Histologia - introdução

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Introdução a 
Histologia
Programa
• Introdução a histologia
• Técnicas histológicas de rotina (inclusão em parafina, congelação) 
• Colorações histológicas (corante básico e ácido)
• Interpretação tridimensional de cortes histológicos (transversal, 
longitudinal)
• Noções básicas de microscopia: 
– Microscópio óptico (luz, contraste de fase, confocal)
– Microscópio eletrônico (transmissão e varredura)
Histologia
• Estudo dos tecidos do corpo e de como estes tecidos se
organizam para constituir órgãos.
• Apesar da sua grande complexidade, o organismo humano é
constituído por apenas quatro tipos básicos de tecidos:
– tecido epitelial
– tecido conjuntivo
– tecido muscular
– tecido nervoso
• Os tecidos, formados por células e matriz extracelular, não
existem como unidades isoladas, mas associados uns aos
outros em proporções variáveis, formando os diferentes
órgãos e sistemas do corpo.
Cada tecido é formado por vários tipos de células, além de
combinações específicas de células e matriz extracelular.
Muito características e facilitam o 
reconhecimento dos subtipos de tecidos. 
Técnicas histológicas de rotina
• No microscópio de luz (óptico) a imagem pode ser examinada
porque um feixe de luz é transmitido através do corte.
• Uma vez que tecidos e órgãos são normalmente espessos
para permitir a passagem de um feixe de luz, eles devem ser
seccionados para se obterem cortes histológicos delgados,
que são colocados em lâminas de vidro antes de serem
examinados.
• As secções obtidas necessitam sofrer uma série de
tratamentos prévios para poderem ser fatiados por meio de
micrótomos.
Técnicas histológicas de rotina
• Um preparado microscópico ideal deveria ser preservado de
tal forma que sua estrutura e composição molecular seriam as
mesmas que tinha no corpo.
Fixação
Tratamento dos fragmentos de órgãos, que ocorrem antes ou o
mais rapidamente possível depois de sua remoção, para:
• Para evitar a digestão dos tecidos
– por enzimas presentes no interior das células (autólise)
– por bactérias
• Para preservar a estrutura e a composição molecular
Fixação
• Este tratamento frequentemente é feito por substâncias
químicas, onde os tecidos são imersos em soluções de
agentes desnaturantes ou de agentes que estabilizam as
moléculas formando pontes com moléculas vizinhas.
• Estas soluções são chamadas de fixadores:
– Formaldeído a 4%
– Glutaraldeído
– Fixação dupla: glutaraldeído tamponado, seguida por tetróxido de
ósmio (microscópio eletrônico)
Inclusão
• Para obter secções delgadas com o micrótomo, após terem
passado pela fixação os fragmentos de tecidos e órgãos
devem ser infiltrados com substâncias que lhes proporcionem
uma consistência rígida.
• Dentre as substâncias que têm esta propriedade, as mais
utilizadas são a parafina (microscopia de luz) e algumas
resinas de plástico (microscopia eletrônica).
Inclusão
• Os blocos rígidos contendo os tecidos são seccionados em um
micrótomo, por uma lâmina de aço ou de vidro, de modo a
fornecer cortes de 1-10 μm de espessura.
• Após serem seccionados, os cortes são colocados para flutuar
sobre uma superfície de água aquecida, de onde são
colocados sobre lâminas de vidro, onde aderem e onde serão
depois corados.
Congelação
• Outro modo de preparar secções de tecidos.
• Os tecidos são fixados por congelação (um método físico),
ficando ao mesmo tempo rígidos e, assim, prontos para serem
seccionados em um micrótomo específico para tecidos
congelados (o criostato).
Congelação - Vantagens
• Este método permite a preparação rápida de cortes sem passar
pelo longo procedimento de desidratação e inclusão.
– Habitualmente usado em hospitais para analisar espécimes obtidos durante
procedimentos cirúrgicos.
• Útil para o estudo histoquímico de enzimas muito sensíveis ou de
moléculas pequenas, pois o congelamento, ao contrário da fixação
química, não inativa a maioria das enzimas e mantém as pequenas
moléculas em seus locais originais.
• É aconselhada quando se deseja estudar lipídios presentes nos
tecidos, pois a imersão de tecidos em solventes como xilol dissolve
estas substâncias.
Preparação Tecidual
Coloração
• Para serem estudados no microscópio, a maioria dos cortes
histológicos devem ser corados. Isto porque a maioria dos
tecidos é incolor, de modo que observá-los ao microscópio de
luz será muito pouco proveitoso.
Coloração
• A coloração não só torna evidente os vários componentes dos
tecidos, como também facilitam a distinção entre eles.
• A maioria dos corantes se comporta como compostos ácidos
ou básicos e tende a formar ligações eletrostáticas (salinas)
com radicais ionizados dos tecidos.
– Componentes dos tecidos que se coram bem com corantes básicos são
chamados de basófilos.
– Componentes que têm grande afinidade por corantes ácidos são
chamados de acidófilos.
Colorações histológicas
Corante básico e ácido
Corante H&E:
H – Hematoxilina é um corante básico (alcalino);
• Hematoxilina age sobre estruturas ácidas como o núcleo
• Ácido + Base  Sal + Água
• Núcleo + Hematoxilina  Roxo + Água
E – Eosina é um corante ácido
• Eosina age sobre estruturas alcalinas como o citoplasma
• Ácido + Base  Sal + Água
• Eosina + Citoplasma  Róseo + Água
Corante H&E:
Interpretação de cortes histológicos
• Corte (secção) num plano mediano é um corte longitudinal no
maior eixo, separando o lado direito do lado esquerdo.
• Cortes sagitais: paralelos ao plano mediano.
• Corte vertical: produzindo o plano frontal, separa a porção anterior
da posterior, portanto é um corte vertical em ângulo reto ao plano
mediano.
• Cortes transversais: ocorrem no menor eixo, com base num ser
humano, separa a porção superior da inferior.
Noções básicas de microscopia
• Microscópio óptico (luz, contraste de fase, confocal)
• Microscópio eletrônico (transmissão e varredura)
MICROSCOPIA DE LUZ
• Preparações coradas são examinadas por iluminação que
atravessa o espécime.
O microscópio é composto de partes mecânicas e ópticas, sendo
que a parte óptica consiste em três sistemas de lentes:
• O condensador concentra a luz e projeta um feixe luminoso
sobre o espécime.
• A objetiva projeta uma imagem aumentada do objeto em
direção à ocular, que novamente amplia a imagem e a projeta
na retina (ampliação total dada pelo microscópio é igual ao aumento da
objetiva multiplicado pelo aumento da ocular) ou em detector/tela.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE
• Permite a observação de células e cortes não corados
(geralmente quase transparentes e difíceis de serem observados com detalhes).
• Baseia-se no fato de que a luz muda sua velocidade ao
atravessar estruturas celulares e extracelulares que tenham
índices de refração diferentes. Estas mudanças são usadas
pelo sistema de contraste de fase para fazer com que as
estruturas apareçam mais claras ou mais escuras e fazem
deste tipo de microscopia uma ferramenta poderosa para
observar células vivas.
Luz
X
Contraste de Fase
MICROSCOPIA CONFOCAL
Torna possível focalizar um plano de foco muito delgado do espécime.
Os princípios nos quais este microscópio se baseia são os seguintes:
1) O espécime é iluminado por um feixe de luz muito estreito (no
microscópio de luz um feixe muito grande ilumina o espécime);
2) A imagem coletada do espécime passa por um pequeno orifício.
• Desta forma, só a imagem originada do plano focalizado alcança o
detector, enquanto as imagens de planos anteriores e posteriores
são bloqueadas. A luz proveniente de fora do plano de foco é em
grande parte eliminada, a definição do objeto focalizado fica
melhor e a localização de componentes do espécime pode ser feita
com muito mais precisão que no microscópio deluz.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
• A microscopia eletrônica de transmissão e de varredura se baseia
na interação entre elétrons e componentes dos tecidos.
• Microscopia Eletrônica de Transmissão
• Sistema de produção de imagens que permite uma alta resolução.
Alguns elétrons interagem com átomos do corte ao atravessá-lo,
enquanto outros cruzam o espécime sem interagir com ele. Os
elétrons atingem a lente objetiva que produz uma imagem
aumentada do objeto, a qual é projetada nas outras lentes que por
sua vez aumentam a imagem ainda mais. Pelo fato da nossa retina
não ser sensível a elétrons, para se observar uma imagem os
elétrons necessitam ser projetados sobre um detector.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
• A microscopia eletrônica de transmissão e de varredura se baseia
na interação entre elétrons e componentes dos tecidos.
• Microscopia Eletrônica de Varredura
• Fornece imagens pseudotridimensionais das superfícies de células,
tecidos e órgãos. Neste microscópio eletrônico um feixe muito
pequeno de elétrons é movido sequencialmente de modo a
“varrer” o espécime. O microscópio eletrônico de varredura mostra
somente uma visão de superfícies.