6 Leveduras

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Leveduras na fermentaLeveduras na fermentaçção ão 
alcoalcoóólicalica
Profa. Sandra Regina Profa. Sandra Regina CeccatoCeccato--AntoniniAntonini
DTAiSER / CCA / UFSCar DTAiSER / CCA / UFSCar –– Campus Campus de Ararasde Araras
antonini@cca.ufscar.brantonini@cca.ufscar.br
LaboratLaboratóório de microbiologia agrrio de microbiologia agríícola e molecularcola e molecular
 
www.cca.ufscar.br/lamam
As caracterAs caracteríísticas essenciais de um sticas essenciais de um 
processo microbiolprocesso microbiolóógico industrialgico industrial
MICRORGANISMOSMICRORGANISMOS
Vírus
Bactérias
Fungos
Algas
Protozoários
SubstratoSubstrato
Adicionados no 
meio de cultura
RecuperaRecuperaçção e ão e 
PurificaPurificaçção do ão do 
ProdutoProduto
Produtos do 
metabolismo
Célula microbiana
Fração das 
células
RESIDUO RESIDUO 
OU OU 
MATERIAL MATERIAL 
DE DE 
EXCREEXCREÇÇÃOÃO
CaracterCaracteríísticas gerais e sticas gerais e 
identificaidentificaçção de levedurasão de leveduras
CaracterCaracteríísticas gerais das sticas gerais das 
levedurasleveduras
?? Grupo heterogêneoGrupo heterogêneo
?? UnicelularesUnicelulares
?? DiversidadeDiversidade
–– Cor das colôniasCor das colônias
–– TexturaTextura
?? ReproduReproduççãoão
Aspecto colonial de fungos que apresentam crescimento
filamentoso (F) e leveduriforme (L).
Brotamento
Ciclo haplóide
Ciclo diplóide
Ciclo de vida de S. cerevisiae e sua relação com
as condições ambientais
+ ferormônio
Ciclo de vida de S. cerevisiae
Leveduras. Em A, células de leveduras
e de bactérias. Em B, células de 
Saccharomyces cerevisiae, mostrando 
células em brotamento. Em C, 
pseudomicélio de Saccharomyces cerevisiae, 
em meio Corn-meal agar. 
A. B.
C.
A levedura Pichia stipitis, 
fermentadora de xilose, 
durante crescimento 
vegetativo (A), esporos em 
formação (B), e sob limitação 
de carbono (C). Foto Tom 
Kuster.
Leveduras apiculadas
Extrato de malte
Macroscopia
Sedimento
Resíduo
Anel
Ilhota
Película
Microscopia
Forma e tamanho
das células
Microcultivo
Agar fubá
Tween 80
Corn meal agar
Microscopia
Pseudomicélio,
Micélio verdadeiro,
Balistósporos
Clamidósporos
Microscopia
Produção esporos sexuais:
Ascos e ascósporos
Meio de acetato
Gorodkowa
YM
Água de torneira
Outras provas:
-Urease
-Cápsula
-Meio DBB
IDENTIFICAÇÃO GENÉRICA
Auxanograma
Assimilação
Fontes C e N
Zimograma
Fermentação 
Alcoólica de 
açúcares
Meios diferenciais
-meio TTC
-ágar molibdênio
-ágar azul Tripan
-meio de Nickerson
-meio de CGB
Outras provas:
-Crescimento 37ºC
-Produção de 
compostos amilóides
-tubo germinativo
-resistência a
Cicloheximida
-fenol oxidase
IDENTIFICAÇÃO ESPECÍFICA
Teste do DBB. As linhagens CCA 181, 506 e 567 são DBB 
negativas, enquanto a CCA379 é DBB positiva (utilizada como 
controle positivo) – Linhagens basidiomicéticas são DBB+
ESPOROS
SEXUAIS
S. cerevisiae
S. cerevisiae
 
 
 
 
 
Produção
de pseudomicélio
Candida albicans - pseudomicélio
Teste de produção de ácido a partir da glicose em meio carbonato 
de cálcio, por 7-10 dias, a 30º C. 
Para caracterização de linhagens de Dekkera
FERMENTAÇÃO DA GLICOSE
+- +--
 
Carbono Nitrogênio
 
L
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n
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g
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005 - + + + + + + - - - + - + - - - - + - + - 
006 - + + + + + + + + + + + + - + + + - + + - 
007 - + - + + + + - - - + - + - - - - - - + - 
008 - + + - - + + - - + + - + - - - - + - - - 
012 - + + + + + + - - - + - + - - - + + + + - 
022 - + - + - + - - + - + - - - - - - - - nd - 
023 - + + + + + + - - + + - + - - - - + - - - 
027 - + - + - + + - - - + - + - - - - - - nd - 
035 - + - + + - + - + - + - + - - - - - - nd - 
037 - + + - + + - - - + + - + - - - - + - - - 
053 - + + + + + + + - - + - + - - + + + + + +
059 - + - - + + + + - - + - + - - - + + + + +
077 - + + + - + - + + - + + + - - - + + + + +
083 - + + + + + + - - - + - + - - - - + - - - 
115 - + - + + + + - + - + + + - + - - + + + - 
151 - + - - - - + - - - + - - - - - - - + - - 
155 - + - + + + + + - - + + + - - + + + + + +
181 - + - + + + + + + - + + + - + - + + + + - 
209 - + + + + + - - - + + - - - - - + - - - 
373 - + - + + + + - + - + + + - - - + + - + - 
385 - - - - - - + - - - + - + - - - - - - - - 
397 - + - + - + + - - - + - - - - - + + - - - 
447 - + - + + + + - + - + + + - + - + + + + - 
467 - + - + + + + - + - + + + - + - + - + + +
471 - + - + + + + - + - + + + - + - + - + + - 
506 - + - + + + + + + + + + + - + - + + + + - 
540 - + - + nd + + - + - + + + - + - + + + + - 
567 - + - + + + + - + - + + + - + - + + + + - 
593 - + + + + + + - + - + + + - + - + + + + - 
610 - + - - + + + + + - + + + - + - - + + + - 
612 - + - + + + + + + - + + + - + - + + + + - 
 
1 - (+) = positivo; (-) = negativo e (nd) = não determinado; 
Chaves de identificaChaves de identificaççãoão
?? KregerKreger--vanvan RijRij, N.J.W. , N.J.W. TheThe yeastsyeasts. A . A 
taxonomictaxonomic studystudy. . ElsevierElsevier, 1984., 1984.
?? BarnettBarnett, J.A., Payne, R.W., , J.A., Payne, R.W., YarrowYarrow, D. , D. 
YeastsYeasts: : characteristicscharacteristics andand identificationidentification. . 
Cambridge Univ. Cambridge Univ. PressPress, 1990., 1990.
Importância do estudo da Importância do estudo da 
diversidade de leveduras diversidade de leveduras 
na fermentana fermentaçção alcoão alcoóólicalica
http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf
http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf
http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf
http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf
TTéécnicas avancnicas avanççadas no adas no 
estudo da diversidade de estudo da diversidade de 
leveduras em processos leveduras em processos 
fermentativosfermentativos
IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS
como era feita há 20 anoscomo era feita há 20 anos
Morfologia das células e 
colônias;
Características bioquímicas e 
fisiológicas;
Classificação de espécies mas 
não de linhagens.
IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS
como é feita hojecomo é feita hoje
Cariotipagem: análise do DNA 
cromossômico das leveduras.
Técnicas baseadas em PCR (RAPD) e 
RFLP.
Cada linhagem possui um padrão único 
de cromossomos ou bandas de DNA 
(como um código de barras). 
2007 – Anais do XVI Sinaferm
Todos os isolados pertencem à espécie Saccharomyces cerevisiae e 
apresentaram o mesmo cariótipo. No entanto, um dos três tipos morfológicos 
isolados, em cada coleta, apresentou desempenho industrial diferentedos 
demais. Os dados obtidos indicam que a determinação do desempenho 
fermentativo, pelas técnicas utilizadas, além de avaliar a performance industrial 
de cepas de levedura, pode proporcionar a diferenciação final entre cepas S. 
cerevisiae de mesmo cariótipo.
ANDRIETTA, M. G. S. ; ANDRIETTA, Silvio Roberto ; STROPPA, C. T. . Caracterização das 
leveduras floculantes selecionadas em reator tipo torre em uma unidade de fermentação 
alcoólica. In: SINAFERM, 2003, Florianópolis. XIV SINAFERM, 2003.
Região ITS
RAPD
Tabela 1 – Pontuação e limites das faixas de variação dos parâmetros utilizados na classificação da
leveduras (Andrietta et al., 1999). 
Dígito Parâmetro 1 (Alto) 2 (Médio) 3 (Baixo) 
Primeiro Yx/s (gMS/gSubst) > 0,044 0,041 a 0,044 < 0,041
Segundo VCS (gSubst/Lxh) > 5,7 5,2 a 5,7 < 5,2 
Terceiro NCO (%) > 98,5 90 a 98,5 < 90 
Quarto μmax (1/h) > 0,55 0,45 a 0,55 < 0,45 
Quinto PROD (gEt/Lxh) > 2,4 2,2 a 2,4 < 2,2 
Sexto Yp/s (gEt/gSubst) > 0,45 0,45 a 0,42 < 0,42 
 
Metodologia da Capacidade Fermentativa (Andrietta et al., 1999)
Andrietta, S. R.; Migliari, P. C. e Andrietta, M. G. S. (1999), Classificação das 
cepas de leveduras de processos industriais de fermentação alcoólica utilizando 
capacidade fermentativa. STAB – Açúcar, Álcool e Subprodutos, v.17, n.5, p.54-
59.
Tabela 2 - Valores de participação populacional, PP (%); rendimento em células, Yx/s 
(gMS/gSubst); velocidade de consumo de substrato, VCS (gSubst/Lxh); nível de conversão de 
substrato, NCO (%); velocidade específica máxima de crescimento, μmax (1/h); 
produtividade, PROD (gEt/Lxh); rendimento em etanol, Yp/s (gEt/gSubst); grupo de 
desempenho, para as leveduras isoladas. 
Coleta 
(dias/safra) Isolado PP Yx/s VCS NCO μm PROD Yp/s Grupo 
IN 74 100,0 0,0412 5,81 99,65 0,50 2,60 0,4774 211.211
78 0,0412 5,81 99,62 0,51 2,49 0,4579 211.211
79 0,0412 5,80 99,50 0,47 2,51 0,4618 211.211
80 
77,3 
0,0440 5,80 99,50 0,49 2,54 0,4672 211.211
81 0,0410 5,80 99,50 0,48 2,47 0,4540 211.211
82 0,0424 5,80 99,50 0,49 2,53 0,4650 211.211
83 
12,5 
0,0432 5,80 99,50 0,46 2,57 0,4715 211.211
84 0,0422 4,45 76,36 0,46 2,00 0,4878 233.231
85 0,0443 3,92 67,27 0,45 1,86 0,5199 233.231
60 
86* 
10,2 
0,0434 5,80 99,49 0,46 2,55 0,4688 211.211
96 0,0423 5,80 99,50 0,51 2,46 0,4528 211.211
97 0,0419 5,80 99,50 0,48 2,48 0,4555 211.211
98 
55,2 
0,0436 5,80 99,50 0,48 2,45 0,4511 211.211
99 0,0430 4,78 81,94 0,53 2,02 0,4574 233.231
100 0,0433 4,79 82,21 0,55 2,00 0,4513 233.231
101 
29,3 
0,0433 5,80 99,44 0,47 2,44 0,4502 211.211
102 0,0419 5,80 99,50 0,50 2,45 0,4517 211.211
103 0,0435 5,80 99,50 0,49 2,46 0,4539 211.211
120 
104 
15,5 
0,0434 5,80 99,50 0,50 2,46 0,4527 211.211
114 0,0440 3,37 57,85 0,48 1,59 0,5207 233.231
115 0,0440 3,77 64,63 0,50 1,58 0,4598 233.231
116 
43,3 
0,0417 5,79 99,41 0,47 2,52 0,4645 211.211
117 0,0420 5,80 99,50 0,47 2,46 0,4521 211.211
118 0,0411 5,80 99,51 0,48 2,56 0,4702 211.211
119 
31,7 
0,0416 5,80 99,51 0,46 2,53 0,4657 211.211
120 0,0410 5,80 99,50 0,47 2,52 0,4633 211.211
121 0,0420 5,80 99,51 0,46 2,49 0,4577 211.211
180 
122 
25,0 
0,0415 5,80 99,50 0,45 2,50 0,4600 211.211
* Variante morfológico. 
A
N
D
R
IETTA
, M
. G
. S. ; A
N
D
R
IETTA
, Silvio R
oberto ; STR
O
PPA
, C
. T..C
aracterização das leveduras 
floculantes
selecionadas em
 reator tipo torre em
 um
a unidade de ferm
entação alcoólica. In: SIN
A
FER
M
, 
2003, Florianópolis. XIV SIN
A
FER
M
, 2003.
UtilizaUtilizaçção de meios ão de meios 
seletivosseletivos
3 X 109 células de S. cerevisiae / ml
3 X 103 células de leveduras selvagens / ml
1 ml sem diluição
1 ml diluição 10-8
1 ml diluição 10-2
Meio contagem geral
Não seletivo
>>> 300 colônias
Meio contagem geral
Não seletivo
30 colônias
{3 X 109 / 108 } = 30
{3 X 103 / 108 } = < 1
Meio seletivo
{3 X 103 / 102 } = 30
Exemplo: actidione
inibe o crescimento
de S. cerevisiae
Dorna de fermentação
Regra: contar
entre 30 e 300 colônias
MEIO DE CULTURA WLN –Wallerstein Laboratory Nutrient Medium
Diluição
10-10
Sem 
diluição
Sem 
diluição
Para Saccharomyces não-cerevisiae
Para não-Saccharomyces
Para Saccharomyces não-cerevisiaeContagem geral
Sem 
diluição
Tosta, Tosta, C.D.C.D., , CeccatoCeccato--AntoniniAntonini, S.R. Eficiência de meios seletivos , S.R. Eficiência de meios seletivos 
no monitoramento de leveduras na fermentano monitoramento de leveduras na fermentaçção alcoão alcoóólica lica 
atestada por PCR. In: XV Simpatestada por PCR. In: XV Simpóósio Nacional de sio Nacional de BioprocessosBioprocessos, , 
2005, Recife2005, Recife--PE (Anais).PE (Anais).
?? Analisou a eficiência de três meios seletivos (Analisou a eficiência de três meios seletivos (AgarAgar--lisinalisina, , 
LWYM e WLD) no isolamento de leveduras selvagens LWYM e WLD) no isolamento de leveduras selvagens 
atravatravéés dos testes de taxonomia cls dos testes de taxonomia cláássica e de PCR.ssica e de PCR.
?? Linhagens isoladas do vinho e fermento a partir dos Linhagens isoladas do vinho e fermento a partir dos 
meios seletivos pertenceram exclusivamente a gêneros meios seletivos pertenceram exclusivamente a gêneros 
não não SaccharomycesSaccharomyces, com bandas de DNA da região ITS , com bandas de DNA da região ITS 
entre 420 e 550 entre 420 e 550 bpbp..
?? Linhagens de Linhagens de SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae, isoladas , isoladas 
exclusivamente de WLN, apresentaram ITS acima de exclusivamente de WLN, apresentaram ITS acima de 
800 800 bpbp, caracter, caracteríístico desta e da demais espstico desta e da demais espéécies do cies do 
grupo grupo SaccharomycesSaccharomyces sensusensu strictostricto..
?? Os meios seletivos testados permitiram a distinOs meios seletivos testados permitiram a distinçção entre ão entre 
linhagens selvagens e do processo.linhagens selvagens e do processo.
S. cerevisiae
Colônias 
rugosas
= S. cerevisiae
Colônias
mucosas
Oliveira, M.C.F.L., Silva, R.B.O. Biotipo
Saccharomyces cerevisiae em cadeias 
multicelulares ramificadas na fermentação 
contínua. In: XVII Congresso Brasileiro de 
Microbiologia, 1993, Santos-SP.
Identificaram uma levedura selvagem com as 
mesmas características, apresentando elevado 
poder competitivo em relação à levedura usual do 
processo e às demais leveduras selvagens, 
substituindo em cerca de 50% o fermento de 
partida.
Ceccato-Antonini, S.R., Parazzi, C. Isolamento 
de levedura selvagem floculante e efeitos da 
contaminação em processo de fermentação 
etanólica contínua. In: VI Congresso Nacional 
da STAB, 1996, Maceió-AL.
Verificaram uma proporção de 1:1 entre 
leveduras rugosas e não-rugosas no fermento e 
no vinho, ocasionando uma queda de 10% no 
rendimento fermentativo e 18% na produção de 
álcool. Para a retomada do rendimento a valores 
~ 89,5%, o fermento teve que ser substituído. Os 
focos de contaminação eram a água de diluição 
e o melaço.
A pesquisadora Silene C. L. Paulillo (Fermentec) 
apresentou os resultados de um trabalho realizado 
durante 3 safras consecutivas (2002, 2003 e 2004) 
sobre as características de 300 leveduras selvagens que 
contaminaram 46 destilarias. As leveduras identificadas 
pela cariotipagem formavam colônias de borda lisa 
(57%) ou rugosa (43%). Todas as leveduras de colônias 
com borda rugosa apresentaram problemas na 
fermentação como: espuma em excesso, floculação e/ou 
sobra de açúcar no vinho. Entre as leveduras de 
colônias de borda lisa, 65% apresentaram pelo menos 
um dos problemas citados.As leveduras com estas 
características foram submetidas a mais dois ciclos 
fermentativos com mosto contaminado por lactobacilos 
(~1 x 107 bactérias/mL).Nestas condições, as leveduras contaminantes flocularam intensamente (como 
indicado pelas setas amarelas), enquanto que, a linhagem PE-2 (referência), não 
foi afetada. Estes resultados mostraram a importância do uso de leveduras 
selecionadas e quanto se pode perder com leveduras contaminantes.
Alguns resultados de Alguns resultados de 
monitoramento utilizando monitoramento utilizando 
meios seletivosmeios seletivos
Fermento da cuba
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
1,00E+10
1,00E+12
1,00E+14
22-jun
29-jun
6-jul
13-jul
20-jul
27-jul
3-ago
10-ago
17-ago
24-ago
31-ago
7-set
14-set
21-set
Data da coleta
U
F
C
 
o
u
 
c
é
l
u
l
a
s
 
v
i
á
v
e
i
s
/
m
L
Não Sacch Não Sacch. cerev.
Leveduras totais Células viáveis
Bactérias totais
Safra 2005/2006
Vinho dorna 1
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
1,00E+10
1,00E+12
1,00E+14
22-jun
29-jun
6-jul
13-jul
20-jul
27-jul
3-ago
10-ago
17-ago
24-ago
31-ago
7-set
14-set
21-set
Data da coleta
U
F
C
 
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c
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l
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v
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á
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L
Não Sacch Não Sacch. cerev.
Leveduras totais Células viáveis
Bactérias totais
Safra 2005/2006
Mosto
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
22-jun
29-jun
6-jul
13-jul
20-jul
27-jul
3-ago
10-ago
17-ago
24-ago
31-ago
7-set
14-set
21-set
Data da coleta
U
F
C
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m
L
Não Sacch Não Sacch. cerev.
Leveduras totais Bactérias totais
Safra 2005/2006
OBRIGADA !OBRIGADA !
	Leveduras na fermentação alcoólica
	Utilização de meios �seletivos
	Tosta, C.D., Ceccato-Antonini, S.R. Eficiência de meios seletivos no monitoramento de leveduras na fermentação alcoólica atest
	Alguns resultados de monitoramento utilizando meios seletivos
	OBRIGADA !