métodos para a identificação de parasitas no sangue e tecidos

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MÉTODOS PARA 
IDENTIFICAÇÃO DE 
PARASITAS NO SANGUE E 
TECIDOS
UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI-URCA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE-CCBS
DEPARTAMENTO DE ENFERMAGEM-DENF
CURSO DE ENFERMAGEM- 3°SEMESTRE
DISCENTE: JOSÉ EDUARDO PEREIRA ALCÂNTARA
CRATO-CE
2018
 Introdução:
Atualmente diversas doenças parasitárias interferem na qualidade de
vida da população causando agravos à saúde daqueles que por elas são
acometidos.
Brasil clima tropical propício para o desenvolvimento
de complexos ecossistemas e de variadas formas de vida (entre elas
também se encontram muitos micro-organismos e parasitas), estão
intimamente associados a forma de vida da população que por vezes
favorece diretamente para seu surgimento e desenvolvimento.
Após uma infecção por um agente patológico que possa ser prejudicial
a melhor opção é sempre um bom diagnóstico e alguns dos métodos
utilizados para esse controle são os exames parasitológicos de sangue.
 Os métodos para a identificação desses parasitos consistem
em examinar microscopicamente uma gota de sangue do
paciente colocada sobre uma lâmina, observando o parasita
vivo ou fixado e corado em esfregaços;
 Doenças como a malária, a filariose brancroftiana, a
babesiose, e a doença de chagas em sua fase aguda
apresentam formas ou estágios no sangue e por isso podem
ser diagnosticadas pelos exames parasitológicos de sangue;
 Esses métodos de identificação deverão ser realizados
imediatamente no momento em que é feita a coleta do
material de amostra, caso não seja possível no momento a
amostra deverá ser adequadamente bem conservada através
do uso de anticoagulantes como heparina ou citrato para
posterior análise;
Coleta de sangue
 Os locais mais usados são polpa digital do anular esquerdo ou
lóbulo da orelha, onde a pele é fina e há boa irrigação
sanguínea;
 Com o algodão molhado em álcool ou álcool iodado puro,
limpa-se a superfície escolhida. Com o alfinete, previamente
esterilizado, faz–se uma pequena picada na pele. Por
compressão, sai pequena gota de sangue, a qual poderá ser
examinada.
 Obs.: ao fazer a picada, o dedo ou o lóbulo da orelha devem estar
bem secos. Caso estejam molhados pelo desinfetante ou suor,
haverá hemólise das hemácias.
Métodos de exame:
 Direto:
 Como o próprio nome sugere a gota de sangue deve ser coletada
diretamente no centro da lâmina, coberta por uma lâmina e examinada
imediatamente após a coleta;
 Caso seja necessário retardar o processo de coagulação, uma ou duas
gotas de salina devem ser adicionadas a solução;
 Ao levar a solução ao microscópio, poderão ser vistos os parasitos que
estejam presentes, além disso torna-se viável observar sua
movimentação.
Coleta de sangue
 Em esfregaços:
 É uma técnica que permite a separação de células em meio
líquido. Consiste em espalhar um fragmento de tecido ou de
uma colônia sobre uma lâmina de vidro, o que provoca a
dissociação de alguns elementos celulares e a sua aderência ao
vidro;
 Existem dois tipos de esfregaço o que é feito em camada
delgada (gota estirada) e o esfregaço em camada espessa (gota
espessa);
 O primeiro é mais utilizado para a identificação da forma e da
espécie de vários parasitos, pois quando é devidamente
realizado os parasitas podem ser vistos nitidamente.
COLETA DE SANGUE
 O segundo é mais utilizado em diagnóstico epidemiológico, é
um método de enriquecimento, ou seja a gota de sangue é
disposta numa pequena área e então pode ser examinada.
Confere maior economia de tempo porém sua especificidade é
dificultada
 Esfregaço em camada delgada(gota estirada):
 Colocar uma gota de sangue na extremidade direita de uma lâmina (esta
deve estar apoiada sobre a mesa);
 Pegar outra lâmina, segurar por cima com a mão direita e, com uma
inclinação de 45°, encostar adiante da gota;
 Deixar a mesma se espalhar pela superfície de contato das duas lâminas;
 Puxar a gota espalhada até o fim da lâmina;
 Secar por agitação vigorosa imediatamente (se não secar rápido, haverá
hemólise das hemácias);
 Corar pelo Giemsa ou Leishman conforme indicado adiante.
 Esfregaço em gota espessa:
 Colocar 5 mm³ de sangue na lâmina;
 Com o canto de outra, espalhar essa gota numa área de 1 cm²;
 Deixar secar ao ar durante seis a 36 horas;
 Entre seis e 36 horas (não ultrapassar esse período), corar pelo
Giemsa (uma gota de solução-estoque por mL de solução-tampão);
 Deixar em repouso por 30 minutos;
 Lavar e examinar.
 Esfregaço em gota espessa:
 Caso o esfregaço tenha secado por mais de 36 horas, deve-se então
proceder assim:
 colocar a Lâmina com a gota espessa numa vasilha com água
destilada;
 deixar em repouso por dez minutos, para desemoglobinizar;
 retirar a lâmina cuidadosamente;
 deixar secar por alguns minutos;
 fixar pelo álcool metílico (dois minutos) e corar pelo Giemsa (30
minutos).
 Corantes:
Os mais utilizados são os corantes do tipo Romanowky, sendo mais
comumente o Giemsa e o Leishman
Giemsa:
 Azur II eosina ....................................................0,30 g
 Azur II ................................................................0.08 g
 Glicerina .............................................................12,50 g
 Álcool metílico ................................................. 37,50 g
 Esta é a solução-estoque. Pode ser preparada em laboratório ou
comprada pronta. Para ser usada, deve ser diluída em solução-
tampão da seguinte forma: três gotas de corante-estoque, para
cada 2 ml de tampão.
 A solução-tampão, com pH 7,2, é assim preparada:
 Solução-estoque A: fosfato de sócio secundário (dissódico): dissolver
11,866 g desse em 1.000 ml de água destilada;
 Solução-estoque B: fosfato de potássio primário (monopotássico):
dissolver 9,073 desse em 1 .000 ml de água destilada.
 Essas soluções-estoques devem ser mantidas em geladeira. Na hora
de usar, misturar 72,5 ml da solução A, com 27,4 ml da solução B.
Para se corar pelo Giemsa, após feito o esfregaço, proceder da
seguinte maneira:
 Fixar pelo álcool metílico: cinco gotas por dois minutos;
 Preparar o corante: três gotas do Giemsa para 2 mL da solução-tampão;
 Cobrir o esfregaço e deixar em repouso por 20 a 30 minutos;
 Escorrer o corante e lavar em água corrente;
 Deixar secar e examinar ao microscópio.
 Leishman:
 Compra-se no comércio o pó, que é uma mistura de azul de metileno e
eosina. Para se preparar o corante, dissolve-se 0,15 g do pó em 100 ml de
álcool metílico. Agitar frequentemente, pelo espaço de três dias, quando
estará pronta para o uso.
Para se corar pelo Leishman, após feito o esfregaço, proceder da seguinte
maneira:
 cobrir o esfregaço com seis ou sete gotas de corante;
 deixar agitar (fixar) por 15 segundos, no máximo;
 adicionar então 12 a 14 gotas de solução-tampão;
 homogeneizar, soprando o corante com a pipeta e deixar em repouso por 20
minutos;
 escorrer o corante e lavar em água corrente;
 deixar secar e examinar ao microscópio.
 O esfregaço corado pelo Leishrnan não necessita de fixação prévia pelo
álcool metílico, pois este já faz parte da fórmula do corante. Em geral, as
lâminas preparadas por esse método não são muito duráveis nem tão
perfeitas quanto pelo método de Giemsa, mas é uma técnica muito utilizada,
em vista da rapidez e facilidade de execução.
Nota: no comércio existe, atualmente, um ótimo corante, já pronto para
uso, denominado Corante Pan-ótico Rápido, que substitui,
perfeitamente, o Giemsa e o Leishman.
Métodos indiretos para diagnósticos
parasitológico
 Inoculação em animais:
 Consiste basicamente em inocular um patógeno, droga, medicamento ou
outroobjeto de estudo em animais utilizados para fins de teste e em
seguida observar as alterações entendendo os mecanismos de ação do
determinado objeto de estudo;
 Até momento este método tem sido utilizado para separar as cepas de T.
Cruzi no sangue dos pacientes em fase aguda por meio de inoculação
geralmente em camundongos ou ratos .
Meios de cultura
 Hemocultura
 consiste basicamente em usar o sangue como um meio de cultura
desses patógenos, para isso é necessária a coleta, separação do
plasma por centrifugação e termo regulação (ambiente propício de
26 a 28°) para observar a presença e ação dos agentes patogênicos.
 Essa técnica pode ser utilizada repetidamente em pacientes
chagásicos submetidos a quimioterapia específica a fim de
acompanhar a evolução e o processo de cura da doença. Além de
complementar os diagnósticos.
Meios de cultura
Meio de cultura LIT (LIVER INFUSION TRIPTOSE) é
propicio para a realização da hemocultura.
 Como preparar:
 Dissolver o infuso do fígado em 200 ml de H2O 
destilada, em banho-maria ou chama de gás;
 Filtrar em algodão ainda quente;
 Recolher o filtrado e juntar com os ingredientes das 
soluções 1 e 2;
 Acertar o pH entre 7,2 e 7,4;
 Acrescentar 100ml (10%) de soro bovino
 Inativar a 68ºC durante uma hora, agitando o meio de 
cinco em cinco minutos;
 Acrescentar 20ml (2%) de hemoglobina;
 Acrescentar antibióticos: Penicilina G potássica: 
200U/ml;
 Estreptomicina: 50 a 100mg/ml;
 Filtrar Zeits e distribuir como desejar.
 Cultura celular In vitro: 
 consiste em propiciar um meio de cultura para que os agentes do 
objeto de estudo se desenvolvam 
 As técnicas de cultura celular in vitro têm sido relatadas com sucesso 
para o isolamento e passagens sucessivas do T.cruzi em laboratório.
 Essa técnica foi mais efetiva do que a hemocultura e inoculação 
intracranial de camundongos no isolamento de tripomastigotas do 
sangue de animais infectados. Todavia, a cultura celular in vitro não é 
aplicada como técnica de rotina para o isolamento do T.cruzi de 
humanos.
Elisa:
 (do inglês “Enzyme Linked ImmunonoSorbent
Assay) se baseia reações antígeno-anticorpo
detectáveis através de reações enzimáticas. A
enzima mais comumente utilizada nestas provas é
a peroxidase.
 O anticorpo estará “marcado”(ligado) a uma enzima.
 É o que permite classificar a amostra como positiva ou negativa.
 Quando há a ligação do anticorpo com a enzima, é adicionada um
substrato o que modificará o cor do meio.
 A cor é que nos dará a positividade ou a negatividade da amostra.
 Para todos os procedimentos é usado as microplacas. Que é uma
placa onde teremos vários poços.
 Já teremos no fundo dos poços anticorpos específicos para a
patologia do paciente.
 Se nessa amostra tiver o antígeno procurado, vai haver a ligação
com os anticorpos que estão no fundo do poço.
 Depois é feto a incubação, ou seja o tempo necessário para a
ligação.
 Adição do anticorpo conjugado que já vem ligado à enzima.
 Ele é extremamente especifico para o antígeno que se está 
buscando.
 Então só irá ocorrer a ligação se lá no fundo for o antígeno 
especifico para aquela patologia.
 É feita a lavagem
 Conformação de “sanduiche”
 É adicionada o substrato para a enzima
 Reação constante, promovendo a alteração de cor constantemente.
 Para que essa alteração de cor não prejudique o teste, é utilizada uma 
substancia de parada, que é um acido. Tradicionalmente usado o ácido 
sulfúrico 
 Daí é feita a leitura (mais confiável com o aparelho).
Ao contrario do ELISA direto, no fundo do 
poço teremos o antígeno para patologia que 
estamos tentando identificar.
 Adição da amostra do paciente.
 Com a adição da amostra pode vim o antígeno também, como é o
ELISA indireto, interessa apenas o anticorpo especifico para a
doença.
 Acontece a ligação do anticorpo que estava na amostra do
paciente com o antígeno que estava no fundo da poço.
 É feita a lavagem.
 Adição do anticorpo conjugado.
 OBS: Esse anticorpo conjugado não é especifico para o antígeno,
ele é específico para o anticorpo. anticorpo anti-anticorpo ( porque
é especifico para se liga na porção Fc do anticopo da mostra.
 Incubação e lavagem
 Adição de substrato
 Mudança de cor constante
 Adição da substancia de parada(H2SO4)
 Observação do resulta através do aparelho ou a “olho nu”.
 Diferente do ELISA direto, a intensão nesse também é localizar os
anticorpos específicos(os anticorpos que estão sendo produzido para
patologia estudada).
 Técnica indireta
 Se houver a presença dos anticorpos na amostra, eles irão se ligar.
 É feita uma lavagem
 Adição do antígeno Biotinilado(atigeno marcado com uma proteína
chamada biotina.
 O Biotinilado tem a capacidade de se ligar apenas ao anticorpo
especifico para a patologia buscada.
 (Aí vocês perguntam porque esse anticorpo(azul) não se ligou ao
Biotinilado.)
 É feita a lavagem
 Adição da enzima (livre)
 Ela(enzima) tem a finidade com a biotina
 Ocorre a ligação
 Adição do substrato
 Mudança de cor constante
 Adição da substancia de parada
* Se esse paciente não tivesse a substancia especifica para a patologia, ou se
tivesse só ligação não-especifica, o antígeno Biotinilado não se ligaria. A
adição da enzima não iria se ligar. E não teria a alteração de cor.
 LEITURA CONTRÁRIA
 Ira ser colocada a amostra do paciente
 Esse teste tenta localizar antígenos(logo, é uma técnica direta)
 Se o paciente tiver antígenos que tenha AFINIDADE com os
anticorpos do fundo da placa, eles vão se ligar.
 O ELISA de competição é um teste que serve para confirmar que
paciente não é positivo.
 É adicionada o antígeno Biotinilado, mas nesse teste ele tem função
diferente.
 O Biotinilado irá competir pelo sitio de ligação
 Mas ele só vai tomar o lugar se o antígeno não for específico.( O que
ocorre é antígenos podem se ligar aos anticorpos pelas chamadas
reações cruzadas)
 Se for o caso nesse teste, o Biotinilado irá conseguir tomar o local dele.
Nesse caso (como já dito antes) a leitura é contrária porque só teremos
alteração de cor da amostra se o Biotinilado se ligar.
 Lavagem
 Adição da enzima
 Adição do substrato
 Com isso eu digo q o paciente é negativo.
 Artigo : Técnica de Xenodiagnóstico na Moléstia de chagas Dr.
Emmanuel Dias (Instituto Oswaldo cruz)
 É um método diagnóstico utilizado para documentar a presença de um
patógeno causador de uma doença infecciosa pela exposição de material
infectado a um vetor e então examiná-lo afim de detectar o micro
organismo responsável;
 Utilizado para diagnóstico da doença de chagas especialmente na sua fase
crônica;
 Utilização de ninfas em determinados estádios de acordo com a espécie
de tripanossoma a ser avaliada.
 O exame:
 Deve ser realizado de 30 a 60 dias após o repasto sanguíneo;
 As fezes e a urina dos triatomíneos devem ser coletadas por compressão
ou dissecação;
 Devem ser colocadas em solução fisiológica;
 Posteriormente serão examinadas ao microscópio em médio aumento para
pesquisas de formas epigmastigotas e tripomastigotas metacíclicas do
protozoário.
 Para garantir que o exame seja adequadamente realizado os insetos
utilizados devem provir de criação de laboratório e isentos de qualquer
infecção de flagelados
 A idade média dos barbeiros (fase de ninfa) é ideal para o exame
 Numero de 3 a 6 exemplares a cada coleta para obtenção de uma melhor
amostra
 Animais vazios ou seja famintos propiciam uma amostra adequada
 O tempo de aplicação é de 15 a 30 minutos ou até os insetosse encherem
de sangue
 Após isso o inseto è colocado em um tubo de ensaio com tampa de rolha
ou de preferência algodão ou gaze presa com elástico
 Podem ser feitos o exame de dejeções a fresco ou dissecação dos insetos
para análise
 Obs: Xenodiagnóstico também pode ser realizado de forma artificial em
particularidades como hospitais que não se admite a entrada de
triatomíneos ou em pacientes hiper-alérgicos que apresentam reações
adversas ou recusa a aplicação do xenodiagnóstico
Em resumo...
 Os métodos indiretos como o xenodiagnóstico e a
hemocultura podem ser utilizados para diagnóstico na fase
crônica da doença de chagas
 A cultura e a inoculação em animais são métodos que mais
convém dentro de Laboratórios. O xenodiagnóstico é método
que mais convém às investigações Epidemiológicas extensas.
OBRIGADO!!!
eduardoalcantara026@gmail.com