Coleta, transporte e armazenamento de amostras

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Profª Jannaina F. Melo Vasco – Prática – Microbiologia clínica 
 
AULA 2. Coleta, transporte e armazenamento de amostras das diferentes áreas 
anatômicas e procedimentos básicos em Microbiologia Clínica 
Cultura pura: crescimento, em meio nutritivo adequado, de um conjunto de células idênticas que pertencem 
a uma única espécie de microrganismo. 
 
1 - Coleta 
Material clínico: Qualquer material clínico pode ser submetido à uma cultura. 
 
Considerações gerais: 
- sempre que possível, colher a amostra antes da antibioticoterapia; 
- instruir claramente o paciente sobre as normas da coleta; 
- colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado (sítio atual de 
infecção); 
- amostra deve ser coletada em quantidade suficiente para realização dos procedimentos requeridos; 
- utilizar sempre métodos assépticos de coleta. Observar esterilização dos materiais utilizados; 
- observar o tempo entre a coleta da amostra e o processamento no laboratório. Geralmente o limite 
máximo de duas horas deve ser estabelecido. Amostras de líquor dever ser imediatamente transportadas e 
analisadas; 
- usar frascos e meios de transporte apropriados; 
- identificar a amostra coletada. Colocar a identificação no frasco da coleta e nunca na tampa ou sobre 
rótulos; 
 Nome e registro do paciente 
 Material colhido 
 Data, hora e quem realizou a coleta 
 
- TODA AMOSTRA DEVE SER TRATADA COMO POTENCIALMENTE PATOGÊNICA. 
 
Critérios para rejeição de amostras 
 
℘℘℘℘ Principais erros de identificação: 
- discrepância entre a identificação da amostra e o pedido médico; 
- falta de identificação da amostra; 
- origem da amostra ou tipo de amostra não identificada; 
- teste a ser realizado não especificado 
 
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℘℘℘℘ Amostras inadequadas: 
- material clínico recebido em solução de fixação (formalina); 
- material conservado inadequadamente com relação à temperatura (urinas colhidas há mais de 24 horas 
guardadas em geladeiras, ou colhidas há mais de duas horas, sem refrigeração); 
- frascos não estéreis; 
- presença de vazamentos, frascos quebrados ou sem tampa, com contaminação na superfície externa; 
- swab único com múltiplas requisições de testes microbiológicos; 
- swab seco; 
- culturas para anaeróbios recebidas em condições não apropriadas. 
 
Quadro1. Amostras que devem ser desencorajadas por fornecerem resultados questionáveis. 
Amostras Comentário 
Escarro com aspecto de saliva Solicitar nova amostra, exceto p/ cultura e pesquisa 
de micobacterias e Legionella 
Aspirado gástrico Processar apenas se for para micobacterias 
Material coletado em formalina Não processar para cultura 
Escarro e urina de 24horas Não processar 
Fezes p/ cultura sem meio conservante e 
armazenadas a temperatura ambiente 
Não processar após 1 hora de coleta 
Ponta de cateter venoso em meio de cultura ou 
meio de transporte 
Não processar 
Ponta de cateter de Foley Não processar 
Urina contaminada com fezes ou fezes 
contaminadas com urina 
Colher nova amostra 
Um “swab” para diversas culturas (era’obios, 
anaeróbios, fungos e micobacterias) 
Solicitar novas amostras de material e verificar com 
o medico assistente a prioridade 
“Swab” de ulcera de decúbito Sugerir biopsia de tecido 
‘Swab” de ferida de queimaduras Sugerir biopsia de tecido 
 
2 - Transporte das amostras 
Considerar os meios de transporte, os frascos adequados para cada tipo de material coletado e a cultura 
solicitada. 
 
Meios de cultura para transporte e conservação: 
℘℘℘℘ Meio de Cary-Blair: Formulado à partir do meio de Stuart – microrganismos patogênicos e outros 
coliformes fecais sobrevivem neste meio 
Utilidade: transporte de material fecal e conservação dos microrganismos 
℘℘℘℘ Salina tamponada: Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável. 
Utilidade: Meio de transporte de fezes. 
℘℘℘℘ Meio Stuart ou Amies: Meio carente em nitrogênio, impedindo a multiplicação de microrganismos mas, 
sua composição nutritiva garante a sobrevivência dos mesmos. 
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Utilidade: transporte de diversos materiais e conservação dos microrganismos. 
 Sem carvão: aeróbios e anaeróbios facultativos 
Com carvão: gonococos, hemófilos e pneumococos 
℘℘℘℘ Ágar Nutriente: Pode ser utilizado para análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo 
preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas 
puras. 
Utilidade: mais freqüente para conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente. 
Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos. 
 
3 - Procedimentos pré-semeadura 
Recebimento de amostras: 
 Verificar a identificação, o volume, as condições de transporte e adequação para realização do 
exame. 
 
Seleção dos meios de cultura: 
 Existem vários meios de cultura disponíveis comercialmente, prontos para uso ou para serem 
preparados no próprio laboratório (apêndice 1). No momento da semeadura, os seguintes itens deverão ser 
observados: 
• Examinar os meios quanto a aparência, validade e ausência de contaminação; 
• Identificar no momento da semeadura os meio individualmente, de acordo com o sistema interno 
de cada laboratório (numero de registro de paciente, data, tipo de amostra); 
• E recomendável não ocultar o nome do meio de cultura e o prazo de validade marcado em cada 
placa ou tubo. 
As bactérias são cultivadas em meios líquidos (caldos) ou sólidos (ágares). Os meio líquidos são 
mais sensíveis para isolamento de pequeno número de microrganismos e o crescimento em meio líquido, 
na grande maioria das vezes, não é quantitativo. Os meios sólidos, menos sensíveis, podem isolar colônias 
de microrganismos para identificação, quantificação e alguns gêneros e espécies podem ser reconhecidos 
com base nas morfologias coloniais. 
 Os meios seletivos são aqueles em que se incorporam substâncias como, agentes 
antimicrobianos. Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de água, em seguida 
deve-se acrescentar o restante da água. Alguns meios devem ser esterilizados e autoclavados, utilizando-
se autoclave por 15 minutos em temperatura de 121ºC. Para tanto, os tubos, frascos, placas e vidrarias 
devem ser estéreis. 
 
Preparo dos materiais clínicos e semeadura inicial: 
1. Amostras recebidas em “swab” 
- Amostras colhidas com “swab” são amplamente utilizadas para a coleta de diversos materiais clínicos, 
mas seu uso deve ser evitado quando outras metodologias puderem ser empregadas (por exemplo, 
aspirados, biópsias e escarificações); 
- Alguns laboratórios optam por colher as amostras em “swab” duplo. Utilizar um para fazer o esfregaço em 
lâmina e outra para colocar no meio de transporte especifico; 
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- Quando somente um “swab” for coletado e for necessário realizar uma bacterioscopia, suspender o “swab” 
em um pequeno volume de solução fisiológica estéril, agitar vigorosamente, comprimir o “swab” na parede 
do tubo e utilizar para suspensão para o preparo de esfregaço e semeadura nos meio adequados. 
- Semear por esgotamento nos meios apropriados; 
- Incubar a 35 +- 1 oC em atmosfera adequada por no mínimo 24 horas. 
 
2. Amostras de aspirados e exsudatos 
- Se a amostra for recebida em seringa, transferi-la para um tubo estéril, homogeneizar, proceder a 
semeadura por esgotamento em meios apropriados e fazer um esfregaço em lâmina. Pode-se também 
semear uma a duas gotas diretamente nos meios e semear por esgotamento; 
- Incubar a 35 +- 1 oC em atmosfera adequada por no mínimo 24 horas. 
 
3. Escarro 
- Selecionar a porção mais purulenta e ou sanguinolenta do escarro; 
- Preparar uma lâmina e corar pela coloração de Grampara avaliar a qualidade da amostra. 
- Semear por esgotamento nos meios apropriados; 
- Incubar a 35 +- 1 oC em atmosfera adequada por no mínimo 24 horas. 
 
4. Líquidos orgânicos (exceto urina e sangue) 
- Após centrifugação (3000 a 5000rpm por 15 min), remover o sobrenadante deixando aproximadamente 
0,5 ml do sedimento; 
- Homogeneizar o sedimento e semear por esgotamento nos meios apropriados; 
- Demarcar na lâmina a área onde o material será depositado. Opcionalmente, adicionar uma segunda gota 
do sedimento na mesma área onde foi colocada a anterior para aumentar a concentração do material; 
- Incubar a 35 +- 1 oC em atmosfera adequada por no mínimo 24 horas. 
 
5. Amostras de urina 
a) Urina de jato médio 
Semeadura em placa: 
- Homogeneizar o material e semear com a alça calibrada (1:1000) sem centrifugar; 
- Semear nos meios apropriados; 
- Incubar a 35 +- 1 oC em atmosfera adequada por 18 a 24 horas; 
- Preparar um esfregaço, depositando 10ul de urina não centrifugada em uma lamina, sem espalhar para 
coloração pelo método de Gram. 
 
6. Fragmentos de biópsia e tecido 
- Transferir a amostra para uma placa estéril e fragmentar com o auxilio de um bisturi; 
- Semear pela técnica de esgotamento os fragmentos nos meios apropriados; 
- Se disponível utilizar triturador de tecido com um volume pequeno de soro fisiológico; 
- Semear 10 ul ou 100 ul em ágar específico; 
- Incubar a 35 +- 1 oC em atmosfera adequada por no mínimo 24 horas; 
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- Retirar um fragmento da amostra e comprimir várias vezes em uma área da lâmina para eventuais 
colorações. 
 
7. Fragmento ósseo 
- Verificar se existe tecido mole, remover e tratar como amostra de tecido; 
- Em caso de fragmento ósseo pequeno transferi-lo para um caldo THIO; 
- Em amostras grandes que não possam ser colocadas no caldo THIO e que tenham sido acondicionadas 
em frasco estéril, adicionar 10-20 ml de caldo THIO ou volume suficiente para que o fragmento esteja 
submerso no meio; 
- Incubar a 35 +- 1 oC em atmosfera adequada por no mínimo 24 horas. 
 
 
���� Controle de qualidade de esterilidade e crescimento: 
- controle de esterilidade: para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote em estufa a 
35ºC (± 1ºC) por 24 horas; 
- controle de crescimento: utilizar cepas ATCC ou cepas 100% positivas para os controles de qualidade 
realizados. 
 
���� Recomendações gerais: 
- evitar o uso de meios vencidos (liofilizados ou prontos para uso). Se utilizar, certificar-se com o controle de 
crescimento; 
- não usar meios prontos para uso que estejam ressecados; 
- observar que alguns inócuos são específicos para alguns meios de cultura; 
- os meios devem ser devidamente identificados com nome, data de preparo, data de validade e tipo de 
armazenamento; 
- os meios devem ser embalados em filme plástico PVC transparente para evitar ressecamento.