Controle de Qualidade II

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Controle de Qualidade
de Plantas Medicinais e Fitoterápicos: 
enfoque no Sistema de CLAE (parte II)
Profa. Dra. Luzia Kalyne A M Leal
Plantas Medicinais e Fitoterápicos: 
Controle de Qualidade
•Materiais 
estranhos
•Cinzas 
•Microbiologia
• Macro e 
Microcospia
da planta
• Perfil 
fitoquímico
• Identificar e Quantificar 
Marcadore(s) 
Autenticidade
Pureza
e Integ.
Análise
marcador
Laudo
técnico
Análise Interdisciplinar
CONTROLE DE QUALIDADE:
• Método Analítico validado* 
• Amostragem
• Preparação e análise da Amostra
* ANVISA RE 899, 2003
VALIDAÇÃO
United State Pharmacopoeia: Validação é o
processo que fornece uma evidência
documentada de que o método realiza aquilo
para o qual é indicado para fazer.
ANVISA: A validação deve garantir, por meio
de estudos experimentais, que o método
atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados.
VALIDAÇÃO (cont.)
• Deve ser utilizado substância de
referência oficial (Farmacopéia Brasileira e
códigos autorizados) mas, se inexistente
utilizar padrões com identidade e teor
devidamente comprovados.
• Metodologia analítica oficial
RESOLUÇÃO 899 (ANVISA, 2003)
Validação: classificação dos testes - finalidade
RESOLUÇÃO 899 (ANVISA, 2003)
Categoria Finalidade
I Testes quantitativos para determinação
do princípio ativo em produtos
farmacêuticos ou matérias-primas
II Testes quant. ou ensaio limite para 
impurezas e produtos de degradação 
em prod. farm. e matérias-primas
III Testes de performance (ex.: 
dissolução e liberação do ativo)
IV Testes de identificação
Validação: parâmetros necessários para 
Categoria I
RESOLUÇÃO 899 (ANVISA, 2003)
• Especificidade
• Linearidade
• Intervalo
• Precisão
• Exatidão
• Robustez
Validação: parâmetros necessários para 
Categoria I
RESOLUÇÃO 899 (ANVISA, 2003)
• Especificidade
Medir exatamente um composto em presença de 
outros, como impurezas, produtos de degradação
e componentes da matriz.
Métodos Cromatográficos: Pureza dos picos
• Linearidade
Mostrar que os resultados obtidos são diretamente 
proporcionais à concentração do analito na amostra, 
dentro de um intervalo.
• Intervalo
Validação: parâmetros para Categoria I (cont.)
*RE 899 (ANVISA, 2003): DPR ≤ 5%
• Precisão*
Repetibilidade: mesmo analista e mesma instrumentação
realizar 9 determinações (conc. Baixa, média e alta) 
com 3 réplicas ou 6 determinações a 100% conc. teste
Intermediária: 
- Resultados: dias diferentes, com analistas diferentes
e/ou equipamentos diferentes
Reprodutibilidade: precisão interlaboratorial
Validação: parâmetros para Categoria I (cont.)
RE 899 (ANVISA, 2003)
• Exatidão
Proximidade dos resultados obtidos pelo método em 
estudo em relação ao valor verdadeiro.
• Robustez
É a medida da capacidade de um método em resistir a 
pequenas variações dos parâmetros analíticos (ex.: 
pH, composição da fase móvel etc)
CONTROLE DE QUALIDADE:
• Método Analítico validado* 
• Amostragem
• Preparação e análise da Amostra
* ANVISA RE 899, 2003
CONTROLE DE QUALIDADE DE PLANTAS 
MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS:
AMOSTRAGEM: retirada representativa de 
material para análise 
• A análise de uma amostra representará a 
qualidade de todo lote produzido
• Corresponde a primeira etapa do Controle 
de Qualidade e pode representar até 30 % 
do erro de um processo
Farmacopéia Brasileira, IV (1988)
Técnica de Amostragem: número de 
embalagens
N° Embalagens N° a serem 
amostradas
1 a 10 1 a 3
10 a 25 3 a 5
25 a 50 4 a 6
50 a 75 6 a 8
75 a 100 8 a 10
> 100 5% (mínino 10)
CONTROLE DE QUALIDADE:
• Método Analítico validado
•Amostragem
• Preparação de Amostras
• Realizar análise
 Ponto crítico da análise
 Método - características: 
- Rápido preferencialmente
- Reprodutivo
Preparação de Amostras
Matriz: fluidos biológicos, extratos, 
homogenato de tecido etc
Analito (marcador)
Preparação de Amostras
 Características da matriz e do analito
• Tipo de tratamento das amostras 
antes da análise
 Extração líquido-líquido: distribuição do 
analito em dois líquidos imiscíveis
 Extração em fase sólida: adsorção seletiva 
do analito em materiais sólidos e posterior 
eluição com solvente
 Outras
• Métodos de Preparação de Amostras
 Extração líquido-líquido: distribuição do 
analito em dois líquidos imiscíveis
• Método de Preparação de Amostras
matrix
analito
-
Análise qualitativa 
e quantitativa
CONTROLE DE QUALIDADE:
• Amostragem
• Método Analítico validado
• Preparação de Amostras
Realizar análises quali e quantitativa
• Método: 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-CLAE
Avaliação quali e quantitativa de princípios 
ativos, classe química ou marcadores
• Condições analíticas
CONDIÇÕES ANALÍTICAS: 
• Coluna e pré-coluna
• Fase móvel
• Volume de injeção
• Detecção e condições
• Eluição
• Temperatura
• Fluxo
Exemplos de Amostras submetidas à 
análise em sistema de
Cromatografia Líquida de Alta 
Eficiência – CLAE para identificação e 
quantificação de marcador(es)
Guaraná - Paulinia cupana H.B.K.
• Parte utilizada: semente
• Constituintes químicos: cafeína 
(3,6 – 5,8%), teofilina e teobromina. 
Taninos (12%).
• Farmacologia
Estimulante SNC, diminui apetite, 
antiagregante plaquetário in vitro
• Etnofarmacologia: fadiga, afrodisíaco,
outros
(Pó da semente-2g)
Extração/ Filtra
NH4OH
HCl
Fração Orgânica Fração Aquosa/pH 7,0
CLAE
Preparação da Amostra para análise 
quali e quantitativa de cumarina no guaraná
Fase móvel: água: MeOH: ác.acético 
Fluxo: 0,8mL/min.
Eluição: isocrática
Temp.: 45°C
 = 275nm
Calibração: Cafeína
Dosagem de cafeína por HPLC-UV 
(United State Pharmacopoeia- USP 23)
Cafeína: 0,23  0,012 mg/mL
Dosagem de cafeína no pó de 
Guaraná por HPLC-UV
Amburana cearensis (Fabaceae)
Química de A. cearensis
Cumarina
Ácido Vanilico
Ácido Protecatecuíco
-sitosterol 
Campferol
Amburosidio A e B 
Outros
• Casca do caule
Canuto and Silveira, 2006; Bravo, 1999
Cumarina - bioatividade
• Antiinflamatoria
• Antinociceptivo
• Broncodilatador
Casley-Smith et al., 1993; , Leal et al., 1997; 2003
O O
Amburoside A - bioatividade
• Antiinflamatório
• Antimalárico
• Antioxidante
Bravo et al., 1999; Leal et al., 2005; 2006
Material
• Padrões
- CM: Fluka (Buchs, Switzerland)
- AMB from A. cearenis – Depto. Química, 
UFC
• Planta
- Quixeramobim, CE, Brasil
- Herbario P. Bezerra (Exsicata No. 837)
• X terra C18 column (250x4.6 mm, 5u)
• Fase móvel
Condições cromatográficas 
• Eluição: Gradiente
• Fluxo (1.8 mL)
• Detecção: 254 nm
• Temperatura: 40 °C
• Especificidade
• Linearidade
• Exatidão
• Precisão
• Robustez
CLAE-Validação do método para análise 
de produtos derivados do cumaru
ANVISA, RDC 899/2003; LEAL et al., 2007
• Categoria I
• Análise estatística
Curva de calibração do amburosídio A 
obtida em sistema CLAE: LINEARIDADE
y = 1E+07x + 3652,3
R² = 0,9983
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
0,0000 0,0100 0,0200 0,0300 0,0400 0,0500 0,0600
 Curva de calibração representa a relação entre a
resposta do instrumento e a concentração conhecida do
analito
Considerações Finais
O CQ de matérias-primas vegetais e
fitoterápicos deve dá-se em todas as etapas
de produção, desde o plantio até o produto
final. Para isso, é necessário a realização de
amostragem adequada, emprego de métodos
analíticos validados.
IMPORTANTE!!!!