as bactérias estão em condições mais "saudáveis", portanto as que se encontram na metade dessa etapa são utilizadas em estudos enzimáticos e de componentes celulares. Microbiologia 48 A taxa de crescimento da fase exponencial é influenciada por fatores ambientais (temperatura, disponibilidade de nutrientes) e por condições do próprio microrganismo. Fase estacionária O crescimento bacteriano exponencial, provavelmente, não acontecerá indefinidamente. A multiplicação bacteriana é limitada geralmente pelo consumo de um elemento essencial do meio de cultura e pela excreção de metabólitos possivelmente tóxicos, por parte dos próprios microrganismos. O momento em que ocorre a interrupção do crescimento bacteriano marca a fase estacionária. Na fase estacionária observa-se que não há mais aumento líquido do número de bactérias no meio de cultura. Algumas células podem continuar a se dividir menos intensamente, no entanto, outras já estão morrendo. Declínio A população bacteriana da fase estacionária, ao permanecer nas mesmas condições, pode continuar viva metabolizando ou morrer (declínio) 3- Genética bacteriana O material genético bacteriano é composto pelo cromossomo e eventuais plasmídeos que a célula bacteriana possa conter. Os genes, que compõem esse material genético, são sequências de nucleotídeos que apresentam alguma função biológica. Expressão gênica A expressão gênica da célula bacteriana envolve, assim como nos eucariontes, dois processos separados, mas que se inter-relacionam, a transcrição e a tradução. Microbiologia 49Quadro 2.4: Alguns fenótipos que os plasmídeos podem conferir à célula bacteriana (MADIGAN, MARTINKO, PARKER, 2008, p. 272). Classe fenotípicaa Organismosb Produção de antibióticos Streptomyces Conjugação Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium, Staphylococcus, Streptococcus, Sulfolobus, Vibrio Funções fisiológicas Degradação de octano, cânfora, naftaleno Pseudomonas Degradação de herbicidas Alcaligenes Formação de acetona e butanol Clostridium Utilização de lactose, sacarose ou uréia e fização de nitrogênio Bactérias entéricas Nodulação e fixação simbiótica de nitrogênio Rhizobium Produção de pigmentos Erwinia, Staphylococcus Resistência Resistência a antibióticos Campylobacter, Bactérias entéricas, Neisseria, Staphylococcus Resistência a cádmio, cobalto, mercúrio, níquel e/ou zinco Acidocella, Alcaligenes, Listeria, Pseudomonas, Staphylococcus Resistência à bacteriocina (e produção) Bacillus, Bactérias entéricas, Lactococcus, Propionibacterium Virulência Invasão da célula hospedeira Salmonella, Shigella, Yersinia Coagulase, hemolisina, enterotoxina Staphylococcus Enterotoxina, antígeno K Escherichia Tumorigenicidade em plantas Agrobacterium a Apenas alguns dos fenótipos diretamente associados aos plasmídeos estão listados. b Apenas alguns dos exemplos bem caracterizados estão listados. Todos os organismos citados pertencem ao domínio Bacteria, exceto Sulfolobus , que é um membro de Archaea. A transcrição envolve a síntese de RNA a partir de um molde de DNA, através de uma RNA polimerase, para que, posteriormente, sejam sintetizadas proteínas. A tradução é o processo de decodificação do RNAm, para que as proteínas sejam formadas A tradução requer 3 componentes principais, RNAm, ribossomos e RNAt (transportador), além de várias proteínas acessórias. O RNAm (mensageiro) é uma cópia temporária de informação genética, ele carrega a informação para a síntese de proteínas específicas. Os ribossomos são os locais para que a tradução ocorra, Microbiologia 50 facilitando a ligação de um aminoácido a outro. O RNAt se movimenta através da molécula de RNAm, transportando os aminoácidos para que o polipeptídeo seja formado. Considerando, ainda, o controle da expressão gênica, as bactérias desenvolveram mecanismos para se adaptar de forma eficiente às mudanças e desafios do ambiente. Elas apresentam mecanismos para coordenar e regular a expressão de genes. Por exemplo, uma mudança de temperatura pode significar entrada em um hospedeiro humano e indicar a do aumento da expressão de genes que contenham informações para o parasitismo ou para a virulência. Assim como a falta de nutrientes, e condições inóspitas, podem fazer com que algumas bactérias expressem genes relacionados à síntese de esporos. Outra característica interessante do material genético bacteriano é a presença de transposons (genes “saltadores”), sequências de DNA móveis que mudam de uma posição do genoma para outra ou entre diferentes moléculas de DNA (por exemplo, de plasmídeo para outro plasmídeo ou de plasmídeo para o cromossomo). Os transposons são encontrados tanto em procariontes quanto em eucariontes, seu tamanho pode variar de 150 a 1.500 pares de base e a sequência genética contém a informação mínima necessária para o deslocamento. Esses elementos móveis podem tanto carregar a informação para resistência a antibióticos, como se inserir em posições genômicas que levem à inativação de genes, levando a um resultado nem sempre benéfico para a bactéria. Mutações e mutantes Uma mutação é uma alteração, transmitida geneticamente, na sequência de bases que compõem o código genético de um organismo. Uma linhagem em que tal mudança esteja presente é denominada mutante. O mutante apresenta um genótipo (conjunto de genes) diferente da linhagem parental, tal diferença pode fazer com que suas propriedades observáveis (fenótipo) também estejam alteradas. Tipos de mutação a) Mutação espontânea: ocorrem ao acaso, na ausência de agente mutagênicos. Microbiologia 51 b) Mutação induzida: a frequência de mutações pode ser intensamente aumentada na presente de agentes mutagênicos (quadro 2.4), sejam físicos ou químicos. Quadro 2.4: Exemplos de agente mutagênicos (MADIGAN, MARTINKO, PARKER, 2008, p. 255) Agente Ação Resultado Análogo de bases 5-Bromouracil Incorporado como T; ocasional pareamento incorreto com G Par AT par GC Ocasionalmente GCAT 2-Aminopurina Incorporado como A; pareamento incorreto com C AT GC Ocasionalmente GCAT Agentes químicos que reagem com o DNA Ácido nitroso (HNO2) Desaminação de A e C AT GC e GC AT Hidroxilamina (NH2OH) Reage com C GC AT Agentes alquilantes Monofuncionais (por exemplo, etil metano sulfonato) Adiciona um grupo metil em G; pareamento incorreto com T. GC AT Bifuncionais (por exemplo, gás mostarda, mitomicina, nitrosoguanidina) Ligações cruzadas no DNA; regiões incorretas excisadas pela DNase. Tanto mutações pontuais como deleções. Corantes intercalantes Acridinas, brometo de etídio Inserção entre dois pares de bases. Microinserções e microdeleções Radiação Ultravioleta Formação de dímeros de pirimidina O reparo pode levar a erros ou deleções Radiação ionizante (por exemplo, raios X) Radicais livres podem atacar o DNA, quebrando as fitas. O reparo pode levar a erros ou deleções c) Mutações pontuais: as mutações pontuais afetam apenas um ponto (par de base) do gene, elas podem envolver uma mudança ou substituição de um diferente par de base. Além disso, esse tipo de mutação pode resultar em deleção ou adição de par de base. c.1) Substituições: quando um único nucleotídeo é substituído por outro. A substituição é denominada transição quando a base é trocada por outra de mesma natureza (por exemplo, uma purina por outra). Se uma purina for substituída por uma pirimidina, a troca é chamada transversão. Microbiologia 52 c.2) Inserções ou deleções: nesse caso, as bases podem estar duplicadas, inseridas adicionalmente em algum ponto do genoma ou subtraídas de alguma posição gênica (figura 2.5). Figura 2.5: Exemplos de tipos de mutação (modificado de KUMAR, S., 2012, p. 91). Transferência genética entre células bacterianas Outra forma pela qual as bactérias podem variar seu material genético é através das trocas genéticas. Existem 3 mecanismos para que isso ocorra: transformação, conjugação e transdução. Transformação A transformação (figura 2.6) é uma forma de troca genética em que as bactérias podem capturar fragmentos de DNA livre, no meio extracelular, e incorporá-los em seus genomas. Esse processo foi o primeiro mecanismo de transferência descoberto em bactérias. Tanto bactérias Gram positivas quanto Gram negativas podem capturar e manter estável o DNA exógeno. Bactérias competentes são aquelas que naturalmente são capazes de capturar DNA do meio extracelular, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Bacillus e Neisseria são exemplos de gêneros e espécies bacterianas que são competentes. Microbiologia 53 A engenharia genética utiliza métodos químicos ou eletroporação (utilização de impulsos elétricos) para fazer com que células bacterianas incorporem plasmídeos e outros DNAs. A técnica é empregada, por exemplo, em procedimentos de clonagem gênica, a qual possui os mais diversos objetivos, de multiplicação de um determinado fragmento genômico à tentativa de expressão de novas proteínas e estruturas na bactéria receptora do material genético. Figura 2.6: Esquema representativo datransformação. Para que a troca ocorra, uma bactéria sofre lise celular, liberando fragmentos de DNA. Uma segunda bactéria incorpora esse DNA livre ao seu material genômico (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 35). Conjugação A conjugação (figura 2.7) geralmente acontece entre microrganismos da mesma espécie ou entre espécies relacionadas e já foi descrita entre procariontes e células vegetais, animais e fúngicas. Microbiologia 54 A maior parte dos grandes plasmídeos conjugativos, aqueles que participam da conjugação, codifica proteínas que conferem característica de resistência a antibióticos. A troca genética baseia-se na transferência, em apenas uma direção, de DNA plasmidial de uma célula doadora (ou macho) para uma célula receptora (ou fêmea) através de um canal denominado pilus sexual. Alguns plasmídeos conjugativos, que carregam genes de resistência a antibióticos, característicos de bactérias Gram positivas, podem ser transferidos de uma célula para outra através de outras moléculas de adesão, ao invés do pili. A célula doadora é aquela que possui o plasmídeo conjugativo, enquanto a receptora não. Esse plasmídeo é assim denominado por transportar toda a informação genética necessária para que seja transferido, processo que envolve a produção dos pili sexuais e indução da síntese de DNA plasmidial. Microbiologia 55 O DNA transferido é uma cópia de fita simples do plasmídeo conjugativo, resultando na transferência de parte dessa sequência e de alguma porção do DNA cromossômico bacteriano até que a frágil conexão entra as duas células se rompa. Transdução A transdução é a transferência genética mediada por vírus bacterianos (bacteriófagos ou fagos). A transferência ocorre quando os bacteriófagos infectam uma dada célula bacteriana, ao transferirem seu material genético para o interior da célula bacteriana, a multiplicação viral (replicação) ocorre dentro dessa célula. Ao se formarem novas partículas virais, acidentalmente alguns desses fagos carregam fragmentos genéticos da bactéria primeiramente infectada. Essas partículas virais são liberadas e, ao infectarem uma nova célula bacteriana, acabam por transferir o material genético da primeira bactéria para a segunda que, então incorpora esse DNA ao seu próprio. Figura 2.8: Esquema representativo da transdução (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 35). Microbiologia 56 A transferência genética pode ser classificada como especializada se os fagos transferem genes específicos ou generalizada se a seleção de sequências é aleatória, como resultado de um empacotamento acidental de DNA do hospedeiro. Nesta unidade estudamos os mecanismos pelos quais as bactérias obtêm energia. Refletimos sobre o fluxo genético bacteriano, bem como sobre as trocas genéticas realizadas por essas bactérias . Na próxima unidade veremos como pode ser realizado o diagnóstico laboratorial das infecções bacterianas e conheceremos conceitos relacionados a esterilização e desinfecção. Leitura Complementar Sugestões de material complementar para leitura e vídeos No site youtube.com podem ser encontrados vídeos de domínio público sobre as trocas genéticas bacterianas. Transformação bacteriana/ Bacterial transformation: https://www.youtube.com/watch?v=jOmDkr8AU0s, por Biomedicina Brasil Conjugação bacteriana / Bacterial conjugation https://www.youtube.com/watch?v=lwzNOdF7L2c, por Biomedicina Brasil. Transduction (Generalized) [HD Animation https://www.youtube.com/watch?v=An9oItt7U9I, por Biology / Medicine Animations HD É hora de se avaliar Lembre-se de realizar as atividades desta unidade de estudo. Elas irão ajudá-lo a fixar o conteúdo, além de proporcionar sua autonomia no processo de ensino-aprendizagem. Microbiologia 57 Exercícios – unidade 2 1.Um estudante escreveu a seguinte descrição sobre o processo de reprodução das bactérias: “A bactéria doadora (macho) se une por meio de um pilus sexual a uma bactéria receptora.” Qual o processo de reprodução descrito na frase acima? a) Bipartição b) Conjugação c) Transformação d) Transdução e) Fissão 2.História de duas bactérias A bactéria Zi e a bactéria Wu encontram-se em um meio de cultura contendo um antibiótico A. Zi comenta com Wu: - “Esse antibiótico me deixa muito mal. Estou com dificuldade de sintetizar moléculas de RNA”. Responde Wu: - “Puxa, eu continuo produzindo normalmente proteínas e sinto-me muito bem. Zi, farei imediatamente uma ponte citoplasmática com você e vou lhe transferir um plasmídeo especial”. Um pouco depois, Zi comenta: - “Wu, muito obrigada, meu processo de síntese de proteínas se normalizou. Sou uma nova bactéria! Microbiologia 58 Com relação ao trecho descrito, é incorreto afirmar que a) a bactéria Zi, inicialmente, teve dificuldade de sintetizar moléculas de RNA e isso interferiu na síntese de proteínas. b) a bactéria Wu tem constituição genética que permite sobreviver em meio contendo o antibiótico A. c) ocorreu conjugação entre as bactérias Wu e Zi. d) a bactéria Zi recebeu molécula de RNA mensageiro presente no plasmídeo conjugativo, o que lhe garantiu resistência ao antibiótico A. e) a bactéria Wu transferiu DNA para a bactéria Zi. 3.Os microrganismos que sobrevivem somente na presença de oxigênio são denominados: a) Anaeróbios facultativos b) Aeróbios obrigatórios c) Anaeróbios obrigatórios d) Lipofílicos e) Psicrotrófilos 4.Em condições anaeróbias, o piruvato gerado na glicólise é empregado em que reação para a obtenção de energia? a) ciclo dos ácidos tricarboxílicos b) via da pentose alcalina c) fermentação d) cadeia respiratória e) hidrólise de macromoléculas Microbiologia 59 5.Uma bactéria estritamente aeróbia pode obter energia através de que vias? a) glicólise - ciclo dos ácidos tricarboxílicos b) via da pentose fosfato - fermentação c) ciclo dos ácidos tricarboxílicos- fermentação d) fermentação - via da pentose fosfato e) glicólise- fermentação 6.Durante a transformação: a) O DNA bacteriano é transferido de uma bactéria para outra através do bacteriófago. b) O DNA bacteriano é transferido de uma bactéria para outra através de transposons c) Há transferência de material genético bacteriano através de canais de membrana d) A bactéria incorpora DNA livre, do meio externo, ao seu próprio material genético e) A bactéria incorpora DNA de bacteriófagos ao seu próprio material genético. 7.Para que consigam energia, as bactérias devem obter micromoléculas (monossacarídeos, peptídeos curtos e ácidos graxos) a serem utilizadas em vias diversas. Como elas conseguem essas micromoléculas? a) hidrólise de macromoléculas, no meio extracelular, através de enzimas específicas b) transporte enzimático de macromoléculas pela membrana c) quebra intracelular de macromoléculas d) transporte passivo de estruturas protéicas e) oxidação de micromoléculas lipídicas Microbiologia 60 8.Todas as opções a seguir caracterizam formas de uma bactéria sofrer variações em seu material genético, exceto: a) mutação b) glicólise c) conjugação d) transdução e) transformação 9.Após a inserção de bactérias em um meio de cultura sem reposição, como poderia ser descrita a dinâmica de crescimento da população bacteriana em questão? ______________________________________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ Microbiologia 61 10.Uma população bacteriana presente na laringe de crianças africanas era causadora de laringite aguda. Ao constatar a condição, médicos da região sempre receitavam tetraciclina e, assim, eliminavam a fonte do problema. Em um determinado momento, o antibiótico em questão passou a não mais funcionar. Ao analisar-se uma das crianças em que o medicamento não surtiu efeito, encontrou- se na laringe da mesma bacteriófagos T3 até então nunca observados nos casos. Tendo em vista a problemática, os médicos passaram, então, a prescrever outros medicamentos mais potentes. Considerando o texto anterior e com base nos conhecimentos sobre transferência genética bacteriana, responda: Qual seria uma possível explicação para o comportamento bacteriano de resistência observado? ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ Microbiologia 62 Microbiologia 63 Fatores de Agressão Bacteriana, Análise Laboratorial e Antibacterianos 3 Microbiologia 64 Nesta unidade, estudaremos os mecanismos de patogênese bacteriana, alguns métodos para diagnóstico laboratorial bacteriano e as principais classes de antibacterianos. Objetivos da unidade: Compreender como as bactérias promovem agressão no hospedeiro; Compreender como são realizadas a esterilização e a desinfecção de materiais; Conhecer as principais técnicas empregadas no diagnóstico laboratorial de bactérias; Entender quando cada método diagnóstico deve ser aplicado; Identificar as diversas formas de ação dos antibióticos. Plano da unidade: Patogênese bacteriana Diagnóstico laboratorial em bacteriologia Antibacterianos Concluindo Bons estudos! Microbiologia 65 Patogênese, análise laboratorial e antibacterianos 1- Patogênese bacteriana O corpo humano, para as bactérias, é uma fonte de umidade, calor e alimentos. Elas possuem características que fazem com que tenham capacidade de invadir um hospedeiro, permanecer (adesão ou colonização) nele, conseguir fontes de nutrientes (enzimas degradativas) e evadir da defesa do hospedeiro. Ao tentarem persistir no hospedeiro, os mecanismos utilizados pelas bactérias, bem como seus produtos do crescimento, podem causar danos e prejudicar o corpo humano. As bactérias podem ser encontradas em todos os ambientes, uma vez que dispõem de mecanismos que possibilitam a conservação da sua viabilidade por longos períodos de estresse. São capazes de desempenhar diversas funções quando em equilíbrio com os seres vivos que compartilham o mesmo habitat e ainda com os seres que mantém relações. O crescimento bacteriano no organismo do hospedeiro, sem causar agressão é chamado de colonização, no entanto, o mesmo microrganismo é capaz de promover infecção, podendo ou não estar associada a manifestações clínicas, que caracterizam diversificadas patologias, sendo adquiridas tanto no ambiente comunitário como no hospitalar. No meio hospitalar, as bactérias sofrem várias pressões do ambiente, enfatizando o uso de múltiplos antimicrobianos que selecionam cepas mais resistentes. Infecções relacionadas a ambientes hospitalares são adquiridas pelos pacientes no decorrer de sua internação, tendo relação direta com o tempo de internação e a alta morbimortalidade, dispondo de um acompanhamento de alto custo, tornando-se oneroso para todas as partes envolvidas. O manejo dessas infecções ainda é um desafio a ser controlado nos sistemas de saúde e pelas práticas epidemiológicas. Superfícies secas e aparentemente limpas, em ambiente hospitalar, podem ser possíveis reservatórios de bactérias, que conseguem manter a capacidade de sobrevivência, através de um estado de Microbiologia 66 bacteriostase (sem multiplicação), sendo capaz de garantir seu potencial patogênico por longos períodos nessa condição. As bactérias possuem, como um de seus mecanismos de agressão, a produção de toxinas, produtos bacterianos que danificam diretamente o tecido ou promovem atividades biológicas destrutivas. Essas toxinas podem ser classificadas como: -Exotoxinas: proteínas que podem ser produzidas por bactérias Gram positivas ou Gram negativas e incluem enzimas citolíticas e proteínas, que se ligam a receptores que alteram a função ou destroem as células. São exemplos de exotoxinas as enzimas degradativas (proteases, colagenases etc), as toxinas A-B (como a botulínica) e os superantígenos (afetam a função do sistema imunológico). -Endotoxina: constituinte bacteriano que pode ser liberado no hospedeiro, somente as bactérias Gram negativas produzem endotoxina. Um exemplo de endotoxina é o LPS. Figura 3.1: As diversas ações do LPS. CID: coagulação intravascular disseminada, IFN-γ: interferon γ; IgE: imunoglobulina E; IL-1: interleucina 1; PMN: leucócito polimorfonuclear (neutrófilo); TNF: fator de necrose tumoral. (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 185). Microbiologia 67 Enfermidade e seus Determinantes A doença não ocorre ao acaso na população. A forma como ocorre é previsível porque existem determinantes ou fatores que interferem e que aumentam o risco de doença mais em uma população do que em outra. Doença: A doença ocorre quando há perturbação funcional dos processos fisiológicos a nível celular. Isto ocorre quando o indivíduo, ou população, é exposto a condições ambientais desfavoráveis, a agentes e / ou aos fatores genéticos que levam a essas alterações. A alteração dos processos fisiológicos é exteriorizada em sintomas e/ou sinais de doença. Sintomas/Sinais Clínicos: Sintomas são os efeitos das alterações fisiológicas sentidos pelo próprio indivíduo (dor,tontura, náusea). Os sinais (clínicos) são os efeitos das alterações fisiológicas que podem ser observados ou medidos por outros indivíduos. São exemplos: a febre, inapetência, o vômito, alteração da locomoção etc. Quando o indivíduo é exposto a um agente pode ser que haja doença. Para que isso aconteça: (i) O agente deve estar presente numa concentração suficiente e durante um tempo determinado. (ii) deve haver interação com outros fatores (genéticos e / ou ambientais) que contribuam para aumentar a capacidade do agente (maior dose ou maior contato) de causar doença ou de diminuir a resistência do hospedeiro (desnutrição, stress). Período de incubação: É o tempo que decorre desde a exposição até aparecerem os sinais clínicos. Infecção: Definida como invasão do hospedeiro por outro organismo A perturbação da relação entre hospedeiro-agente-ambiente e o desenvolvimento do estímulo da doença pode ocorrer quando: a) O agente torna-se virulento, é aplicado em grandes doses ou teve mais contato com o hospedeiro. b) A resistência do hospedeiro foi diminuída por causa de desnutrição, exposição, stress, fatores genéticos. Microbiologia 68 c) O ambiente pode contribuir para a invasão do hospedeiro pelo agente ou para a ruptura da resistência do hospedeiro. 2- Diagnóstico laboratorial Esterilização e a desinfecção de materiais A escolha e a organização dos métodos de desinfecção e esterilização devem ser baseadas em recomendações de cunho científico e reconhecidas a nível nacional e internacional. Para adequada escolha nos processos de utilização e tratamento dos materiais, estes devem ser divididos nas categorias críticos, semicríticos e não críticos. Materiais críticos são aqueles que entram em contato tecidos ou líquidos estéreis, apresentando alto risco de contaminação; materiais semicríticos são os que entram em contato com mucosas e os não críticos aqueles que só entram em contato com pele íntegra. De uma forma geral, durante os processos de tratamento, os materiais críticos devem ser esterilizados ou de uso único (descartáveis), os materiais semicríticos devem passar por esterilização ou, no mínimo, desinfecção. Já os materiais não críticos devem ser desinfetados ou no mínimo limpos. Para uma melhor compreensão do processo de tratamento de materiais, alguns termos devem ser definidos, conforme descrito a seguir: Descontaminação: eliminação parcial ou total de microrganismos de materiais ou superfícies inanimadas. Antissepsia: eliminação de microrganismos da pele, mucosa ou tecidos vivos, com auxílio de antissépticos, substâncias microbicidas. Assepsia: métodos empregados para impedir a contaminação de determinado material ou superfície. Limpeza: remoção mecânica e/ou química de sujidades em geral, (oleosidade, umidade, matéria orgânica, poeira, entre outros) de determinado local. Desinfecção: eliminação de microrganismos, exceto esporulados, de materiais ou artigos inanimados, através de processo físico ou químico, com auxílio de desinfetantes. Microbiologia 69 Esterilização: destruição de todos os microrganismos, inclusive esporulados, através de processo químico ou físico. Todo o processo de limpeza, desinfecção ou esterilização de materiais deve ser realizado em um local especial, uma sala de tratamento de materiais. Portanto, após cada uso, todos os materiais utilizados devem ser levados para a sala de materiais, para seu adequado processamento. LIMPEZA DE MATERIAIS: Antes da desinfecção ou esterilização de qualquer tipo de material é fundamental que seja realizada uma adequada limpeza, para que resíduos de matéria orgânica que possam ficar presentes nos materiais não interfiram na qualidade dos processos de desinfecção e esterilização. A limpeza dos materiais pode ser realizada através de métodos mecânicos, físicos ou químicos. Durante a limpeza mecânica é fundamental uma vigorosa escovação dos materiais, com auxílio de sabão e escovas de diferentes formatos. As escovas também devem sofrer processo de limpeza e desinfecção. Para uma adequada descontaminação, as escovas podem ser mergulhadas em hipoclorito de sódio a 1%, em recipiente plástico, durante 30 minutos, posteriormente enxaguadas e secas (em cima da estufa, por exemplo). Devem ser utilizadas barreiras de proteção pelo profissional que exerce a limpeza dos materiais, através de luvas de borracha grossas e de cano longo, máscaras e óculos de proteção. Os materiais devem ser devidamente enxaguados e secos após sua limpeza. As compressas ou panos utilizados para secar o material devem ser somente para este fim e devem ser substituídos frequentemente. Processos químicos também podem auxiliar na limpeza dos materiais, como por exemplo, através do uso de desincrustantes, soluções enzimáticas ou aparelhos de ultrassom, que auxiliam na remoção de matéria orgânica. Podem ser utilizadas soluções anti-ferrugem em instrumentos e materiais metálicos, para aumentar a vida útil dos mesmos. DESINFECÇÃO DE MATERIAIS: A decisão para a escolha de um desinfetante deve levar em consideração aspectos que envolvam efetividade, toxicidade, compatibilidade, efeito residual, solubilidade, estabilidade, odor, facilidade de uso e custos, entre outros. Além disso, é importante que o desinfetante seja recomendado e aprovado pelo Ministério da Saúde. A desinfecção e/ou Microbiologia 70 esterilização através de agentes químicos muitas vezes não se apresenta como um método seguro e confiável devido às interferências pertinentes ao uso de desinfetantes e suas dificuldades durante o processo, referentes à possibilidade de inadequada desinfecção ou recontaminação do material. A escolha do tipo de desinfetante, métodos adequados de desinfecção, bem como a organização de todo este processo, não é uma tarefa fácil. Vários guias e manuais de recomendações têm sido publicados com o objetivo de orientar os profissionais para uma adequada desinfecção de materiais. Os agentes químicos desinfetantes comumente utilizados são os alcoóis, compostos clorados, formaldeído, iodóforos, peróxido de hidrogênio, ácido peracético, compostos fenólicos e quaternários de amônia. ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS: A esterilização de materiais pode ser realizada através de métodos químicos ou físicos. A esterilização química compreende a utilização de agentes esterilizantes líquidos, que são os mesmos utilizados no processo de desinfecção, porém com maior tempo de exposição. A esterilização química apresenta alguns aspectos negativos, especialmente referentes ao risco de recontaminação do material após o processo, dificuldade de armazenamento e de controle de qualidade ou monitoramento do processo. A esterilização física pode ser conseguida através de métodos ou equipamentos que empregam calor seco (por exemplo, estufa) e através de vapor saturado (por exemplo, autoclaves). - Esterilização através de estufa: A estufa, na prática, ainda é o método de escolha para esterilização de instrumentos metálicos utilizados em estabelecimentos de saúde. Através deste método, não é possível esterilizar materiais plásticos ou outros materiais termossensíveis, assim como não é recomendável esterilizar roupas, papel, nem instrumentos metálicos cortantes. Para uma efetiva esterilização dos materiais, a estufa deve ser mantida fechada ininterruptamente durante 60 minutos com a temperatura a 170° C, ou 120 minutos com a temperatura a 160° C, ou seja, a porta não deve ser aberta neste período. Todos os materiais devem ser esterilizados dentro de recipientes metálicos. - Esterilização através de autoclave a vapor:A esterilização por autoclave a vapor tem se apresentado como o método que reúne mais vantagens para o Microbiologia 71 tratamento de instrumentos clínicos nos últimos anos. As vantagens deste método baseiam-se na sua maior segurança, menor dano aos materiais e menor tempo requerido. A desvantagem encontra-se na impossibilidade de esterilização de materiais termossensíveis ou não resistentes ao calor, como por exemplo, materiais plásticos delicados. Toda matéria orgânica, independente da fonte, deve ser considerada potencialmente infectante. Portanto, todo material após o contato com o organismo humano é considerado contaminado, independentemente do processo a ser submetido, sem levar em consideração o grau de sujidade presente. Principais técnicas empregadas no diagnóstico laboratorial de bactérias O diagnóstico microbiológico, especialmente o bacteriano, é uma medida essencial no estabelecimento da etiologia das enfermidades infecciosas por ter a capacidade fundamental de identificação do agente patológico e, mais atualmente, a sensibilidade in vitro a antimicrobianos. Os métodos de diagnóstico em bacteriologia são altamente dependentes da comunicação entre o médico que acompanha o paciente e o laboratório responsável pelos exames. Nessa comunicação são repassadas informações necessárias ao direcionamento da escolha do teste a ser realizado. Contudo, a comunicação é o primeiro passo que caracteriza o diagnóstico, vários outros itens devem ser observados como: - Amostra: para que no laboratório seja feito um diagnóstico eficaz, a amostra colhida precisa respeitar preceitos de higiene que evite a contaminação desta por microrganismos que “mascarem” o verdadeiro agente infeccioso. Outro quesito essencial é observar a procedência da amostra, por exemplo, amostras de pus em geral são ricas em bactérias anaeróbias (morrem na presença de oxigênio), sendo assim, deve-se estar atento à melhor metodologia para diminuir o contato da amostra com o ar a fim de não inviabilizar os microrganismos. - Coleta: etapa que requer vários cuidados como observar se o paciente fez uso de algum medicamento, antibióticos por exemplo. Esses medicamentos podem afetar o agente patogênico tornando ineficazes os outros passos para diagnóstico laboratorial. O paciente deve ser aconselhado pelo clínico, caso seja ele próprio que realize a coleta, para que não haja erros nessa etapa. Microbiologia 72 Tabela 3.1: Coleta de amostras para diagnóstico laboratorial. (MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 189). Amostra Sistema de Transporte Volume de Amostra Outras Considerações Sangue - cultura bacteriana de rotina Frascos de hemocultura contendo meio nutriente Adultos: 20mL / cultura Criança: 5 - 10mL / cultura Neonatos: 1 - 2mL / cultura Deve ser realizada a assepsia da pele com álcool - 70%, seguida de iodo 2%; 2-3 amostras coletadas a cada 24 horas, a menos que o paciente esteja em choque séptico ou a administração de antibióticos tenha que ser iniciada imediatamente; a coleta de sangue deve ter intervalos de 30-60 min; o sangue é aliquotado em partes iguais, que devem ser inoculadas em dois frascos contendo meio nutriente. Sangue - bactéria intracelular (p. ex., Brucella, Francisella, Neisseria spp.) Semelhante a hemoculturas de rotina; sistema de lise-centrifugação Semelhante a hemoculturas de rotina As considerações são as mesmas que as de hemoculturas de rotina; a liberação de bactérias intracelulares para o meio pode otimizar o isolamento do organismo; espécies de Neisseria são inibidas por alguns anticoagulantes (polianetolsulfonato de sódio). Sangue - Leptospira spp. Tubo heparinizado estéril 1 - 5mL As amostras são úteis apenas durante a primeira semana da doença; depois, amostras de urina devem ser cultivadas. Fluido cerebrospinal Tubo com tampa de rosca estéril Cultura bacteriana: 1 - 5mL; Cultura de micro- bactérias: o maior volume possível A amostra deve ser coletada assepticamente e enviada imediatamente ao laboratório; essa amostra não deve ser exposta ao calor ou frio. Outros fluidos normalmente estéreis (p. ex., abdominal, torácico, sinovial, pericardial) Pequeno volume: tubo com tampa de rosca estéril; grande volume: frasco de hemocultura contendo meio nutritivo O maior volume possível As amostras são coletadas por seringa; swab não é utilizado porque a quantidade de amostra coletada é insuficiente; ar não deve ser injetado no frasco de cultura, porque inibirá o crescimento de anaeróbios. Cateter Tubo com tampa de rosca estéril ou frasco de coleta N/A Deve ser realizada assepsia do local de entrada do cateter com álcool 70%; o cateter deve ser removido assepticamente no momento da recepção da amostra pelo laboratório; o cateter é utilizado para inocular, por meio de rolamento, toda a superfície da placa de Petri, contendo agar sangue. Em seguida deve ser descartado adequadamente. Respiratório - garganta Swab é imerso em meio de transporte N/A Material da área de inflamação é coletado com swab; quando presente, o exsudato é coletado; o contato com a saliva deve ser evitado, pois pode inibir a recuperação de estreptococos do grupo A. Respiratório - epiglote Coleta de sangue para cultura Semelhante à hemocultura Coleta com swab pode precipitar o completo fechamento das vias aéreas; hemoculturas devem ser realizadas para diagnóstico específico. Respiratório - seios faciais Tubos ou pequenos frascos estéreis para anaeróbicos 1 - 5mL As amostras devem ser coletadas por seringa; culturas de material da orofaringe ou nasofaringe não têm valor diagnóstico; a amostra deve ser cultivada em meios para bactérias aeróbias e para anaeróbias. Microbiologia 73 Amostra Sistema de Transporte Volume de Amostra Outras Considerações Respiratório - vias aéreas inferiores Frascos com tampa de rosca estéril; tubo ou pequeno frasco para anaeróbios apenas para as amostras coletadas, evitando a contaminação da microbiota do trato respiratório superior 1 – 2mL Escarro expectorado: se possível, o paciente deve lavar a boca com água antes da coleta da amostra; o paciente deve tossir intensa-mente e expectorar as secreções das vias aéreas inferiores direta-mente no frasco estéril; deve-se evitar a contaminação com a saliva. Amostra coletada por broncoscopia: anestésicos podem inibir o crescimento de bactérias, assim as amostras devem ser processadas imediatamente; se broncoscópio “protegido” é utilizado, culturas para anaeróbios podem ser realizadas. Aspiração direta do pulmão: amostras podem ser processadas para bactérias aeróbias e anaeróbias. Ouvido Seringas com agulhas cobertas Qualquer volu- me coletado A amostra deve ser aspirada por seringa; cultura do ouvido externo não tem valor preditivo para otite média. Olho Inocular placas com o material coletado à beira do leito (selar e trans- portar para o laboratório imediatamente) Qualquer volume coletado Para infecções oculares superficiais, as amostras são coletadas por swab ou por raspado da córnea; para infecções profundas, a aspira-ção de líquido aquoso ou vítreo é realizada, todas as amostras devem ser inoculadas em meios adequados, no momento da coleta; o adia-mento resultará em uma perda significativa de organismos viáveis. Exudatos (transudatos, secreções, úlceras) Swab imerso em meio de transporte; acondicionar material aspirado em tubo com tampa de rosca estéril Bactérias: 1 - 5mL; Microbactérias: 3 - 5mL A contaminação commaterial de superfície deve ser evitada; as amostras geralmente são inadequadas para a cultura de anaeróbios. Feridas (abscesso, pus) Acondicionar material aspirado em tubo com tampa de rosca estéril ou tubo / pequeno frasco estéreis para anaeróbicos 1 – 5mL de pus As amostras devem ser coletadas por seringas estéreis; a cureta é utilizada para coletar amostras na base da ferida; coleta por swab deve ser evitada. Tecidos Tubo com tampa de rosca estéril ou tubo / pequeno frasco estéreis para anaeróbicos Amostra representativa do centro e das bordas da lesão A amostra deve ser acondicionada assepticamente em recipiente apropriado estéril; quantidade adequada de amostra deve ser coletada para recuperar um número reduzido de organismos. Urina - jato médio Frasco para urina estéril Bactérias: 1mL; Microbactérias: 10mL A contaminação da amostra com bactérias da uretra ou vagina deve ser evitada; primeiro jato deve ser descartado; os organismos podem crescer rapidamente na urina, assim, as amostras devem ser imediatamente transportadas para o laboratório, mantidas em presença de agente bacteriostático ou sob refrigeração. Urina - cateterismo Coletor para urina estéril Bactérias: 1mL; Microbactérias: 10mL O cateterismo de rotina não é recomendado (risco de induzir infecção); a primeira amostra coletada pode estar contaminada com bactérias da uretra, de modo que deve ser descartada (semelhante à urina - jato médio); a amostra deve ser transportada rapidamente ao laboratório. Urina – punção suprapúbica Tubo ou pequeno frasco estéreis para anaeróbicos Bactérias: 1mL; Microbactérias: 10mL Este é um procedimento invasivo, de modo que bactérias da uretra devem ser evitadas; único método válido disponível para coleta de amostras para cultura de anaeróbios; também é útil para a coleta de amostras de crianças ou adultos incapazes de evitar a contaminação de amostras. Genitália Swabs especialmente desenvolvidos para sondas de Neisseria gonorrhoeae e Chlamydia N/A As amostras devem ser coletadas na área de inflamação ou de exsudato; para uma ótima detecção, devem ser cultivadas amostras endocervical (e não vaginal) e uretral. Fezes (evacuação) Recipiente com tampa de rosca estéril N/A O transporte rápido para o laboratório é necessário para prevenir a produção de ácidos (bactericida para alguns patógenos entéricos) por bactérias fecais normais; imprópria para cultura de anaeróbios; swabs não devem ser utilizados para coleta, por causa do grande número de meios diferentes a serem inoculados. Microbiologia 74 Chegando ao laboratório, a amostra é processada de acordo com os protocolos previstos para o diagnóstico. O primeiro teste realizado é a coloração de Gram (considerada o “carro chefe” dos testes bacteriológicos), através dela é possível classificar a bactéria em dois grandes grupos de acordo com a estrutura de sua parede celular que lhe confere diferente sensibilidade ao corante. Bactérias Gram-negativas adquirem cor rosa avermelhada quando visualizadas no microscópio óptico e, por sua vez, bactérias Gram-positivas detém cor arroxeada na visualização. Entretanto, existe um gênero de bactérias no qual o teste de Gram não pode ser utilizado, por elas não serem sensíveis a ele, as microbactérias. Para estas é empregada metodologia diferente. Em muitos casos a simples descrição clínica da patologia junto da coloração de Gram e visualização da morfologia da bactéria já é suficiente para a conclusão do diagnóstico. Por exemplo, uma amostra de pus, vinda de um paciente do sexo masculino, o qual se queixe de ardência durante a micção e liberação desse líquido através do pênis, que chega ao laboratório e passa pela coloração de Gram e microscopia; ao observar-se a presença de diplococos (bactérias em formato arredondado agrupados em pares) Gram-negativos, pode-se claramente fornecer o diagnóstico de infecção por gonococos (o paciente apresentando manifestações clássicas de gonorreia). Por determinadas vezes a amostra não fornece uma quantidade eficaz de bactérias para que se possa realizar outros testes caso a coloração de Gram seja insuficiente para elaboração do diagnóstico. Assim é necessária a cultura do microrganismo que pode ser feita em diversos meios, sejam eles sólidos (ágar) ou líquidos (caldos). O ágar é um polímero viscoso extraído de algas marinhas que, em temperatura ambiente, fornece ao meio de cultura uma consistência gelatinosa, sólida. Atualmente, existe uma variedade enorme desses meios de cultura indo desde o ágar nutriente (que apresenta quantidades definidas de carboidratos, vitaminas e permite crescimento de várias espécies de bactérias até mesmo fungos) ao ágar complexo (com extrato de carne, leite ou ovo, sangue de carneiro, cérebro e coração de coelho ou diversos outros componentes). Microbiologia 75 Outros testes também são essenciais na rotina laboratorial, podem ser citados: *Teste da catalase, que diferencia bactérias que utilizam oxigênio em seu metabolismo e apresentam a enzima catalase daquelas que não possuem. *Teste da coagulase, para bactérias que utilizam esta enzima e promovem a formação de coágulos. *Teste da hemolisina, feito no meio de cultura Ágar sangue, onde se observa um halo claro ao redor das colônias de bactérias que possuem a enzima hemolisina e quebram as hemácias para obtenção de ferro. Muitos outros testes são conhecidos no meio laboratorial. Eles são importantes devido ao caráter de urgência para emissão de laudos com os respectivos diagnósticos. A rapidez e a segurança na elaboração desses pareceres são essenciais e podem significar a diferença entre a vida e a morte de algum paciente. Como já mencionado, a comunicação entre os profissionais responsáveis pelo paciente são de caráter impar e demonstra que nenhuma profissão pode atuar sozinha. 3- Antibacterianos Algumas bactérias são normalmente resistentes a determinados antibióticos, enquanto outras são sensíveis. As bactérias podem ser classificadas como sensíveis ou resistentes aos antimicrobianos. A resistência pode ser natural ou adquirida. Identificando as diversas formas de ação dos antibióticos. Antibióticos são compostos naturais ou sintéticos capazes de inibir o crescimento ou causar a morte de fungos ou bactérias. Podem ser classificados como bactericidas, quando causam a morte da bactéria, ou bacteriostáticos, quando promovem a inibição do crescimento microbiano. O grande marco no tratamento das infecções bacterianas ocorreu com a descoberta da penicilina, por Alexander Fleming, em 1928. A atividade da penicilina era superior à das sulfas e a demonstração que fungos produziam substâncias capazes de controlar a proliferação bacteriana motivou uma nova frente de pesquisas na busca por antibióticos: a prospecção em culturas de microrganismos, especialmente fungos e actinobactérias. Microbiologia 76 A penicilina G, ou benzilpenicilina, foi descrita em 1929 como agente antibiótico, porém somente foi introduzida como agente terapêutico nos anos 1940. Após o processo de industrialização da penicilina, especialmente em consequência da Segunda Guerra Mundial, foi observado um rápido crescimento na descoberta e desenvolvimento de novos antibióticos. Entre os anos 1940-1960, vários antibióticos foram descobertos através de triagens de produtos naturais microbianos, sendo a maioria deles eficazes para o tratamento contra bactérias Gram positivas: β-lactâmicos (cefalosporina), aminoglicosídeos (estreptomicina), tetraciclinas (clortetraciclina), macrolídeos (eritromicina), peptídeos (vancomicina)e outros (cloranfenicol, rifamicina B, clindamicina e polimixina B). Neste período apenas três derivados sintéticos foram introduzidos no mercado: isoniazida, trimetropim e metronidazol. Entre os anos 1960-1980 foram introduzidos no mercado antibióticos semi- sintéticos eficazes para o tratamento de patógenos Gram positivos e Gram negativos, análogos aos antibióticos naturais já existentes. A maioria deles foi obtida a partir de protótipos naturais microbianos, como derivados β-lactâmicos (análogos de penicilina e cefalosporina, ácido clavulânico, aztreonam), análogos da tetraciclina, derivados aminoglicosídicos (gentamicina, tobramicina, amicacina). Entre os anos 1980-2000 as principais ferramentas utilizadas para a busca de novos antibióticos foram a genômica e as triagens de coleções de compostos, em detrimento às triagens de produtos naturais microbianos. Porém, houve uma redução dramática na identificação de novos protótipos antibióticos, ao mesmo tempo em que ocorreu um aumento na incidência de resistência bacteriana. Este período foi marcado pela modificação do mercado de antibióticos e pela introdução da classe das fluoroquinolonas sintéticas, na metade dos anos 1980, desenvolvidas a partir do ácido nalidíxico. Alguns antibióticos baseados em protótipos naturais, como imipenem (derivado β-lactâmico) e análogos da eritromicina (derivado macrolídeo) também foram introduzidos neste período. A partir de 2000, poucos antibióticos foram introduzidos para a terapêutica antimicrobiana. Em 2001, apenas um antibiótico de origem sintética da classe das oxazolidinonas foi introduzido no mercado farmacêutico, a linezolida. Microbiologia 77 Principais classes de antibióticos Os antibióticos de origem natural e seus derivados semissintéticos compreendem a maioria dos antibióticos em uso clínico e podem ser classificados em β-lactâmicos (penicilinas, cefalosporinas, carbapeninas, oxapeninas e monobactamas), tetraciclinas, aminoglicosídeos, macrolídeos, peptídicos cíclicos (glicopeptídeos, lipodepsipeptídeos), estreptograminas, entre outros (lincosamidas, cloranfenicol, rifamicinas etc). Os antibióticos de origem sintética são classificados em sulfonamidas, fluoroquinolonas e oxazolidinonas. - Antibióticos β-lactâmicos Os antibióticos β-lactâmicos são agentes antibacterianos que inibem irreversivelmente a enzima transpeptidase, que catalisa a reação de transpeptidação entre as cadeias de peptideoglicana da parede celular bacteriana. A atividade desta enzima leva à formação de ligações cruzadas entre as cadeias peptídicas da estrutura peptideoglicana, que conferem à parede celular uma estrutura rígida importante para a proteção da célula bacteriana contra as variações osmóticas do meio. - Aminoglicosídeos Os aminoglicosídeos são agentes que possuem um grupo amino básico e uma unidade de açúcar. A estreptomicina, principal representante da classe, foi isolada em 1944 de Streptomyces griseus, um microrganismo de solo. Os aminoglicosídeos apresentam atividade melhorada em pH levemente alcalino, em torno de 7,4, onde estão positivamente carregados, facilitando a penetração em bactérias Gram negativas. Os antibióticos aminoglicosídicos apresentam efeito bactericida por ligarem- se especificamente à subunidade 30S dos ribossomos bacterianos, impedindo o movimento do ribossomo ao longo do mRNA e, consequentemente, interrompendo a síntese de proteínas. - Macrolídeos Os macrolídeos naturais caracterizam-se pela presença de lactonas macrocíclicas ligadas a um açúcar e um amino-açúcar. Derivados semissintéticos podem apresentar anel macrocíclico de 15 membros (azitromicina). Os macrolídeos Microbiologia 78 são agentes bacteriostáticos, que atuam pela ligação ao RNA ribossomal 23S da subunidade 50S, assim bloqueando a biossíntese de proteínas bacterianas. São usados em infecções respiratórias como pneumonia, exacerbação bacteriana aguda de bronquite crônica, sinusite aguda, otites médias, tonsilites e faringites. - Eritromicina A eritromicina age frente à maioria dos patógenos respiratórios, é considerada segura e amplamente prescrita a crianças. Entretanto, seu limitado espectro de ação e sua limitada estabilidade em meio ácido resultam em uma fraca biodisponibilidade e uma variedade de outros efeitos colaterais, tais como influência na motilidade gastrointestinal, ações pró-arrítmicas e inibição do metabolismo de fármacos. - Cloranfenicol O cloranfenicol foi isolado a primeira vez do microrganismo Streptomyces venezuela. O medicamento liga-se à subunidade do ribossomo e parece inibir o movimento dos ribossomos ao longo do mRNA, provavelmente pela inibição da peptidil transferase, responsável pela extensão da cadeia peptídica. - Tetraciclinas As tetraciclinas são antibióticos de amplo espectro e bastante eficazes frente a diversas bactérias aeróbicas e anaeróbicas Gram positivas e Gram negativas. A clortetraciclina foi o primeiro derivado a ser descoberto. As tetraciclinas inibem a síntese de proteínas através da ligação com a subunidade dos ribossomos, impedindo a ligação do aminoacil-tRNA. Como resultado, a adição de novos aminoácidos para o aumento da cadeia protéica é bloqueada. A liberação de proteínas também é inibida. A seletividade frente aos ribossomos bacterianos em relação aos ribossomos de eucariotos deve-se a diferenças estruturais e também à concentração seletiva do antibiótico nas células bacterianas. - Lincosamidas As lincosamidas têm propriedades antibacterianas similares aos macrolídeos e agem pelo mesmo mecanismo de ação. A lincomicina e seu derivado semissintético clindamicina foram introduzidos na prática clínica como antibióticos de uso oral em 1960 e 1969, respectivamente. A lincomicina foi isolada do Microbiologia 79 microrganismo de solo Streptomyces lincolnensis. A clindamicina é um antibiótico amplamente utilizado, que possui melhor atividade e maior absorção por via oral. A clindamicina é o fármaco de escolha para o tratamento de infecções periféricas causadas por Bacillus fragilis ou outras bactérias anaeróbicas penicilina resistentes. Este fármaco é também topicamente utilizado para o tratamento de acne. - Glicopeptídeos Os antibióticos glicopeptídicos, vancomicina e teicoplanina, têm se tornado os fármacos de primeira linha no tratamento de infecções por bactérias Gram positivas com resistência a diversos antibióticos. A vancomicina, o primeiro antibiótico glicopeptídico, introduzido na prática clínica em 1959, foi isolada de amostras de Streptomyces orientalis (reclassificada como Amycolatopsis orientalis). O desenvolvimento de resistência bacteriana a estes antibióticos é mais lento, apesar de algumas linhagens de Staphylococcus aureus hospitalares já apresentarem resistência desde 1966. Eles são restritos para o tratamento de infecções causadas por bactérias Gram positivas por serem incapazes de penetrar nas membranas de bactérias Gram negativas. A vancomicina em geral é o antibiótico de última escolha frente a patógenos Gram positivos resistentes, em particular contra espécies de Enterococcus. - Lipodepsipeptídeos A daptomicina é um lipodepsipeptídeo isolado de Streptomyces roseosporus e aprovado em 2003 para tratamento de infecções causadas por bactérias Gram positivas. Seu mecanismo de ação envolve a desorganização de múltiplas funções da membrana celular bacteriana. É provável que todos os antibióticos lipopeptídicos apresentem alguma penetração na membrana devido às cadeias alquílicas, o que promove sua desorganização. - Rifampicinas A rifamicina B foi isolada de Streptomyces mediterranei,reclassificado como Nocardia mediterranei. A rifampicina é um inibidor da RNA polimerase, utilizada clinicamente como parte da combinação de fármacos para o tratamento da tuberculose. É o único fármaco em uso clínico que bloqueia a transcrição bacteriana. Microbiologia 80 - Estreptograminas A pritinamicina é uma mistura de substâncias macrolactonas obtidas de Streptomyces pristinaespiralis, ela pode ser utilizada oralmente no tratamento de infecções por bactérias Gram positivas. Dois derivados semissintéticos desta classe, quinupristina e dalfopristina, têm sido utilizados por via intravenosa em combinação. - Sulfonamidas e trimetoprim As sulfonamidas, também conhecidas como sulfas, foram testadas pela primeira vez nos anos 1930 como fármacos antibacterianos. Um exemplo de sulfa ainda utilizada na terapêutica é o sulfametoxazol, em associação com o trimetoprim, para o tratamento de pacientes com infecções no trato urinário e também para pacientes portadores do vírus HIV que apresentem infecções por Pneumocystis carinii. Cada um desses fármacos bloqueia uma etapa no metabolismo do ácido fólico. O sulfametoxazol bloqueia a enzima di-hidropteroato sintetase, presente apenas nas bactérias, enquanto o trimetoprim inibe a di- hidrofolato redutase. - Quinolonas e fluoroquinolonas As quinolonas e fluoroquinolonas são fármacos bactericidas muito utilizados no tratamento de infecções do trato urinário e também no tratamento de infecções causadas por microrganismos resistentes aos agentes antibacterianos mais usuais. O ácido nalidíxico, sintetizado em 1962, foi o protótipo desta classe de antibióticos. É ativo frente a bactérias Gram negativas e utilizado no tratamento de infecções do trato urinário, porém, os microrganismos podem adquirir rápida resistência a esse antibiótico. Vários outros análogos têm sido sintetizados, com propriedades similares ao ácido nalidíxico. A enoxacina, desenvolvida em 1980, é um fármaco que apresenta elevado espectro de atividade frente a bactérias Gram positivas e Gram negativas. É também ativo frente a Pseudomonas aeruginosa, bactéria altamente resistente a antibióticos. Microbiologia 81 As fluoroquinolonas agem inibindo a topoisomerase IV de bactérias Gram positivas e apresentam seletividade 1000 vezes maior para enzimas bacterianas em relação às enzimas correspondentes em células humanas. Em bactérias Gram negativas, o alvo das fluoroquinolonas é a topoisomerase II, também conhecida por DNA-girase, que apresenta as mesmas funções da topoisomerase IV. Topoisomerases são essenciais para a viabilidade celular em células procarióticas e eucarióticas. As quinolonas apresentam boa seletividade para células bacterianas. Nesta unidade, estudamos os mecanismos patogênicos bacterianos, a forma como o diagnóstico laboratorial bacteriano pode ser realizado e refletimos sobre as principais classes de antibióticos existentes. Na próxima unidade, veremos a estrutura geral dos vírus e como eles se multiplicam. É hora de se avaliar Lembre-se de realizar as atividades desta unidade de estudo. Elas irão ajudá-lo a fixar o conteúdo, além de proporcionar sua autonomia no processo de ensino-aprendizagem. Microbiologia 82 Exercícios – unidade 3 1.Em relação às exotoxinas bacterianas, marque a alternativa incorreta: a)As enzimas degradativas são um tipo de exotoxina. b)A toxina A-B é uma exotoxina. c) O lipopolissacarídeo (LPS) é uma exotoxina. d)Os superantígenos são exotoxinas que comprometem o funcionamento do sistema imunológico. e)Somente os Gram negativos produzem endotoxina. 2.Quanto ao lipopolissacarídeo, é correto afirmar: a) É uma exotoxina produzida por Gram positivos. b) É uma exotoxina produzida por Fram negativos. c) É uma endotoxina produzida por Gram positivos. d) É uma endotoxina produzida por Gram negativos. e) Não é uma toxina. 3.O diagnóstico laboratorial em bacteriologia: a) requer correta coleta e armazenamento de amostras. b) é realizado apenas através do técnica de coloração de Gram. c) nunca requer a cultura de microrganismos. d) é realizado na consulta médica. e) Nenhuma das alternativas anteriores. Microbiologia 83 4.Certas infecções hospitalares podem ser de difícil combate por meio de antibióticos comumente utilizados. Este feito deve-se: a) à utilização de antibióticos de maneira controlada. b) à seleção de linhagens de bactérias resistentes aos antibióticos. c) à correta aplicação de métodos diagnósticos. d) ao desenvolvimento de cepas multirresistentes em laboratório. e) nenhuma das alternativas anteriores. 5.Dentre os efeitos que o lipopolissacarídeo pode exercer no organismo humano: a) Trombose. b) Papilomas. c) Vesículas herpéticas. d) Meningite. e) Nenhuma das alternativas anteriores. 6.Os superantígenos são exemplos de: a) Endotoxinas. b) Técnicas laboratoriais. c) Antibacterianos. d) Técnicas de limpeza. e) Exotoxinas. Microbiologia 84 7.A assepsia: a) é a eliminação de microrganismos, exceto esporulados, de materiais ou artigos inanimados, através de processo físico ou químico, com auxílio de desinfetantes. b)é a remoção mecânica e/ou química de sujidades em geral. c) é a eliminação de microrganismos da pele, mucosa ou tecidos vivos, com auxílio de antissépticos, substâncias microbicidas. d) É um método empregado para impedir a contaminação de determinado material ou superfície. e) nenhuma das alternativas anteriores. 8.Os antibióticos são medicamentos que possuem como alvo: a) apenas componentes da parede celular da bactéria. b) apenas o DNA bacteriano. c) os mais diversos componentes bacterianos, dependendo da classe antibacteriana. d) apenas o RNA bacteriano. e) nenhuma das alternativas anteriores. 9.Descreva o mecanismo de ação dos macrolídeos. _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ Microbiologia 85 10- Por que é importante a limpeza de materiais antes de uma desinfecção ou esterilização? _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ Microbiologia 86 Microbiologia 87 Propriedades gerais dos vírus 4 Microbiologia 88 Na unidade quatro, estudaremos a estrutura viral e como os vírus se multiplicam. Objetivos da unidade: Conhecer a nomenclatura principal associada à virologia; Identificar as estruturas que compõem a partícula viral; Compreender as diferentesetapas da replicação viral. Plano da unidade: Estrutura viral e estratégias de replicação Classificação internacional dos vírus proposta pelo ICTV (International Comittee on Taxonomy of Viruses) Morfologia viral Replicação viral Bons estudos! Microbiologia 89 Estrutura viral e estratégias de replicação Introdução Os vírus são os menores e menos complexos microrganismos existentes, são bem menores que as células eucariontes e procariontes. Eles não possuem as características necessárias para terem metabolismo próprio e se multiplicarem. Logo, necessitam de uma célula viva para se replicarem, sendo um parasita intracelular obrigatório. Uma vez dentro da célula hospedeira, as partículas virais adquirem atividade biológica e subvertem a maquinaria celular em prol de sua própria multiplicação. Fora de uma célula viva, elas são apenas estruturas químicas. Classificação internacional dos vírus proposta pelo ICTV (International Comittee on Taxonomy of Viruses) O ICTV se baseia em algumas propriedades virais para a classificação geral dos vírus. Essas propriedades são as seguintes: Morfologia: são considerados o tamanho e a forma do vírion, a presença de glicoproteínas, de envelope e a simetria do capsídeo. Propriedades físico-químicas: esta categoria considera características como a massa molecular do vírion, estabilidade em variações de pH e outras condições, tipo e tamanho do material genético, dentre outras. Proteínas: analisa-se o número, o tamanho e a atividade das proteínas virais, a sequência de aminoácidos, a estrutura 3D etc. Lipídios e carboidratos: composição dos mesmos. Replicação viral e organização gênica: levam-se em conta as estratégias de replicação do vírus e como o mesmo se organiza. Propriedades antigênicas e biológicas: reações sorológicas, hospedeiro natural, modo de transmissão, tropismo etc. Microbiologia 90 Ordem, família, subfamília, gênero e espécie virais: agrupamentos virais baseados em níveis de semelhança existentes entre os vírus. Quanto mais próximo do nível de espécie, mais similaridades os agrupamentos virais compartilham. Morfologia viral O tamanho, a forma e a complexidade das partículas virais variam muito entre os vírus das diferentes famílias. A maior parte dos vírions possui dimensões ultramicroscópicas, com diâmetro em nanômetros (nm), o que os torna passíveis de visualização apenas sob microscopia eletrônica (ME). Figura 4.1: Escala métrica representando um comparativo de dimensões de diversas estruturas biológicas. (FLORES, EF, 2007, p. 21) A estrutura da partícula viral varia entre os diversos vírus conhecidos. No entanto, de forma geral, toda partícula viral infectiva deve conter ácido nucléico e proteínas, na forma de um envoltório denominado capsídeo. O capsídeo viral envolve o material genético da partícula, ele é formado por proteínas e cada unidade morfológica que forma o capsídeo é denominada capsômero. Microbiologia 91 Fora de uma célula viva, o vírion contém apenas um tipo de material genético, RNA ou DNA, porém esse material pode estar presente em diversas organizações (figura 4.2). Figura 4.2: Esquema representativo da organização genômica das famílias virais que infectam mamíferos. A: famílias compostas por partículas virais que contêm DNA. B: famílias compostas por partículas virais que contêm RNA. * genoma composta foi fita dupla incompleta de DNA. **presença de duas fitas de RNA e capacidade de transcrição reversa. ***alguns membros dessa família podem apresentar RNAs com polaridade positiva e negativa. (SANTOS, NSO, ROMANOS, MTV, WIGG, MD, 2008, p.13) Microbiologia 92 Quadro 4.1: Definições importantes em virologia. (FLORES, EF, 2007, p. 21) Alguns aspectos devem ser ressaltados em relação à organização genômica das partículas virais. O vírions compostos por RNA de fita simples (uma única fita) podem ser, ainda, classificados em polaridade positiva ou negativa. O RNA que apresenta polaridade positiva, após o vírus infectar uma célula hospedeira, tem a característica de RNAm, podendo ser traduzido diretamente em proteínas. Já o RNA de polaridade negativa serve como base para a produção de uma cópia complementar ao mesmo, após início da replicação viral na célula hospedeira, essa cópia complementar, então, tem o papel de RNAm. Outra característica interessante das partículas virais compostas por RNA é a transcrição reversa apresentada pela família Retroviridae. Os retrovírus têm a capacidade de síntetizar DNA a partir de moléculas de RNA - a transcrição reversa- utilizando a enzima viral transcriptase reversa. O representante mais conhecido dessa família é o vírus da imunodeficiência humana, o HIV. Alguns vírus, além do capsídeo e do material genético, podem conter em sua estrutura enzimas associadas ao genoma, lipídios e carboidratos. As enzimas associadas ao genoma geralmente são essenciais para a replicação viral no interior de células hospedeiras, por exemplo, polimerases e transcriptases reversas. Microbiologia 93 Alguns vírus são envelopados, ou seja, apresentam um envoltório lipídico, o envelope, mais externamente ao capsídeo. Nesse envelope estão contidas glicoproteínas (carboidratos+proteínas) que medeiam à interação entre vírus e célula hospedeira. Na ausência de envelope, as proteínas do capsídeo que propiciam essa interação. Figura 4.3: Estrutura geral das partículas virais. A: vírus não envelopado. B: vírus envelopado. (FLORES, EF, 2007, p. 22) As subunidades protéicas que formam o capsídeo, os capsômeros, podem se organizar em formatos distintos, fazendo com que o capsídeo adquira uma simetria específica. Essas simetrias podem ser classificadas como icosaédrica, helicoidal e complexa. A simetria icosaédrica é aquela em que o capsídeo forma 20 triângulos equiláteros e 12 vértices, ela é muito comum dentre as diversas partículas virais. Os capsídeos de simetria helicoidal apresentam arranjo em hélice, já os de simetria complexa incluem aquelas que são exceção aos dois tipos citados anteriormente. Microbiologia 94 Figura 4.4: Diagrama representativo de simetrias do capsídeo. 1A e 1B: Capsídeos de simetria icosaédrica. 2A e 2B: Capsídeos de simetria helicoidal. 3: Capsídeo de simetria complexa. (FLORES, EF, 2007, p. 22) Microbiologia 95 Replicação viral Os vírus, para se multiplicarem, necessitam infectar uma célula hospedeira, já que não possuem metabolismo próprio. Uma vez no interior dessa célula, o microrganismo tem a capacidade de utilizar todo o metabolismo celular de acordo com sua necessidade, voltando à maquinaria da célula infectada para a confecção de novas cópias virais. Replicação viral é o termo que se refere ao processo de biossíntese de novas partículas virais. Os detalhes desse processo variam amplamente dentre as diversas espécies virais existentes, no entanto, ele pode ser dividido em 6 etapas gerais: adsorção, penetração, desnudamento, expressão gênica e síntese de componentes virais, maturação e liberação. Cada etapa será descrita a seguir. Adsorção A primeira etapa da replicação compreende a ligação entre partículas virais e a célula hospedeira, a adsorção. A ligação ocorre através do contato entre proteínas da superfície do vírus e receptores celulares, vírus não envelopados utilizam proteínas do capsídeo, já os envelopados contam com as glicoproteínas existentes no envelope. Os receptores das células para os vírus são geralmente proteínas (glicoproteínas)ou carboidratos (presentes em glicoproteínas ou em glicolipídios da membrana). Alguns vírus necessitam de receptores específicos (como o vírus da febre aftosa, os poliovírus), outros podem utilizar receptores variados para realizar a adsorção (por exemplo, herpesvírus). A quantidade de receptores na superfície de uma célula varia bastante. Ás vezes, a interação entre as proteínas virais e os receptores celulares não é suficiente para que a adsorção ocorra de forma eficiente. Nesse caso, são necessárias proteínas celulares adicionais, co-receptores, para estabilizar a ligação. Microbiologia 96 O contato entre um vírus e uma célula parece ser ao acaso. Ou seja, a célula hospedeira não atrai a partícula viral a distância. Assim que entra em contato com a superfície celular, componentes externos das partículas virais interagem quimicamente com moléculas da membrana plasmática, podendo resultar ou não em penetração e início da infecção. Apesar de a adsorção viral à superfície celular ser a etapa inicial e indispensável para o início da replicação, ela nem sempre resulta em infecção produtiva. Estima-se que um grande número de interações entre vírions e células não resulte em penetração, pela falta de receptores específicos para o vírus ou pela debilidade dessas interações. Partículas vírais podem se ligar à superfície da célula e não penetrarem na mesma. Outra situação que pode ocorrer é a adsorção, seguida de internalização do nucleocapsídeo, mas liberação do mesmo em compartimentos celulares inapropriados, como os lisossomos. Enfim, a ligação viral à membrana celular é necessária para a replicação, no entanto ela nem sempre garante a continuação do processo replicativo. Susceptibilidade é um termo que se refere à capacidade das células de serem infectadas naturalmente pelo vírus, enquanto já permissividade refere-sassocia-se às condições intracelulares para a ocorrência da replicação viral. Logo, as células nas quais os vírus conseguem, de fato, completar a replicação são susceptíveis (permitem a penetração) e permissivas (permitem a ocorrência das etapas intracelulares). Penetração A penetração é a etapa que ocorre após a adsorção e envolve a transposição da membrana plasmática, permitindo a entrada do nucleocapsídeo (genoma viral + proteínas) no interior da célula, local onde ocorrerão a expressão gênica e a replicação do genoma. A transposição da membrana pode ocorrer na superfície celular ou já no interior do citoplasma, a partir de vesículas produzidas por endocitose, fagocitose ou macropinocitose. Microbiologia 97 As principais formas de prenetração viral são: a) Penetração direta Após a adsorção, o material genético de vírus não envelopados é introduzido, diretamente, no citoplasma da célula hospedeira. Este material genético, então, pode seguir a próxima etapa do ciclo replicativo e servir como base para a síntese de proteínas virais e de cópias de material genético para a formação de outras partículas virais. b) Fusão do envelope viral com a membrana plasmática. Os vírus envelopados podem usar como estratégia de penetração a fusão de seu envelope com a membrana da célula hospedeira. Após a ligação a receptores celulares, o envelope do vírus, que possui estrutura muito semelhante à membrana celular, simplesmente se junta ao envoltório da célula hospedeira, havendo a liberação do nucleocapsídeo no citoplasma celular. c) Endocitose Esse mecanismo de penetração é utilizado por vários vírus envelopados (p. ex.: flavivírus e ortomixovírus) e por alguns vírus sem envelope (p. ex.: adenovírus, picornavírus e reovírus). A via endocítica parece ser a melhor via para a internalização dos vírus, já que i) a endocitose é um processo fisiológico que ocorre na maioria das células; ii) ela ocorre somente em células com transporte de membrana ativo, evitando a penetração em eritrócitos e plaquetas, locais nos quais a infecção seria improdutiva; iii) as partículas virais podem se ligar em qualquer local da superfície celular para serem internalizadas; iv) a endocitose garante a internalização e o transporte dos vírions para os locais de expressão gênica e replicação; v) a penetração a partir dos endossomos reduz a detecção viral pelo sistema imunológico, pois não deixa proteínas virais expostas na superfície celular, constituindo um mecanismo de evasão da resposta imunológica e vi) o microambiente endossomal se acidifica gradativamente, o que auxilia na ativação dos mecanismos de fusão e penetração. Na endocitose, após a adsorção, a célula hospedeira capta a partícula viral e a mesma é internalizada em vesículas endocítica. Os vírus envelopados podem ser liberados no citoplasma através da fusão de seu envelope com a membrana da vesícula endocítica, já os vírus não envelopados necessitam de mecanismos que rompam a membrana vesicular para que sejam liberados da mesma. Microbiologia 98 Tabela 4.1: Receptores celulares e mecanismos de penetração dos principais vírus animais. (FLORES, EF, 2007, p. 112) Família Vírus Receptor Viral Forma / Local de Penetração V ír us D N A Herpesviridae Herpes simplex Sulfato de heparina / receptor homólogo ao fator de necrose tumoral (TNF) e fator de crescimento neuronal (NGF) Fusão na membrana plasmática Pseudoraiva Sulfato de heparan (HS), proteoglicanos (HSPG) e coreceptores Fusão na membrana plasmática Adenoviridae Adenovírus 2 Receptor para adenovírus e vírus Coxsackie B (CAR) Endocitose dependente de clatrina Poxviridae Vaccinia Fator de crescimento epidermal (EGF) Membrana plasmática e/ou macropinossomo Polyomaviridae SV-40 Moléculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) classe I Endocitose caveolar e/ou retículo endoplasmático Papilomaviridae Papilomavírus bovino Integrina -6 e moléculas semelhantes ao heparan Endocitose dependente de clatrina Parvoviridae Papilomavírus canino Receptor de transferrina Endossomos Asfarviridae Peste suína africana Não determinado Endossomos V ír us R N A Arteriviridae Vírus elevador da desgrogenase láctica Moléculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) classe II Endossomos Coronaviridae Vírus da Hepatite dos Murinos Glicoproteína biliar dos murinos / antígeno carcinoembriogênico Endossomos Coronavírus humano 229E CD13 (Aminopeptidase) Membrana plasmática Orthomyxoviridae Vírus da influenza Ácido siálico Endocitose dependente de clatrina Paramyxoviridae Vírus do sarampo CD46 Membrana plasmática Togaviridae Semliki Forest Moléculas do MHC classe II Endocitose dependente de clatrina Flaviviridae Vírus da diarreia viral bovina CD46 bovino Endossomos Rhabdoviridae Vírus da raiva Receptor da neurotropina (p75NTR) Endocitose dependente de clatrina Filoviridae Vírus Ebola e Marburg Receptor folato (FR-) Caveola Retroviridae HIV-1 CD4 e receptor de citocinas Membrana plasmática Bunyaviridae Vírus Hantaan Integrinas ( 3) Endocitose dependente de clatrina Picornaviridae Vírus da febre aftosa Integrinas (v) Endocitose Caliciviridae Não determinado Não determinado Endossomos Reoviridae Reovírus Ácido siálico e molécula 1 de adesão juncional (JAM 1) Endossomos Rotavírus Integrinas V3 e proteínas cognatas do choque térmico (hscp70) Membrana citoplasmática (lipid rafts) aCAR: receptor de virus coxsackie B e adenovirus. bnão determinado. Microbiologia 99 Desnudamento O termo desnudamento (do inglês uncoating) refere-se aos eventos que ocorrem logo após a penetração, em que os constituintes do nucleocapsídeo são parcial ou totalmente removidos, resultando na exposição parcial ou completa do genoma viral. A remoçãodas proteínas do nucleocapsídeo é absolutamente necessária para a exposição do genoma às enzimas e fatores responsáveis pela transcrição (vírus DNA e RNA de cadeia negativa) ou tradução (vírus RNA de cadeia positiva). Biossíntese viral Uma vez dentro da célula, o genoma viral deve ser direcionado para a síntese de mRNA e proteínas virais e gerar cópias idênticas de si mesmo. O material genético é inútil, a menos que possa ser transcrito em mRNAs funcionais capazes de se ligar aos ribossomos e ser traduzidos em proteínas. A forma como cada vírus cumpre estas etapas depende da estrutura do genoma e do sítio de replicação. Geralmente, vírus de DNA utilizam a maquinaria nuclear para realizarem a síntese de RNA e de cópias de DNA (as proteínas são sintetizadas no citoplasma) , já os de RNA realizam todas as etapas, tanto de síntese de cópias de RNA como de proteínas, no citoplasma. A maquinaria celular para a transcrição e o processamento do mRNA encontra- se no núcleo. A maioria dos vírus DNA utiliza a RNA polimerase II DNA-dependente e outras enzimas celulares para a síntese de mRNA. Embora, por exemplo, os poxvírus sejam vírus de DNA, eles se replicam no citoplasma, então, devem codificar enzimas para todas estas funções. Como citado anteriormente, a maioria dos vírus de RNA replica-se e produz mRNA no citoplasma, exceto os ortomixovírus e os retrovírus. Os vírus de RNA devem codificar as enzimas necessárias à transcrição e à replicação, já que a célula não possui meios para replicar RNA. Microbiologia 100 Geralmente, o mRNA para proteínas não estruturais é sintetizado primeiro. Essas proteínas normalmente servem para se ligar ao DNA e enzimas, incluindo as polimerases codificadas pelo vírus. Figura 4.5: Etapas da síntese macromolecular viral: o mecanismo de síntese de mRNA e proteína viral e a replicação do genoma são determinados pela estrutura do genoma. 1. O DNA de fita dupla (DNA FD) usa a maquinaria hospedeira no núcleo (exceto os poxvírus) para fazer mRNA, que é traduzido em proteínas pelos ribossomos da célula hospedeira. 2.O DNA de fita simples (DNA FS) é convertido em DNA FD e replica-se como DNA FD. 3.O RNA (+) assemelha-se a um mRNA que se liga aos ribossomos para fazer uma poliproteína que é Microbiologia 101 clivada em proteínas individuais. Uma das proteínas virais é uma RNA polimerase que faz um molde de RNA (−) e então mais progênie de genoma RNA (+) e mRNAs. 4. O RNA (−) é transcrito em mRNAs e em um molde de RNA (+) de tamanho total pela RNA polimerase carreada no vírion. O molde de RNA (+) é usado para fazer a progênie de genoma RNA (−). 5. O RNA FD age como um RNA (−). As fitas (−) são transcritas em mRNAs por uma RNA polimerase no capsídeo. Os RNAs (+) são transferidos para o capsídeo e os RNAs (−) são feitos no capsídeo. 6. Os retrovírus são RNA (+) que são convertidos em DNA complementar (cDNA) pela transcriptase reversa carreada no vírion. O cDNA integra-se ao cromossomo hospedeiro e o hospedeiro sintetiza mRNAs, proteínas e cópias de genoma de RNA de tamanho total. MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 49). Montagem A montagem do vírion é similar a um quebra-cabeça tridimensional entrelaçado que se coloca em uma caixa. A partícula viral é construída a partir de partes pequenas, facilmente fabricadas, que abrigam o genoma em um pacote funcional. Cada parte do vírion possui estruturas de reconhecimento que permitem ao vírus formar interações proteína-proteína, proteína-ácido nucleico e proteína- membrana (para os vírus envelopados) apropriadas. Durante a montagem, as proteínas sintetizadas na etapa de biossíntese geralmente se organizam para que a estrutura do capsídeo viral seja montada, abrigando em seu interior o material genético do vírus. Liberação Os vírus podem ser liberados das células por lise celular, por exocitose ou pelo brotamento da membrana plasmática. Os vírus não envelopados são geralmente liberados após a lise da célula. A liberação de muitos vírus envelopados ocorre após o brotamento da membrana plasmática sem matar a célula, nessa situação, a partícula viral adquire o envelope a Microbiologia 102 Figura 4.6: Exemplos de liberação viral. A) Lise celular; B) Brotamento e C) Exocitose. (FLORES, EF, 2007, p. 132 e 133) partir da membrana plasmática da célula hospedeira. A lise e o brotamento da membrana plasmática são formas eficientes de liberação. Microbiologia 103 Os vírus que adquirem seu envelope no citoplasma (p. ex., flavivírus, poxvírus) permanecem associados à célula e comumente são liberados por exocitose. Figura 4.7: Representação esquemática do ciclo replicativo de um vírus DNA.1) Adsorção; 2) Penetração; 3) Desnudamento; 4) Transcrição dos genes virais; 5) Tradução dos RNA mensageiros (mRNA) e produção das proteínas virais; 6) Replicação do genoma; 7) Morfogênese; 8-9) Liberação. (FLORES, EF, 2007, p. 132 e 110). Nesta unidade estudamos a morfologia viral e as etapas da replicação dos vírus. Na próxima unidade veremos a patogênese das infecções virais e o diagnóstico laboratorial das viroses. É HORA DE SE AVALIAR Lembre-se de realizar as atividades desta unidade de estudo. Elas irão ajudá-lo a fixar o conteúdo, além de proporcionar sua autonomia no processo de ensino-aprendizagem. Microbiologia 104 Exercícios – Unidade 4 1- A alternativa que apresenta uma propriedade comum a todos os vírus é: a) replicam-se independentemente. b) possuem ácido nucleico e proteínas. c) são formados por DNA e carboidratos. d) reproduzem-se de forma similar à das bactérias. e) possuem metabolismo próprio. 2- Marque a única opção correta que apresenta uma característica a respeito da estrutura viral: a) todos os vírus são constituídos por proteína, DNA e lipídios. b) o material genético viral existe apenas sob a forma de DNA. c) todos os vírus infectivos são basicamente constituídos por proteínas e material genético . d) o envelope viral é formado apenas por carboidratos. e) nenhuma das respostas anteriores. 3-O termo “susceptibilidade” em virologia refere-se a: a) Células que não permitem a penetração viral. b) Tropismo de um vírus por um hospedeiro. c) Período em que um indivíduo se recupera de uma infecção sintomática. d) Infecção persistente latente. e) Células que possuem um determinado receptor que permite a ligação de um determinado vírus. Microbiologia 105 4- Quanto à replicação viral, marque a alternativa correta: a) A penetração é a etapa em que o material genético do vírus se separa do capsídeo. b) A liberação é a etapa em que o vírus egressa da célula. c) O desnudamento é a fase em que ocorre a biossíntese viral. d) Durante a biossíntese viral somente são sintetizadas as proteínas do capsídeo. e) A adsorção ocorre quando o vírus organiza seu capsídeo. 5- Considerando a simetria que o capsídeo viral pode apresentar, marque a alternativa correta: a) Coco. b) Bastão. c) Espirilo. d) Icosaedro. e) Levedura. 6- A etapa da replicação viral conhecida como adsorção compreende: a) A ligação entre proteínas virais e a célula hospedeira. b) A liberação da progênie viral a partir da célula hospedeira. c) A internalização do material genético viral. d) A síntese de proteínas estruturais do vírus. e) A montagem do nucleocapsídeo. Microbiologia 106 7- Alguns vírus podem conter, além de sua estrutura básica, outros constituintes. Em relação a esses constituintes, marque a alternativa correta. a)alguns vírus contêm lipídeos, os quais podem ser encontrados nos mesmos sob a forma de espículas. b) alguns vírus contém lipopolissacarídeos em suas cápsulas. c) alguns vírus podem contêm enzimas, as quais estão presentes no envelope viral. d) a) alguns vírus contêm lipídeos, os quais podem ser encontrados nos mesmos sob a forma do envelope. e) alguns vírus podem contem carboidratos, os quais formam o capsídeo. 8- A replicação viral: a) Ocorre dentro de uma célula hospedeira, já que os vírus não possuem metabolismo próprio. b) Requer gasto de energia por parte da partícula viral. c) Ocorre somente em células epiteliais. d) Independe da permissividade apresentada por uma célula. e) Não apresenta variações dependendo do tipo viral. Microbiologia 107 9- Explique a diferença entre RNAs de polaridade negativa e positiva. ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 10- A família Retroviridae possui a característica de transcrição reversa. Do que se trata essa característica? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ Microbiologia 108 Microbiologia 109 Patogênese das infecções virais e diagnóstico laboratorial das viroses. 5 Microbiologia 110 Nesta unidade, veremos alguns aspectos da patogênese das infecções promovidas por vírus e as principais técnicas diagnósticas em virologia. Objetivos da unidade: Compreender como os vírus são transmitidos e disseminados; Conhecer as exigências para que uma infecção viral ocorra; Diferenciar os padrões e períodos da infecção viral; Identificar as diversas técnicas utilizadas no diagnóstico laboratorial em virologia. Plano da unidade: Patogênese viral e diagnóstico laboratorial Patogênese das infecções virais Diagnóstico laboratorial em virologia Bons estudos! Microbiologia 111 Patogênese viral e diagnóstico laboratorial Introdução O termo patogenia – ou patogênese –, relacionado às infecções virais, refere- se ao conjunto de mecanismos pelos quais os vírus promovem doença em seus hospedeiros (pato = doença, gênese = origem, produção). Alguns conceitos devem ser definidos: Patógeno: agente infeccioso capaz de promover doença. Patologia: estudo da origem e das alterações estruturais e/ou funcionais induzidas por doença em um organismo. Patogenicidade: capacidade do agente de infectar um hospedeiro e causar doença. Patogênese ou patogenia: etapas envolvidas no desenvolvimento de doenças. Virulência: geralmente utilizado como sinônimo de patogênico. Patogênese das infecções virais Transmissão dos vírus na natureza Os vírus, por serem parasitas intracelulares obrigatórios, são mantidos na natureza se transmitidos de um hospedeiro para outro, da mesma espécie ou não.. Essa transmissão pode ser horizontal ou vertical. - Transmissão horizontal Esse tipo de transmissão compreende a passagem viral de um indivíduo para outro, da mesma espécie ou não. Ela pode ocorrer de diversas formas: Microbiologia 112 Contato: diretamente de um indivíduo infectado para outro susceptível, através da via sexual, saliva, pele, ou indiretamente, através de fômites (objetos contaminados) e perdigotos. Vetores: via animais vertebrados ou invertebrados. Veículo: água ou alimentos contaminados. -Transmissão vertical Trata-se da transmissão viral da mãe para o embrião/feto, seja durante a gestação ou no momento do nascimento. Exigências para o início de uma infecção viral Para que uma infecção viral seja bem sucedida geralmente são necessários 3 requisitos: inóculo viral suficiente, acessibilidade e permissividade no sítio de entrada e fragilidade dos mecanismos de defesa local do hospedeiro. - Inóculo viral: mesmo que as partículas virais permaneçam infecciosas ao passarem de um hospedeiro para outro, a infecção poderá não prosseguir se a concentração de partículas for insuficiente. - Sítio de entrada: as células da porta de entrada necessitam ser acessíveis ao vírus, além de suscetíveis (presença de receptores celulares) e permissíveis (presença de produtos intracelulares necessários para a replicação viral). - Defesa local do hospedeiro: para iniciarem a infecção, os vírus necessitam de mecanismos de evasão da ação do sistema imunológico ou de falhas nesse mesmo sistema de defesa. Entrada dos vírus no organismo Geralmente os vírus penetram no organismo através de células da superfície do corpo. Os sítios de entrada mais comuns incluem os tratos respiratório, gastrointestinal e urogenital, além da conjuntiva e da pele. Microbiologia 113 - Mucosas As mucosas estão frequentemente em contato com antígenos estranhos, logo elas representam tecidos imunologicamente ativos. A ação dessas defesas minimiza a penetração de patógenos e a infecção das mucosas. Entrada via trato respiratório O trato respiratório é a via de entrada mais comum em termos de infecção viral. Geralmente, a invasão deste trato está associada ao contato com perdigotos (aerossóis) ou saliva. A via respiratória apresenta barreiras mecânicas que dificultam a penetração de patógenos, tais como células ciliadas, além de células e glândulas secretoras de muco, o que faz com que muitas partículas estranhas sejam deglutidas e digeridas. Nos alvéolos pulmonares encontram-se macrófagos intimamente associados à defesa contra invasores. Partículas maiores não atingem os pulmões. Trato gastrointestinal O trato gastrointestinal é uma rota comum de entrada e disseminação dos vírus. No entanto, para que o vírus persista no organismo, ele deve ser resistente a extremos de pH, ação de proteases e aos sais biliares. Como fatores de proteção deste trato são exemplos o muco, IgA, a acidez do estômago, a alcalinidade do intestino, os sais biliares e a presença de células fagocitárias. Trato urogenital O trato urogenital é uma importante porta de entrada para os vírus, principalmente quando se trata de transmissão sexual. A atividade sexual naturalmente promove abrasões na região genital, o que facilita a entrada dos vírus no organismo. Microbiologia 114 As principais defesas associadas a esse trato são o muco e o pH ácido vaginal. Conjuntiva Qualquer tipo de abrasão na conjuntiva aumenta a possibilidade de infecção viral, porém a disseminação a partir desse sítioé rara. A conjuntiva conta com a secreção ocular e o movimento das pálpebras como formas de proteção contra a entrada de patógenos virais. - Pele Todo tipo de abrasão, picadas de vetores, perfurações e mordidas aumentam a possibilidade de entrada viral a partir da pele. A infecção viral geralmente é local quando o patógeno não atinge a derme. A pele além de ser queratinizada, apresenta células de Langerhans para sua defesa. Quadro 5.1: sítios de replicação viral no trato respiratório. (SANTOS, NSO, ROMANOS, MTV, WIGG, MD, 2008, p.45) Trato Respiratório Superior Sítio de infecção Manifestação clínica Exemplo de vírus boca, cavidades nasais, faringe, laringe, tonsilas rinite, faringite, laringite, tonsilite, sinusite rinovírus, coronavírus, vírus da parainfluenza, vírus da influenza, vírus sincicial respiratório, adenovírus, metapneumovírus humano, bocavírus humano Trato Respiratório Inferior Sítio de infecção Manifestação clínica Exemplo de vírus traquéia, brônquios, bronquíolos, alvéolos traqueíte, bronquite, bronquiolite, pneumonia vírus da parainfluenza, vírus da influenza, vírus sincicial respiratório, metapneumovírus humano, bocavírus humano Microbiologia 115 Tropismo viral Muitos vírus não replicam em todos os tipos celulares do hospedeiro, ficando restritos a algumas células específicas. A predileção viral para infectar alguns tecidos do hospedeiro é chamada de tropismo. O tropismo viral pode ser determinado pela presença de receptores nas células (susceptibilidade), bem como pela presença de constituintes intracelulares necessários para que a replicação viral se complete (permissividade). Apesar de uma célula apresentar essas características, a infecção viral não prossegue se essa célula não estiver acessível. Ainda que a célula seja permissiva e suscetível, e esteja acessível, a infecção pode não ocorrer devido às defesas imunológicas presentes no local de entrada. Disseminação viral A disseminação viral ocorre quando o vírus invade um organismo e consegue transpassar barreiras físicas e imunológicas. Alguns vírus promovem infecções localizadas, geralmente restritas às proximidades dos sítios de penetração e replicação primária. Esse tipo de infecção é característico de vírus respiratórios (vírus da influenza e parainfluenza), gastrointestinais (coronavírus e rotavírus) e de alguns vírus que infectam a derme e a epiderme (papilomavírus, alguns poxvírus). Essas infecções estão comumente limitadas ao epitélio, no entanto a penetração e o envolvimento de tecidos próximos e a disseminação sistêmica podem eventualmente acontecer. As infecções que se restringem aos sítios de replicação primária e suas proximidades são ditas localizadas. Microbiologia 116 Figura 5.1: Trajeto dos vírus que penetram pela pele ou mucosas superficiais para atingir o sangue e se distribuir sistemicamente. (FLORES, EF, 2007, p. 203). Outros vírus possuem a capacidade de se disseminar a longas distâncias pelo sangue ou pela linfa e infectar órgãos específicos ou promover infecções generalizadas. As infecções que vão além dos sítios de replicação primária são denominadas disseminadas e as que acometem vários órgãos ou sistemas são chamadas de sistêmicas ou generalizadas. - Disseminação local através da superfície do epitélio Após a penetração viral nas células do epitélio, há replicação e espalhamento de novos vírus formados para as células vizinhas. É a forma de disseminação utilizada por vírus que promovem infecção localizada em pele e mucosas. - Disseminação via nervos periféricos Existem vírus que se disseminam a partir de sítios primários para terminações nervosas locais. Para alguns vírus o sistema nervoso é o objetivo final, enquanto para outros ele é apenas um desvio do seu sítio de replicação. Microbiologia 117 Quadro 5.2: Disseminação viral através do sistema nervoso (SANTOS, NSO, ROMANOS, MTV, WIGG, MD, 2008, p.48) Rota de Entrada Exemplo de vírus Neural poliovírus, vírus da febre amarela, vírus da encefalite venezuelana, vírus da raiva, reovírus tipo 3, vírus herpes simplex tipos 1 e 2 Nervo olfatório vírus herpes simplex, vírus da varicela-zoster, coronavírus, vírus da raiva Hematológica poliovírus, vírus do sarampo, coxsackievírus, arenavírus, vírus da caxumba, vírus herpes simplex, citomegalovírus, vírus do oeste do Nilo - Disseminação linfática Os capilares linfáticos são mais permeáveis do que capilares sanguíneos, o que facilita a passagem viral. Como os vasos linfáticos acabam se ligando aos sanguíneos, os vírus têm acesso ao sistema circulatório. - Disseminação através do sangue (viremia) Os vírus que escapam das defesas locais podem ir para o sangue. A disseminação pelo sangue dá aos vírus a oportunidade de atingir, a princípio, todos os órgãos e tecidos em poucos minutos a partir dos sítios de replicação primária. As partículas virais podem atingir a corrente sanguínea diretamente através da parede capilar, após a infecção de células endoteliais ou pela inoculação direta por insetos ou por instrumentos contaminados. Microbiologia 118 Figura 5.2 : Etapas da patogenia das infecções virais localizadas e sistêmicas: papel da viremia na disseminação das infecções. (FLORES, EF, 2007, p. 204). Microbiologia 119 A disseminação, por via hematogênica, começa quando os vírions produzidos nos sítios primários de replicação são liberados no líquido extracelular e drenados pelo sistema linfático. As partículas virais veiculadas pela linfa eventualmente têm acesso à corrente sanguínea. Denomina-se viremia ativa quando há replicação viral e passiva quando ocorre a introdução de partículas virais no sangue sem que haja replicação no sítio de entrada. A viremia primária pode ser caracterizada pela liberação viral no sangue após replicação inicial no sítio de entrada, já a secundária é aquela que ocorre quando uma grande concentração de partículas virais pode ser encontrada novamente no sangue após a viremia primária. Padrões de infecção As infecções naturais podem ser rápidas ou autolimitadas ou de longa duração, variações podem ocorrer. I. Infecções agudas: Caracterizadas por uma rápida produção de vírus seguida da resolução e eliminação da infecção. Ela pode não resultar em doença, ocorrendo de forma inaparente ou assintomática. II. Infecções persistentes Nesse caso, a infecção não é eliminada rapidamente, havendo produção viral contínua ou intermitente. Infecção persistente crônica: nesse caso o vírus é continuamente replicado e excretado. Infecção persistente lenta: ocorre um longo período entre a infecção aguda primária e o surgimento de sintomas, há produção contínua de partículas virais. Microbiologia 120 Infecção persistente latente: nesse tipo de infecção as partículas virais permanecem em forma “não infecciosa” por períodos, podendo haver reativação e retomada da replicação. III. Infecções abortivas O vírus infecta um hospedeiro ou célula susceptível, no entanto a replicação não se completa (gene viral ou celular não é expresso). Logo, trata-se de uma infecção não produtiva. Períodos da infecção Período de incubação: compreendido entre o início da infecção até o aparecimento dos primeiros sintomas. Período prodrômico: período em que o indivíduo apresenta sintomas clínicos generalizados e inespecíficos (febre, mal-estar, dor de cabeça etc), antecede o períododos sintomas característicos da doença. Período da doença: quando o indivíduo apresenta os sintomas característicos da doença. Período da infecciosidade: período durante o qual o indivíduo permanece excretando e transmitindo o vírus. Período da convalescença: período durante o qual o paciente se recupera. Excreção dos vírus do organismo O último estágio da patogênese é a excreção do vírus infeccioso do organismo, e ela é necessária para a manutenção da infecção na população. - Secreções respiratórias Vírus que causam infecções localizadas no trato respiratório e também que promovem infecções sistêmicas. - Fezes Via de excreção relacionada todos os vírus que infectam o trato entérico. Microbiologia 121 - Pele Vírus que replicam na pele são, muitas vezes, transmitidos por contato direto entre hospedeiros. - Trato genitourinário Principal via de excreção associada à transmissão sexual. Alguns vírus são excretados na urina. - Leite materno - Sangue Fonte importante para a veiculação de vírus por artrópodes, transmissão vertical, transfusão sanguínea ou por agulhas e seringas contaminadas. Diagnóstico laboratorial em virologia A elaboração do diagnóstico laboratorial das infecções virais humanas depende de ações coordenadas do médico e dos analistas laboratoriais. Os resultados dos testes laboratoriais, isoladamente, possuem pouco significado se não forem interpretados com base nos conhecimentos de epidemiologia, patogenia e imunologia das doenças. O diagnóstico de certeza de um processo infeccioso é a demonstração do patógeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biológicos. Essa demonstração, no caso de uma infecção viral, pode ser realizada de forma direta ou indireta. Como demonstração direta, tem-se o isolamento do agente etiológico (por exemplo, ovos embrionados, animais de laboratório ou cultura de células), a observação das partículas virais ao microscópio eletrônico, a detecção de antígenos virais por técnicas de hemaglutinação ou imunológicas ou a pesquisa do genoma viral por técnicas de biologia molecular. O diagnóstico indireto baseia-se na investigação de anticorpos produzidos pelo organismo infectado em resposta a uma determinada infecção viral. Ele pode ser realizado através da sorologia pareada, isto é, pela coleta de amostras de sangue na fase aguda e convalescente da infecção. Uma diferença de, pelo menos, 4 vezes no título de anticorpos específicos entre as duas fases representa a conversão Microbiologia 122 Método Princípio Propriedades Restrições Aplicações Microscopia Eletrônica Visualização das partículas víricas coradas com metais pesados em um microscópio. - Rápida (poucas horas); - Detecta vírions viáveis e inviáveis; - Útil para vírus que não replicam em cultivo; - Pode permitir a identificação do agente. -Equipamento caro; - Exige pessoal treinado; -Baixa sensibilidade; - Aplicação restrita a alguns vírus. - Infecções entéricas (rotavírus, coronavírus, astrovírus); - Infecções cutâneas (poxvírus, herpesvírus). Isolamento em cultivo celular Observação do efeito citopático e/ou detecção de produtos virais após a sua multiplicação em células de cultivo. - Sensível; - O agente fica disponível para estudos posteriores; - Implementação e execução relativamente simples. - Demorado (até semanas); - Não aplicável a alguns vírus; - Somente detecta vírus que estejam viáveis; - Contaminação bacteriana e fúngica; - Contaminação com vírus adventícios. - Todos os vírus que replicam em cultivos celulares; - Qualquer material clínico pode ser submetido ao isolamento. Hemagluti- nação (HA) Observação da capacidade do vírus de aglutinar eritrócitos. - Rápida; - Boa sensibilidade; - Boa especificidade; -Fácil execução. -Aplicável a um grupo restrito de vírus; - Hemaglutinação inespecífica; - Necessidade de espécies doadoras de hemácias; - Não automatizável. - Aplicável aos vírus hemaglutinantes de aves e mamíferos; - Fluidos corporais, suspensões de tecidos. Imunofluores- cência (IFA) Imuno- peroxidase (IPX) Proteínas virais são detectadas por anticorpos específicos conjugados com um marcador fluorescente (IFA) ou com uma enzima (IPX) - Rápida (minutos ou poucas horas); - Simples, baixo custo; - Boa sensibilidade e especificidade; - Detecta também vírus inviável; - Pode informar sobre sorotipos; - Disponível em kits; - Aplicável a virtualmente todos os vírus. - Equipamento caro (IFA); - Reações inespecíficas (uso de anticorpos policlonais); - Reagentes para alguns vírus podem não ser disponíveis. - Aplicável a qualquer vírus para o qual se disponha de anticorpos específicos; - Materiais: tecidos (frescos, congelados, fixados), esfregaços (sanguíneos, de secreções), células de cultivo. Testes imuno- enzimáticos / cromato- gráficos A presença do antígeno que reage com o anticorpo específico imobilizado ou após a migração, é revelada pela mudança de cor. - Simples e prática; - Disponível em kits; - Rápida; - Boa sensibilidade e especificidade. -Não automatizável; - Especificidade e sensibilidade podem deixar a desejar; - Custo alto por amostra. - Aplicável a vários vírus de pequenos animais; - kits disponíveis para uso em clínicas; - Também para alguns vírus de aves, suínos e bovinos. Detecção de ácidos nucléicos (PCR, hibridização) Ácidos nucléicos (RNA, DNA) do vírus são detectados por sondas marcadas (hibridização) ou após amplificação por reações enzimáticas (PCR). - Específica; - Sensível; - Necessita quantidades mínimas da amostra; - Potencialmente aplicável a todos os vírus. - Rápida (PCR); - Automatizável (PCR). - Custo alto; - Requer equipamento e pessoal treinado; - Técnica sofisticada. - Aplicável a virtualmente todos os vírus conhecidos; - Pode ser realizada em qualquer amostra clínica. Microbiologia 123 Método Princípio Propriedades Restrições Aplicações Imunodifusão em ágar (IDGA) Observação de linhas de precipitação no ágar, produzidas pela formação de complexos antígeno- anticorpos. -Simples execução e implementação; - Custo baixo; - Sensibilidade razoável; - Resultados em 24-72h. - Reações inespecíficas frequentes; - Sensibilidade limitada; - Qualidade do antígeno é crítica; - Somente qualitativa (não permite a quantificação dos anticorpos). - Anemia infecciosa equina, língua azul, leucose enzoótica bovina. Soroneutra- lização (SN) Anticorpos presentes no soro previnem a replicação do vírus e a produção de efeito citopático nos cultivos. - Sensível; - Específica; - Custo reduzido; - Qualitativa (sim/não) e quantitativa (título de anticorpos); - Similar à neutralização in vivo. - Exige cultivos celulares; - Implementação / execução podem ser problemáticas; - Contaminação bacteriana; - Toxicidade do soro; - Detecta somente anticorpos neutralizantes. - Virtualmente todos os vírus que replicam em cultivo celular. ELISA Anticorpos presentes no soro ligam-se aos antígenos imobilizados em placas de poliestireno e são detectados por anti-anticorpos conjugados com enzimas. - Rápida (2-3h); - Sensível; - Específica; - Automatizável; - Disponível em kits; - Pode detectar classes específicas (IgG, IgM, etc.). - Requer equipamento; - Kits comerciais podem ter custo alto; - Não disponível para todos os vírus; - Qualidade do antígeno é crítica. - Utilizada para inúmeros vírus; - Pode ser qualitativae quantitativa; - Utilizada para detectar anticorpos totais ou classes específicas no soro ou secreções (leite); - Variações da técnica são disponíveis para a detecção de antígenos. Inibição da hemagluti- nação (HI) Anticorpos antivirais impedem a atividade hemaglutinante do vírus. - Rápida; - Sensível; - Específica; - Custo baixo. - Somente aplicável a vírus hemaglutinantes; - Requer animais doadores de eritrócitos; - Inibidores inespecíficos podem dar falso positivo; - Não-automatizável. - Vírus hemaglutinantes de aves e mamíferos. Fixação do complemento A presença de anticorpos leva à ativação do complemento e lise de eritrócitos. - Boa sensibilidade e especificidade. - Demorada; - Trabalhosa; - Não-automatizável; - Requer animais doadores de eritrócitos; - Já foi muito usada para vários vírus, atualmente está em desuso. Imunofluores- cência (IFA) para anticorpos Anticorpos presentes no soro se ligam em antígenos específicos imobilizados e são detectados por anticorpos marcados com FITC. - Rápida; - Boa sensibilidade; - Simples. - Reações inespecíficas; - Exige microscópio de UV; - Pode não detectar níveis baixos de anticorpos; - Não-automatizável. - Já foi usada para vários vírus; - Uso atual restrito a alguns vírus. Imuno- cromatografia A presença do anticorpo que reage com o antígeno é revelada pela mudança de cor. - Simples e prática; - Disponível em kits; - Rápida; - Boa sensibilidade e especificidade. - Não-automatizável; - Especificidade e sensibilidade podem deixar a desejar; - Custo individual alto. - Aplicável a vários vírus de pequenos animais; - Kits disponíveis para uso em clínicas; - Também para alguns vírus de aves, suínos e bovinos. Microbiologia 124 Tabela 5.1: Princípios, propriedades e restrições dos principais métodos diretos de diagnóstico virológico (FLORES, EF, 2007, p. 301) imunológica do indivíduo. Esse evento é denominado conversão sorológica e a verificação de sua ocorrência pode ser feita por testes de imunodifusão em gel de ágar e inibição da hemaglutinação. Dentre as técnicas imunológicas mais usadas atualmente, destacam-se a imunofluorescência e o ensaio imunoenzimático (ELISA). Além dessas, com o avanço das pesquisas na área de genética e biologia molecular, foram desenvolvidas técnicas de detecção do genoma viral, as mais importantes são as reações de hibridização de ácido nucleico e a reação em cadeia da polimerase (PCR). A seguir podem ser encontradas informações de dois dos principais testes laboratoriais utilizados atualmente. - Ensaio imunoenzimático (ELISA) O ELISA é um método no qual a reação antígeno-anticorpo é monitorada por medida da atividade enzimática. Ele possui um papel muito importante no laboratório clínico, pois, além da elevada sensibilidade, apresenta as vantagens de utilizar reagentes estáveis, estar livre das exigências de trabalhar com radioisótopos e poder ser adaptado tanto a testes simples como à automação sofisticada. O ensaio pode ser utilizado com uma variedade de sistemas de detecção, que vão de leituras visuais a fotométricas, com substratos coloridos, fluorescentes ou luminescentes, fato que tem contribuído para sua ampla utilização nos últimos anos. Principais métodos imunoenzimáticos a) ELISA direto (detecção de antígenos) 1. Ensaios para antígenos (ELISA direto) A fase sólida é sensibilizada com anticorpo específico. A amostra em teste, na qual ocorre a pesquisa do antígeno, é incubada com a fase sólida e, a seguir, incuba-se a reação com anticorpo específico marcado com uma enzima. A reação é revelada pela adição do substrato. A taxa de degradação é proporcional à concentração do antígeno. Microbiologia 125 Figura: Esquema representativo do ELISA direto. b) Ensaios para anticorpos (ELISA indireto) A placa na qual será realizado o ensaio é sensibilizada com o antígeno. Segue-se a incubação com a amostra teste. O conjugado (anticorpo + enzima) empregado utiliza uma anti-imunoglobulina humana que reage com o anticorpo da amostra capturado pelo antígeno. A reação é revelada com a solução cromógena. - Reação em cadeia da polimerase (PCR) A técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR) possibilita a produção de um enorme número de cópias de uma sequência específica de um DNA, explorando certas características do processo de replicação do DNA. A DNA polimerase é uma enzima que usa o DNA de fita única como molde para a síntese de uma nova fita complementar. Esse molde de DNA de fita simples pode ser produzido pelo aquecimento a temperaturas próximas da ebulição. A DNA polimerase também requer uma pequena porção de DNA de fita dupla para o início de sua síntese. São os oligonucleotídeos iniciadores (primers). Sendo assim, o ponto inicial para a síntese de DNA pode ser determinado pelo fornecimento de um oligonucleotídeo iniciador que se liga ao molde naquele ponto. Microbiologia 126 As duas fitas de DNA podem servir como molde para a síntese, desde que se forneça um oligonucleotídeo iniciador para cada fita. Os primers escolhidos irão demarcar a região do DNA que deve ser amplificada, de maneira que novas fitas de DNA sejam sintetizadas, iniciadas a partir de cada primer. Elas irão se estender além da posição do oligonucleotídeo da fita oposta. Então, novos sítios de ligação dos iniciadores são gerados para cada nova fita de DNA sintetizada. O resultado final da PCR é disponibilizado ao final de n ciclos e a reação contém o valor máximo de 2n moléculas de DNA de fita dupla, que são cópias de sequências de DNA entre os primers. A reação de PCR Após a extração do genoma da amostra clínica, este é adicionado à mistura de reação que contém: H2O, dNTPs (mistura de nucleotídeos), 1 par de primers (iniciadores), cloreto de magnésio (MgCl2, cofator da DNA polimerase), tampão da enzima e a enzima Taq polimerase (DNA polimerase termoestável derivada da bactéria Thermus aquaticus) . A seguir, a mistura da reação é colocada em um termociclador e procede-se a PCR que é constituída de vários ciclos (30-40 ciclos). Cada ciclo da PCR apresenta 3 fases: Quadro 5.3: Fases contidas em cada ciclo da PCR Desnaturação Conversão do DNA dupla fita em simples fita 95ºC 30seg – 1min Anelamento ligação dos primers às fitas complementares do DNA 55ºC 30seg – 2min Extensão Taq polimerase sintetiza uma fita complementar de DNA 72ºC 30seg – 2min A visualização dos possíveis fragmentos amplificados na PCR pode ser realizada através da eletroforese em gel de agarose. Microbiologia 127 Neste capítulo estudamos a patogênese e o diagnóstico das infecções virais. No próximo capítulo, veremos as principais características relacionadas ao estudo dos fungos. É HORA DE SE AVALIAR Lembre-se de realizar as atividades desta unidade de estudo. Elas irão ajudá-lo a fixar o conteúdo, além de proporcionar sua autonomia no processo de ensino-aprendizagem. Microbiologia 128 Exercícios – Unidade 5 1- “O vírus Epstein-Barr (EBV) exibe tropismo por linfócitos B, mas também é capaz de infectar outras células, como as epiteliais. Após um período de replicação inicial, o genoma do EBV pode permanecer em linfócitos B sem haver replicação. Frente a algum estímulo, o EBV é reativado e volta a replicar, logo, a infecção pelo vírus é caracterizada por produção viral intermitente”. De que padrão de infecção trata-se o fragmento acima? a) Infecçãoaguda. b) Infecção persistente crônica. c) Infecção persistente lenta. d) Infecção persistente latente. e) Infecção abortiva. 2- Um indivíduo apresenta artralgia, mialgia e febre (período 1). Um dia depois, seu quadro evolui para coriza, tosse e espirro (período 2); suspeitando-se, assim, de infecção por Influenza. Frente aos seus conhecimentos sobre os períodos da infecção viral, de que se tratam os períodos 1 e 2? a) período 1: incubação, período 2: doença. b) período 1: doença, período 2: incubação. c) período 1: prodrômico, período 2: doença. d) período 1: convalescença, período 2: prodrômico. e) período 1: janela imunológica, período 2: convalescença. Microbiologia 129 3- Dentre os sistemas vivos que podem ser usados para o cultivo de vírus, são incluídos: a) culturas de células e ensaio imunoenzimático. b) Ensaio imunoenzimático e animais de laboratório. c) culturas de células, animais de laboratório e ovos embrionados. d) culturas de células, animais de laboratório, ovos embrionados e ensaio imunoenzimático. e) Todas as alternativas acima. 4- O termo “susceptibilidade” em virologia refere-se a: (0,75 pontos) a) Células que não permitem a penetração viral. b) Tropismo de um vírus por um hospedeiro. c) Período em que um indivíduo se recupera de uma infecção sintomática. d) Infecção persistente latente. e) Células que possuem um determinado receptor que permite a ligação de um determinado vírus. 5- O termo “permissividade” em virologia refere-se a: a) Células que possuem componentes intracelulares que permitem que um vírus prossiga com a replicação. b) Tropismo de um vírus por um hospedeiro. c) Período em que um indivíduo se recupera de uma infecção sintomátic. d) Infecção persistente latente. e) Células que possuem um determinado receptor que permite a ligação de um determinado vírus. Microbiologia 130 6- Uma dada infecção viral foi caracterizada por rápida síntese de partículas virais prosseguindo para resolução. A qual padrão de infecção viral podem ser atribuídas essas características? a) Infecção aguda. b) Infecção persistente crônica. c) Infecção persistente lenta. d) Infecção persistente latente. e) Infecção abortiva. 7- Assinale a opção incorreta sobre os períodos de uma infecção viral? a) a incubação é a fase do início da infecção até o surgimento dos primeiros sintomas. b) no período prodrômico os sintomas são inespecíficos. c) na fase da doença os sintomas não são específicos do quadro em questão. d) na convalescença o indivíduo doente já está se recuperando. e) nenhuma das opções anteriores. 8- Uma dada infecção viral foi caracterizada por persistência viral no hospedeiro com produção contínua de partículas virais. A qual padrão de infecção viral podem ser atribuídas essas características? a) Infecção aguda. b) Infecção persistente crônica. c) Infecção persistente aguda. d) Infecção persistente latente. e) Infecção abortiva. Microbiologia 131 9- Quanto às técnicas indiretas de diagnóstico viral, por serem INDIRETAS, o que elas detectam? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 10- A reação em cadeia da polimerase é uma técnica de biologia molecular que pode ser utilizado no diagnóstico de infecções virais. Em que ela se baseia? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ Microbiologia 132 Microbiologia 133 Micologia: o estudos dos fungos 6 Microbiologia 134 Nesta unidade, faremos uma análise do das características gerais dos fungos, sua morfologia, metabolismo, patologias associadas e diagnóstico laboratorial. Objetivos da unidade: Conhecer as estruturas que compõem a célula fúngica; Compreender como os fungos se multiplicam; Identificar as diversas características do fungo que podem levar ao surgimento de doenças; Conhecer algumas técnicas laboratoriais aplicadas no diagnóstico das micoses. Plano da unidade: Características gerais dos fungos Classificação, morfologia e biologia dos fungos Outras características fúngicas Diagnóstico laboratorial das micoses Bons estudos! Microbiologia 135 Características gerais dos fungos Introdução A Micologia compreende um vasto campo de estudo, envolvendo micro- organismos conhecidos por fungos, leveduras e actinomicetos, embora estes últimos estejam hoje classificados entre as bactérias. O estudo interessa a vários setores científicos e industriais. Os fungos são organismos heterotróficos que, tempos atrás, foram considerados plantas primitivas ou degeneradas, sem clorofila. No entanto, atualmente está claro que as únicas características comuns entre fungos e plantas – diferentemente dos outros eucariotos – são a natureza séssil e a forma de crescimento multicelular (poucos fungos, incluindo as leveduras, são unicelulares). Evidências recentes no campo da biologia molecular sugerem que os fungos são mais relacionados com os animais do que com as plantas. Os fungos têm forma de vida bem distinta dos outros seres vivos. Histórico No período pré-histórico, os fungos comestíveis, os venenosos e os alucinógenos já eram conhecidos. No período histórico, gregos e romanos escreveram sobre o modo de separar os fungos comestíveis dos venenosos, interesse que chegava ao ponto de perpetuá-los em pinturas (ruínas de Pompeia - Lactarius deliciosus) e gravação em monólitos (Tingad - Argélia). Aparentemente, o primeiro trabalho da era microscópica é o de HOOK: HOOK'S OBSERVATIONS ON FUNGI - MICROGRAFIA, que foi apresentado à Real Sociedade de Londres em 1667. Sobressai, depois, Michelli, com Nova Plantarum, introduzindo a nomenclatura binária. De 1821 a 1832, na Suécia, Elias Fries publica os 3 volumes do System Mycologicum, considerado ponto de partida para muitos grupos de fungos. Um trabalho notável teve início em 1822, com Saccardo, e foi até 1931, constituindo os 25 volumes do Silloge Fungorum, descrevendo mais de 80 mil espécies. No campo estritamente técnico e de interesse industrial, a obra pioneira é Technische Mycologie, publicada entre 1904 e 1907. De Barry, considerado pai da Micologia moderna, publicou Morphologie and Physiologie Derpilze, Flechten, and Myxomyceten. Microbiologia 136 A Micologia Médica Humana começou a ser observada por Schoenlein, Langenbeck,Gruby, sobre as micoses superficiais, a partir de 1839. Estudos sobre micetoma começaram com Gill, 1842. Estudos de aspergiloses, com Virchow, datam de 1856. No princípio do século, Sabouraud inaugura praticamente a Micologia Dermatológica. Este autor deixou um livro até hoje consultado com interesse: LES TEIGNES, de 1910. A imunologia micológica desenvolveu-se após 1940 com os estudos de coccidioidomicose e da histoplasmose. Em virtude desses estudos, nasceu o conceito de micose doença e micose infecção. Um novo campo de interesse surgiu por volta de 1950, sob o título de Infecções Micóticas Ocasionais ( Micoses por Fungos Oportunistas), como consequência do progresso da terapêutica que nos deu antibióticos, corticosteroides e citostáticos valiosos no combate às doenças a que se propõem, mas não isentos de perigo, em virtude do desequilíbrio imunológico que por vezes provocam, abrindo portas de entrada para numerosos micro-organismos, normalmente saprófitos (sapróbios), mas agressivos ao se defrontarem com um organismo imunocomprometido. No âmbito da micologia médica e veterinária, no fim da década de 50, obteve- se o conhecimento de que os fungos do gênero Aspergillus e outros, após ingestão alimentar, são capazes de produzir variadas alterações orgânicas, culminando com a produção de hepatomas (câncer hepático), provocados por toxinas fúngicas, como a aflatoxina e outras semelhantes. Classificação, morfologia e biologia dos fungos O fungo verdadeiro é denominado Eumycophyta. A divisão Eumycophyta subdivide-se, por sua vez, em 4 classes: a) Zigomicetos (Ficomicetos) b) Ascomicetos c) Basidiomicetos d) Deuteromicetos ou Fungos Imperfeitos. Microbiologia 137 Em Micologia, imperfeito significa assexuado. As 3 primeiras classes são de fungos perfeitos, embora a maioria deles também reproduza-se por via assexuada. Morfologia Hifa é o termo usado para designar os filamentos dos fungos. Micélio é o conjunto das hifas. A hifa de um fungo diferencia-se de um filamento bacteriano (bacilos, bastonetes), porque é, geralmente, ramificada, coisa que ocorre raras vezes entre as bactérias. Podemos estudar as hifas sob vários aspectos. a) Quanto à espessura: são delgadas nos Actinomicetos, produtoras de micoses profundas (micetomas) e micoses superficiais (eritrasma e tricomicose axilar). b) Quanto à presença de septos - as hifas podem ser asseptadas ou contínuas, sendo próprias da classe zigomicetos (ficomicetos), agentes das zigomicoses. As hifas septadas pertencem às outras 3 classes. c) As hifas podem ser encaradas ainda como verdadeiras e falsas - As hifas verdadeiras são as que crescem sem interrupção, a partir de germinação de um esporo. As falsas hifas ou hifas gemulantes ou pseudo-hifas são as que crescem por gemulação ou por brotamento sucessivo. Estas últimas são características das leveduras ou fungos que se reproduzem por gemulação (brotamento) e produzem as leveduroses (sapinho) bucal, sapinho vaginal, unheiro das donas de casa etc. d) Uma quarta maneira de estudar as hifas é pela coloração: As hifas hialinas de cores claras são chamadas mucedíneas. As hifas de tonalidade escura ou negra são hifas demáceas; neste caso, as micoses por elas produzidas são chamadas Demaciomicoses. Exemplos: Cromomicose- Tinea nigra. Esporos a) Artroconídios - São esporos que se formam pelo simples desmembramento das hifas septadas. Juntamente com estas últimas, servem para diagnosticar, em um raspado cutâneo, as dermatofitoses (impingens, "frieira", onicomicoses). É o único tipo de esporo encontrado no gênero Geotrichum sp. É um esporo importante na disseminação da coccidioidomicose. Microbiologia 138 b) Blastoconídio - É o esporo que se forma por gemulação (brotamento). Encontrado normalmente nas leveduras. O micélio gemulante ou pseudomicélio das leveduras também produz blastoconídios. Alguns fungos que apresentam normalmente micélio septado na fase saprofítica, na natureza ou nas culturas de laboratório, ao passarem para a fase parasitária no organismo humano ou animal, transformam-se em simples elementos arredondados, reproduzindo-se por gemulação. No Brasil, podemos citar como micose mais importante desse grupo a paracoccidioidomicose (antigamente Blastomicose Sul Americana ou Micose de Lutz). c) Conídios - São os esporos mais frequentes entre os fungos. Para sua formação, há necessidade de uma hifa diferenciada chamada conidióforo. O conidióforo pode ser uma simples hifa, na extremidade da qual se implantam os conídios (exemplos: gêneros Sporothrix, Acremonium - antigo Cephalosporium etc.) ou, então, vão aumentando em complexidade, de modo a constituir um verdadeiro aparelho produtor de conídios, como acontece com o conidióforo em forma de pincel do gênero Penicillium, ou com a cabeça do Aspergillus. Os conidióforos podem ser uni, bi ou multicelulares. Os conídios estão presentes em todas as classes dos Eumicetos (o mesmo que Eumycophyta ou Fungos Verdadeiros), com exceção dos Zigomicetos. d) Esporangiósporo - É o equivalente assexuado do conídio na classe dos Zigomicetos. É assim denominado, porque se forma em um esporangióforo, que termina por uma formação arredondada chamada esporângio, dentro da qual se formam os esporangiósporos. Esses 4 tipos de esporos formam-se por via assexuada. Ainda há muitos outros tipos de esporos assexuados. Entretanto, devemos citar alguns esporos que se formam por via sexuada, que são importantes porque justamente vão caracterizar as diversas classes da divisão Eumycophyta (Eumicetos). Assim, o Oosporo e o Zigosporo são os dois esporos de origem sexuada que caracterizam as duas subclasses da classe dos Zigomicetos. Microbiologia 139 O basidiósporo é o esporo sexuado da classe dos Basidiomicetos, e o ascósporo o da classe dos Ascomicetos. A classe Deuteromicetos não apresenta esporos sexuados, por isso é chamada de classe dos Fungi Imperfecti – fungos imperfeitos. Atualmente usa-se o termo esporo para designar aqueles formados dentro de estruturas reprodutoras (ex.: esporangiosporos formados nos esporângios) e conídios, os formados fora destas estruturas. Outro nome utilizado para esporo é propágulo. Biologia dos Fungos Os fungos são classificados em um reino isolado, o reino Fungi. Eles são organismos eucariontes distinguidos dos outros eucariotos através de uma parede celular rígida composta de quitina e glicano, e uma membrana plasmática na qual o colesterol é substituído pelo ergosterol como o principal componente esteroide. Desprovidos de clorofila, restam duas alternativas aos fungos: viverem no saprofitismo ou no parasitismo. São, portanto, heterotróficos, ao contrário das algas e das plantas, seres clorofilados, autotróficos. Retiram o carbono de que necessitam dos compostos orgânicos vivos (parasitismo) ou mortos (saprofitismo), das proteínas, dos carboidratos, dos lipídios, dos álcoois. Os fungos retiram o nitrogênio de nitratos, de sais de amônio, de ácidos aminados, de ureia, da peptona, do ácido glutâmico. Para utilizarem C e N, muitos fungos necessitam de fatores de crescimento (nutrilitos), como ácidos aminados e vitaminas, específicos para esta ou aquela espécie, eventualmente um sal orgânico como tauroglicocolato de sódio (para o fungo leveduriforme Malassezia furfur, habitante normal de nosso couro cabeludo), quando se deseja cultivá-lo artificialmente, ou ainda o soro fetal bovino, quando também se deseja cultivar no laboratório o Corynebacterium tenuis e o C. minutissimum, agentes de infecções superficiais. Microbiologia140 Figura 6.1: Diagrama ilustrando a célula fúngica. MURRAY, P.R., ROSENTHAL, K.S., PFALLER M.A., 2009, p. 59). Quanto ao oxigênio, os fungos são normalmente aeróbios, podendo desenvolver-se em anaerobiose, sob certas condições. Dos actinomicetos, devemos salientar que os do gênero Actinomyces, alguns dos quais vivem na boca do homem e dos animais, são anaeróbios ou semi-anaeróbios (o mesmo que microaerofílicos). Outros elementos químicos fundamentais são: K - Mg - Fe - P - S - Ca (menos valor). Quanto ao pH do meio, a sua importância é relativa, mas podemos dizer que, em geral, está em torno de 6,0. A maioria dos fungos que se desenvolvem neste pH também cresce relativamente bem, acima e abaixo deste número. Os actinomicetos do gênero Actinomyces, bem como o Corynebacterium tenuis e o C. minutissimum, comportam- se como as bactérias, sendo mais exigentes quanto ao pH. Microbiologia 141 Temperatura Também são muito liberais quanto à temperatura, mas a maioria desenvolve- se melhor entre 25º a 30º C. Alguns fungos isolados do estado parasitário preferem temperaturas próximas de 37º C. Umidade Um ambiente saturado de umidade é melhor para os fungos. Haja vista o bolor que aparece nos lugares mais úmidos de nossas casas. Termogenia Principalmente pelas propriedades fermentativas das leveduras, pode haver um aumento da temperatura do meio em que alguns fungos se desenvolvem; originando são reações exotérmicas. A oxidação total de 180g de glicose pela levedura Saccharomyces cerevisiae produz cerca de 700.000 calorias. As fermentações são devido a enzimas diversas: Glicidases (sacarases, maltases etc.), enzimas proteolíticas (proteases, peptidases) e ainda fosfatases, asparaginase, oxirredutase, dehidrogenase etc. Cromogenia Os fungos são cromóparos, quando difundem no meio os pigmentos que produzem. Cromóforos, quando os pigmentos permanecem no micélio e nos esporos. As culturas apresentam- se com variadas colorações: negra, vermelha, amarela, branca, acastanhada, verde etc. Metabólitos O metabolismo dos fungos pode tanto produzir uma vitamina como uma toxina, tanto um antibiótico como outro produto industrial (leucina, serina, arginina, metionina, ácido oleico, ácido esteárico, prolina, histidina e muitos outros). Microbiologia 142 Exemplos de alguns antibióticos e respectivos fungos produtores: GRISEOFULVINA ..................................... Penicillium griseofulvi PENICILINA ............................................... P. notadum TERRAMICINA ........................................ Streptomyces rimosus NEOMICINA ............................................ S. fradii AUREOMICINA .................................... S. aureofaciens ESTREPTOMICINA ............................... S. griseus ANFOTERICINA B. ................................. S. nodosus A griseofulvina e Anfotericina B têm lugar destacado na terapêutica micológica. O primeiro, para as micoses superficiais, e o segundo, para as micoses profundas. Ecologia A maioria dos fungos vivem nos mais diversos substratos da natureza e são isolados do: solo seco, pântanos, troncos apodrecidos ou nas frutas, leite, água, poeira. São denominados geofílicos (preferência para o solo), zoofílicos (animais) e antropofílicos, os que só têm sido isolados do homem até o momento, como alguns agentes de micoses superficiais: Trichophyton rubrum, Epidermophyton floccosum etc. Origem dos Fungos Por estranho que pareça, os fungos estão mais próximos dos protozoários do que das algas; estas armazenam amido como substâncias de reserva, ao passo que os fungos mais primitivos armazenam glicogênio. Ainda, as formas móveis das algas são multiflageladas, enquanto os fungos móveis (zigomicetos inferiores) são uniflagelados. Microbiologia 143 Outras características fúngicas a) Fungos Comestíveis - Valor Alimentar dos Fungos Desde os tempos mais antigos que o homem utiliza os fungos como alimentos: os chamados fungos carnosos (como o champignon), quase todos da classe basidiomicetos e alguns ascomicetos. Muitos autores consideram os fungos como de pouco valor calórico. Todavia, outros acham que seu valor nutritivo pode equivaler ao dos vegetais frescos. Admite-se que os fungos Psalliota campestris (também chamado Agaricus campestris) e o Boletus edulis têm apreciável valor proteico - cerca de 32% da substância seca. Algumas espécies comestíveis são mencionadas a seguir: Psalliota campestris, Boletus edulis, Lepiota procera, Lactarius deliciosus, Pleurotus ostreatus, Coprimus cometus, Armillaria sp. São mais apreciados os conhecidos por Mórula (Morchella esculenta) e Trufas (Tuber aestivum). Por conta da procura crescente por fungos comestíveis, muitos países tentam cultivá-los, inclusive o Brasil. c) Patologia dos Fungos I) Micoses As infecções fúngicas da pele e seus membros (pêlos, unhas) são muito comuns. Essas infecções são geralmente classificadas pelas estruturas que o fungo coloniza ou invade: a) Micoses superficiais: restritas às camadas mais externas da pele e dos pelos. b) Micoses cutâneas: envolvem as camadas mais profundas da epiderme e seus anexos, os pelos e as unhas. c). Micoses subcutâneas: envolvem a derme, tecidos subcutâneos, músculo e tecido conjuntivo. d) Micoses sistêmicas: causadas geralmente por fungos dimórficos, que são organismos que existem na forma de fungo filamentoso na natureza ou em Microbiologia 144 laboratório, quando cultivados entre 25°C e 30°C, e na forma de levedura ou esférula em tecido, ou quando cultivados em meios enriquecidos em laboratório, a 37°C. As micoses sistêmicas geralmente partem de um ponto de infecção primária e podem se disseminar por outros sítios orgânicos. II) Quadros provocados por alimentos contaminados por fungos: A maior parte dos fungos produtores de toxinas ocorre nas forragens e nos cereais estocados em silos, celeiros e depósitos. Os animais são atingidos muito mais frequentemente do que o homem. Embora o fato fosse conhecido há mais tempo, foi somente a partir de 1961 que o problema suscitou a curiosidade de numerosos pesquisadores, a partir do grande número de animais de interesse comercial atingidos, especialmente perus e gansos. Demonstrou- se que estes animais haviam sido alimentados com tortas contaminadas pelo fungo Aspergillus flavus. Logo em seguida, descobriu-se a toxina: aflatoxina. Experiências com a toxina em animais de laboratório (patos jovens) mostraram a indução de hiperplasia dos canais biliares, ao passo que, em ratos e trutas, provocaram hepatoma. Alimentos contaminados por diversos representantes do gênero Aspergillus produziram variadas manifestações patológicas como transtornos hepáticos e renais nos bezerros, hiperqueratose no gado adulto, síndrome hepato-hemorrágica em porcos, bovinos, perus e outros animais. No Japão já se observou que, pelo menos, 5 espécies de Penicillium e alguns Aspergillus produzem toxinas em arroz estocado. Certas espécies de Fusarium, já foram associadas à Aleucia Tóxica Alimentar, na Rússia, por ingestão de forragem ou cereais contaminados. O quadro inicia-se com diarreia, vômito, queimação epigástrica, terminando com manifestações evidentes de depressão da medula óssea, com aplasia evidente, sangramento, trombocitopenia secundária e leucopenia. A toxina é a esporofusariungenina e forma-se com o alimento estocado na temperatura entre 8º e 10º C. Microbiologia 145 Outro Fusarium - Fusarium roseum ou Fusarium graminearum - promovesíndrome semelhante, no entanto muito benigna, pois os sintomas cessam tão logo o organismo deixa de receber novas cargas de toxinas: é a chamada síndrome do pão tóxico, também descrita na Rússia. Conhecido há séculos, porém hoje quase inexistente, é o quadro chamado de ergotismo, produzido por diversas toxinas do fungo Claviceps purpurea, que invade o grão de centeio, aumenta o volume do mesmo, transformando- o no que os franceses chamam Ergot (esporão do centeio). O pão feito com esses grãos contaminados, misturados aos sadios, provocam desde simples transtornos circulatórios até gangrena de extremidades. Em certas gramíneas mortas pode crescer o fungo Pithomyces chartarum, que produz uma micotoxina agente do Eczema Facial de Bezerros. Em nossos lares vemos frequentemente queijos, pães, frutas e mesmo carnes cobrirem-se de fungos esverdeados, acinzentados, negros, brancos, amarelos, pertencentes a vários gêneros: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Mucor, Fusarium, Curvularia, Helminthosporium, Geotricum e Leveduras. Ainda não se isolou toxinas, às quais se pudessem atribuir alterações patológicas graves, das espécies que têm sido estudadas, nesses casos, como a aflatoxina do Aspergillus flavus, que possui propriedades carcinogênicas (hepatomas). Entretanto, vez ou outra, a contaminação por esses fungos pode provocar gastrite e vômitos, principalmente se a carga de fungos nos alimentos for alta. III) Quadros provocados por ingestão de fungos venenosos: Esses quadros patológicos resultam do engano cometido pela vítima ao ingerir fungos supostamente comestíveis. De fato, os fungos venenosos são muito parecidos com os comestíveis. As substâncias tóxicas neles contidas atuam por suas propriedades hemolíticas, gastrotóxicas, hepatotóxicas, nefrotóxicas, neurotóxicas e psicotrópicas, algumas espécies fúngicas podem englobar duas ou mais destas propriedades. A tais quadros, denominamos MICETISMOS: Microbiologia 146 a) MICETISMO GASTROINTESTINAL - provocado por fungos dos gêneros Russula, Boletus, Lactarius, Lepiota, Enteloma (R. emetica, Boletus satanas, L. torminosus, L. morgani). Sintomas: náuseas, vômitos, diarreia. Em geral, o quadro se resolve em 48 horas. b) MICETISMO COLERIFORME - produzido pela ingestão da Amanita phalloides a qual contém 3 substâncias tóxicas a saber: Amanitina (nome também empregado para designar o pigmento vermelho da Amanita muscaria) inibidora de RNApolimerase II e III, Falina, de propriedades hemolíticas e a mais importante, a Faloidina, considerada tóxica para o sistema nervoso central. Nos EUA., 90% das mortes por fungos venenosos ocorrem por causa da A. phalloides. Sintomas semelhantes podem ser provocados por outros fungos como o Psaliota autumnalis, Higrophorus conicus e outras espécies de Amanita. A alta mortalidade deve-se ao aparecimento tardio dos sintomas - 6 a 15 horas após a ingestão. São eles: dor abdominal, vômitos, diarreia, fezes sanguinolentas e mucosas, cilindrúria, enfraquecimento progressivo, cianose; a morte podendo ocorrer de 2 a 3 dias após o início dos sintomas. A necropsia revela lesões renais, necrose externa e degeneração gordurosa do fígado, além de edema cerebral. c) MICETISMO NERVOSO - Provocado pela ingestão de diversos fungos: Amanita muscaria, A. pantherina, Inocybe infelix, I. infida, Clitocybe illudens. Ao contrário do micetismo coleriforme, a taxa de mortalidade é baixa. Os sintomas aparecem geralmente um hora após a ingestão, com ação depressiva sobre o coração, salivação profusa, lacrimejamento, cólicas abdominais, vômitos, diarreia, excitação nervosa, delírio, coma. A muscarina estimula as terminações nervosas, mas este efeito é anulado pelo emprego da atropina. Em pequenas doses, a muscarina tem ação semelhante à da Cannabis indica (hachiche), por isso, na Sibéria e na mitologia sueca (Viking), a Amanita muscaria era usada para provocar sonhos e alucinações. d) MICETISMO SANGUÍNEO - provocado por hemolisinas da Helvella esculenta. Vários fungos contêm hemolisinas, que são destruídas pelo calor e pela digestão. A toxina da Helvella esculenta é resistente ao calor e produz hemoglobinúria transitória, desconforto abdominal, icterícia. É de bom prognóstico, mas ocorrem óbitos. A transfusão sanguínea é útil no tratamento. Microbiologia 147 e) MICETISMO CEREBRAL - Substâncias com propriedades alucinogênicas são encontradas em diversos fungos "comestíveis", tais como Psilocybe mexicanus (Psilocibina), Stropharia cubensis (Psilocina), Paneolus, Conocybe. Seu uso eleva a percepção ao nível de percepção extrassensorial, por isso são largamente utilizados em certas comunidades mexicanas, em ritos religiosos ou não. Um outro fungo - Claviceps purpurea, causador do ergotismo, também contém substâncias dessa natureza, aliás a mais famosa, atualmente - o LSD 25. Todos esses produtos também são chamados psicomiméticos, porque seus efeitos são parecidos com os da PSICOSE MIMÉTICA, em que os indivíduos se identificam com os objetos do meio ambiente; ou então psicodélicos, nome proposto pela psiquiatria canadense, por conta da capacidade em se despertar o potencial imaginativo latente no indivíduo. Há tentativas experimentais no sentido de se esclarecer o mecanismo das disfunções psicológicas, visto que a sintomatologia provocada por estes alucinógenos assemelha- se a certas psicoses. IV) Micoses Ocasionais ou Micoses por Fungos Oportunistas: São micoses produzidas por fungos normalmente saprófitos, que se tornam parasitas quando invadem organismos em que o sistema de defesa está abalado por doenças graves, crônicas, ou submetidos a medicação intensiva por antibióticos, corticosteroides e citostáticos, resultando em desequilíbrios imunológicos sérios. V) Mícides ou Alérgides Micósicas: São manifestações cutâneas provocadas por reação de sensibilidade aos fungos. VI) Alergia Provocada por Fungos: Trata-se, em geral, de manifestações do aparelho respiratório: rinites, asma brônquica. É produzida por fungos, especialmente quando as pessoas sensíveis vivem em ambiente quente e úmido, que favorece o emboloramento das paredes e dos objetos. Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Cladosporium (Hormodendrum), Curvularia e outros estão geralmente a causa. Microbiologia 148 Diagnóstico laboratorial das micoses Quanto ao diagnóstico das micoses, no laboratório, podem ser empregadas algumas etapas: 1º - Exame direto 2º - Cultura 3º - Biópsia - Histopatologia 4º - Provas Imunológicas 5º - Exame Radiológico 6º - Inoculação Animal 1º - Exame Direto Qualquer tipo de material patológico pode ser utilizado no exame direto: raspado cutâneo, pelos, cabelos, unhas, exsudatos diversos, escarros, urina, fezes, sangue, líquor, medula óssea, fragmentos de tecidos. O exame pode ser a fresco, sem fixação, entre lâmina e lamínula, misturados ou não com certos líquidos de exame, como potassa, em percentagens diversas, Lactofenol de Amann, Lugol ou, então, o material pode ser fixado na lâmina e corado por um método, tal como o Gram, o Ziehl, o Giemsa, o PAS. 2º – Cultura do material patológico Muitos meios de cultura são utilizados em micologia. Dentre os mais comuns: Meio Sabouraud Glicose .......................................................... 40 g (ou maltose) ................................................. 50 g Peptona .......................................................... 10 g Ágar ............................................................... 15 g Água ..............................................................1000 mLMicrobiologia 149 Esse meio serve, praticamente, para o isolamento de todos os fungos. Entretanto, o actinomiceto do gênero Actinomyces, pela sua característica de ser microaerófilo (semi-anaeróbio), requer meios especiais de cultivo. Muitas vezes material, ao ser cultivado, está contaminado não somente por numerosas bactérias, como também por outros fungos. Logo, pode-se acrescentar certos antibióticos ao meio, para torná-lo mais seletivo. 3º - Biópsia - Histopatologia Histopatologia: nas micoses profundas, sempre que possível, o diagnóstico pode não dispensar a pesquisa histopatológica. Não pela peculiaridade das reações tissulares que, embora muitas vezes elucidativas, não são específicas, mas pelo achado do agente etiológico. De um modo geral, os agentes das micoses profundas apresentam-se sob a forma arredondada, com características suficientes para serem diferenciados uns dos outros. Dentre os que se apresentam arredondados, há um grupo em que essas formas são gemulantes e as micoses, por eles produzidas, são denominadas granulomatose blastomicoides ou, às vezes, blastomicoses. 4º - Provas Imunológicas As provas imunológicas, em micologia médica, apresentam um valor diagnóstico relativo, não sendo dispensados os métodos clássicos que visam o achado do agente etiológico, pelo exame direto ou pela análise histopatológica, ou mesmo pelo isolamento do mesmo em cultura. Entretanto, com os progressos recentes no setor laboratorial, esse valor relativo pode, em certos casos, subir tanto a ponto de quase equivaler ao achado do fungo. Microbiologia 150 5º - Exame Radiológico O exame radiológico é indispensável em muitas eventualidades, visto que as micoses não poupam região alguma do organismo, pulmões, cérebro, ossos, aparelho digestivo, etc. 6º - Inoculação Animal Os animais de laboratório são úteis para: testar fungos quanto ao seu poder patogênico. Pode-se inocular material patológico nesse sistema hospedeiro, com a finalidade de se obter, depois, culturas puras de fungo (da histoplasmose, por exemplo), e fazer diagnóstico diferencial, por exemplo, entre paracoccidioidomicose e tuberculose, por inoculação de material patológico em testículo de cobaia. São utilizados com mais frequência os camundongos, ratos brancos, hamsters, e embrião de pinto. Neste último capítulo, estudamos as características gerais dos fungos. Que sua jornada pelo mundo da microbiologia continue de forma curiosa e prazerosa! É HORA DE SE AVALIAR Lembre-se de realizar as atividades desta unidade de estudo. Elas irão ajudá-lo a fixar o conteúdo, além de proporcionar sua autonomia no processo de ensino-aprendizagem. Microbiologia 151 Exercícios – Unidade 6 1 - Durante muito tempo, os fungos foram classificados no reino Plantae, juntamente com as plantas. Entretanto, uma característica evidente nos permite reconhecer os motivos de estes serem separados em reinos distintos. Que característica tão evidente pode ser essa? a) O fato dos fungos serem procariontes. b) O fato dos fungos possuírem clorofila b, diferente da clorofila a presente nas plantas. c) Os fungos não fazem fotossíntese. d) Os fungos se reproduzem por esporos, diferentemente das plantas que o fazem por sementes. e) os fungos são autótrofos decompositores. 2 - Substância presente na parede das hifas fúngicas, também presente no esqueleto de alguns animais como crustáceos e insetos: a) Celulose. b) Quitina. c) Oxalato de cálcio. d) Glicogênio. e) Amido. Microbiologia 152 3 - Todos os itens indicam alguma importância ligada à atividade de fungos, exceto: a) Podem causar doenças chamadas micoses. b) Desempenham papel fermentativo. c) Produção autotrófica de substâncias orgânicas para consumo de outros seres. d) Alguns produzem antibióticos. e) Participam na formação de liquens. 4 - As afirmações abaixo se referem ao grupo dos fungos. I – Fungos dimórficos podem promover micoses sistêmicas e mudam sua morfologia dependendo de condições ambientes; II – Fungos patogênicos são os principais causadores de doenças de pele em pessoas que estão com o sistema imunológico afetado, como, por exemplo, as que estão contaminadas com o vírus HIV; III – Aflatoxinas são metabólitos secundários produzidos por alguns fungos, que frequentemente contaminam amendoim, milho, trigo, entre outros, podendo causar câncer de fígado em pessoas e animais que as ingerem. Quais estão corretas? a) Apenas I. b) Apenas II. c) Apenas I e II. d) Apenas II e III. e) I, II e III. Microbiologia 153 5- Dentre os fatores que diferem a célula fúngica da humana, assinale a única alternativa correta: a) A célula fúngica é procarionte, a humana é eucarionte. b) A célula fúngica não possui parece celular e a humana sim. c) A célula fúngica.apresenta ergosterol na membrana plasmática e a humana colesterol. d) A célula fúngica não possui organelas e a humana sim. e) Nenhuma das alternativas anteriores. 6- Um fungo demáceo: (0,75 pontos) a) É pigmentado. b) Não apresenta cor. c) Apresenta-se apenas sob a forma de levedura; d) É assim chamado por ser dimórfico; e) Todas as alternativas anteriores. 7-- Os fungos denominados hialinos: (0,75 pontos) a)São pigmentados; b) Naturalmente não apresentam cor; . c) Apresentam-se apenas sob a forma de levedura; d)São assim chamados por serem dimórficos; e) Todas as alternativas anteriores. Microbiologia 154 8- Os fungos são organismos que integram o Reino Fungi e que apresentam as seguintes características: a) células procariontes, fotossintetizantes. b) células eucariontes, autotróficas. c) células procariontes, nutrição heterotrófica. d) células eucariontes, nutrição heterotrófica. e) nenhuma das alternativas anteriores. 9 – Se os fungos não se locomovem, como eles podem se espalhar por toda a Terra? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 10- Alguns fungos são comestíveis e, inclusive, comercializados como iguarias únicas. No entanto, em micologia, existe um quadro denominado micetismo. Do que ele se trata? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ Microbiologia 155 Considerações finais Após essa breve viagem pelo mundo da microbiologia, espero que seu interesse tenha sido despertado e que você, caro aluno, busque cada vez mais informações sobre o mundo microbiano que nos cerca. Tenha em mente que o entendimento sobre bactérias, vírus e fungos vai muito além do que foi lhe apresentado, já que a microbiologia não é uma ciência estática, ela está em constante mudança. Espero que esse material tenha sido útil, auxiliado em seus estudos e contribuído para seu sucesso acadêmico. Microbiologia 156 Microbiologia 157 Conhecendo a Autora LarissaSilva dos Santos é biomédica, com habilitação em análises clínicas, formada pela Universidade Federal Fluminense (UFF), mestre em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas (UFF) e doutorando em Ciências Médicas (UFF). É docente da Universidade Salgado de Oliveira desde 2012, atuando em disciplinas ministradas aos cursos de Ciências Biológicas, Nutrição e Enfermagem. Ocupou o cargo de professora auxiliar da Universidade Federal Fluminense, ficando encarregada da disciplina de Microbiologia II (módulo virologia) oferecida para o curso de Enfermagem. Desde os tempos de graduação atua em análise laboratorial prática em virologia e considera a pesquisa científica um dos norteadores acadêmicos mundiais. Microbiologia 158 Microbiologia 159 Referências ALVES, S. B. Fungos entomopatogênicos. In. Alves, S.B. Controle Microbiano de insetos. Piracicaba: FEALQ, 1998. ATTLI, S. D. Importância e sistemática de fungos filamentosos. 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Bactérias Gram positivas exibem, em sua parede celular, uma espessa camada de peptideoglicano, além dos ácidos teicóico e lipoteicóico. A grossa camada de peptideoglicano impede, durante a aplicação da técnica, que o álcool retire o corante cristal-violeta do interior das bactérias 10) As células procariontes exibem características como núcleo não delimitado por membrana, ausência de organelas membranares e cromossomo diferenciado, já as eucariontes apresentam núcleo delimitado por membrana e diversas organelas membranares. Microbiologia 163 UNIDADE 2 1) b 2) d 3) b 4) c 5) a 6) d 7) a 8) b 9) Após a descrita inserção, o comportamento da população bacteriana pode ser dividido em fases. A fase lag é caracterizada pela adaptação, a população ela não se multiplica imediatamente. Logo em seguida ocorre a fase log ou exponencial, marcada pela divisão da célula bacteriana em duas, promovendo o aumento da população microbiana no meio de cultura. A fase estacionária é o momento em que ocorre a interrupção do crescimento bacteriano, nela a multiplicação bacteriana é limitada geralmente pelo consumo de um elemento essencial do meio de cultura e pela excreção de metabólitos possivelmente tóxicos, por parte dos próprios microrganismos. marca a fase estacionária. Por fim, o declínio ocorre quando a população bacteriana, já sem condições de manter seu metabolismo, morre. 10) Provavelmente, através da troca genética conhecida como transdução, foram transferidas informações genéticas, de uma bactéria para outra, para a geração de resistência ao primeiro antibiótico administrado. Microbiologia 164 Exercícios – Unidade 3 1. c 2. d 3. a 4. b 5. a 6. e 7. d 8. c 9. R: Os macrolídeos são agentes antibacterianos, que atuam pela ligação ao RNA ribossomal 23S da subunidade 50S, assim bloqueando a biossíntese de proteínas bacterianas. 10. R: A limpeza é necessária para que resíduos de matéria orgânica que possam ficar presentes nos materiais não interfiram na qualidade dos processos de desinfecção e esterilização. Exercícios – Unidade 4 1. b 2. c 3. e 4. b 5. d 6. a 7. d 8. a Microbiologia 165 9. R: RNAs de polaridade positiva são diretamente traduzidos em proteínas durante a replicação viral. Já os RNAs de polaridade negativa servem como molde para a síntese de um RNA complementar que, então, pode ser traduzido em proteínas. 10. R: Os retrovírus têm a capacidade de sintetizar o DNA a partir de moléculas de RNA - a transcrição reversa- utilizando a enzima viral transcriptase reversa. O representante mais conhecido dessa família é o vírus da imunodeficiência humana, o HIV. Exercícios – Unidade 5 1. d 2. c 3. c 4. ? 5. a 6. a 7. c 8. b 9. As técnicas indiretas de diagnóstico viral permitem a detecção de anticorpos na amostra em questão. 10. A PCR baseia-se na amplificação de um segmento gênico específico. Esse fragmento é amplificado com base nas propriedades de uma enzima DNA polimerase e através do uso de primers, ou seja, oligonucleotídeos que permitem a evidenciação de um fragmento genômico específico. Microbiologia 166 Exercícios – Unidade 6 1. c 2. b 3. c 4. e 5. c 6. a 7. b 8. d 9. R: Os fungos se reproduzem por produção de esporos, os quais podem ser levados pelo vento, assim, se espalham por novos ambientes. 10. R: O micetismo ocorre após a ingestão de fungos tóxicos, resultando em diversas manifestações patológicas que podem, inclusive, levar o indivíduo à morte.