AULA 7 cinética enzimática.

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Aula 
Cinética enzimática
Estudo da velocidade da reação enzimática e como 
ela se altera em função de diferentes parâmetros
Disciplina Biorreatores
Profa. Annamaria Dória
• Michaelis-Menten (1913):
• A enzima se complexa reversivelmente com o substrato para
formar ES:
1k
2k
3k
4k
PE 
ES
SE 
Velocidade de uma reação enzimática
Complexo enzima-
substrato (ES)
A teoria de Michaelis-Menten é uma simplificação.
A formação do complexo ES engloba um conjunto de
intermediários:
+
E
S
ES
+
E
P
ES’ EP’ EP
ES da teoria de M-M
• Michaelis-Menten (1913):
• Considerando velocidades iniciais, a concentração de produto
neste caso pode ser considerada desprezível:
1k
2k
3k
4k
PE ESSE 
1k
2k
3k
PE ESSE 
Velocidade de uma reação enzimática
Complexo enzima-
substrato (ES)
k4
• Michaelis-Menten (1913):
Velocidade de uma reação enzimática
Complexo enzima-
substrato (ES)
Após a mistura da enzima com o substrato ocorre a formação do complexo ES, que
permanece numa concentração constante (variação zero!):
*Formação de ES = consumo de ES
𝑑[𝐸𝑆]
𝑑𝑡
≈ 0
1k
2k
3k
PE ESSE 
Velocidade de uma reação enzimática
𝑑[𝐸𝑆]
𝑑𝑡
= 𝑘1 𝐸 𝑆 − 𝑘2 𝐸𝑆 − 𝑘3 𝐸𝑆 = 0
𝑘2 + 𝑘3
𝑘1
=
𝐸 𝑆
𝐸𝑆
𝑘2 + 𝑘3
𝑘1
= 𝑘𝑀 [𝐸𝑆] =
𝐸 𝑆
𝑘𝑚
kM é definido como a constante de Michaelis Menten
e é um valor característico para um dado processo
enzimático.
Assim:
𝑑[𝐸𝑆]
𝑑𝑡
≈ 0
1k
2k
3k
PE ESSE 
• Conceito de velocidade relativa (v/vmáx):
O total de enzima participando da reação [Eo] é igual à soma da enzima livre [E] com
a enzima em forma de complexo [ES], ou seja:
Visto K3 ser bem menor que K1 e K2, a transformação de ES em E + P será a etapa
limitante do processo, ou seja:
Se toda a enzima estiver participando da reação, então a velocidade de reação estará
no seu máximo, ou seja:
Então, tem-se que a velocidade relativa v/vmáx:
(velocidade em função do complexo ES, não mensurável )
     ESEE0 
 ESKv 3
 03max EKv 
 
 
 
   ESE
ES
[Eo]
[ES]
v
v
03
3
max 

Ek
ESk
Total de enzima
Substituindo:
temos:
Logo:  Equação de Michaelis-Menten
 
    [S]Km
[S]
Km
[E][S]
[E]
Km
[E][S]
v
v
max 





ESE
ES
 
Km
[E].[S]
ES 
[S]Km
[S]
vv max


(Equação encontrada anteriormente)
Km é chamada de constante de Michaelis, ou,
constante de afinidade, pois, é uma medida da
afinidade da enzima por seu substrato
Exercícios
 
 SK
SV
V
M
máx

0
Exercícios
 
 
   
   
 
 
 min/10.67,2
/10.150
.min/10.400
/10.50/10.100
/10.50.min/10.8
6
0
6
212
0
66
66
0
0
molV
Lmol
Lmol
V
LmolLmol
Lmolmol
V
SK
SV
V
M
máx











Vídeos 
DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS 
VMAX E KM
Na prática é muito difícil estimar Vmax com precisão a partir de 
gráficos, isto implica em erros, também na determinação de Km, 
que depende da determinação de Vmax
Existem maneiras práticas de se obter estas constantes, seguindo 
a técnica de linearização da equação.
O método mais comumente utilizado é através da equação de 
Lineweaver – Burk, entretanto temos também os métodos de 
Eadie-Hanes e o método de Hofstee.
13
1) Equação de Lineweaver-Burk
Inversão e posterior rearranjo dos termos da equação
maxmax v
1
]S[
1
.
v
Km
v
1

maxmax
1
.
V
x
V
Km
y 
[S]Km
[S]
vv max


bxay  .a
b
b
a
14
1) Equação de Lineweaver-Burk
Inversão e posterior rearranjo dos termos da equação
maxmax v
1
]S[
1
.
v
Km
v
1

maxmax
1
.
V
x
V
Km
y 
[S]Km
[S]
vv max


bxay  .a
b
b
a
Método de Eadie-Hanes
Multiplica a linearização de Lineweaver-Burk por [S]
1
𝑣
=
𝑘𝑀
𝑣𝑚𝑎𝑥
1
𝑆
+
1
𝑣𝑚𝑎𝑥
𝑆
[𝑆]
𝑣
=
𝑘𝑀
𝑣𝑚𝑎𝑥
+
1
𝑣𝑚𝑎𝑥
[𝑆]
𝑦 =
𝑘𝑀
𝑣𝑚𝑎𝑥
+
1
𝑣𝑚𝑎𝑥
𝑥 bxay  .
Método de Hofstee
Multiplica a linearização de Lineweaver-Burk por v(vmax/kM)
1
𝑣
=
𝑘𝑀
𝑣𝑚𝑎𝑥
1
𝑆
+
1
𝑣𝑚𝑎𝑥
𝑣
𝑣𝑚𝑎𝑥
𝑘𝑀
𝑣 = −𝑘𝑀
𝑣
𝑆
+ 𝑣𝑚𝑎𝑥
𝑦 = −𝑘𝑀𝑥 + 𝑣𝑚𝑎𝑥 bxay  .
17
Método de Lineweaver-Burk
 
 
L
g
K
V
K
hL
g
V
V
SV
VSV
K
V
m
máx
m
máx
máx
máxmáx
m
622,0228,0
73,23668,0
1
Portanto,
3668,0
1
228,0
1
111
0
0





y = 0,228x + 0,3668
R
2
 = 0,9991
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 1 2 3 4 5
1/[S] (L/g)
1/V
o 
(L
.h
/g
)
18
Método de Lineweaver-Burk
 
 
L
g
K
V
K
hL
g
V
V
SV
VSV
K
V
m
máx
m
máx
máx
máxmáx
m
622,0228,0
73,23668,0
1
Portanto,
3668,0
1
228,0
1
111
0
0





y = 0,228x + 0,3668
R
2
 = 0,9991
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 1 2 3 4 5
1/[S] (L/g)
1/V
o 
(L
.h
/g
)
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Método de Eadie-Hanes
   
   
L
g
K
V
K
hL
g
V
V
S
V
S
S
VV
K
V
S
m
máx
m
máx
máx
máxmáx
m
672,02419,0
78,23595,0
1
Portanto,
3595,02419,0
1
0
0





y = 0,3595x + 0,2419
R
2
 = 0,9993
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 2 4 6 8
[S] (g/L)
[S
]/V
o 
(h
)
20
Método de Eadie-Hanes
   
   
L
g
K
V
K
hL
g
V
V
S
V
S
S
VV
K
V
S
m
máx
m
máx
máx
máxmáx
m
672,02419,0
78,23595,0
1
Portanto,
3595,02419,0
1
0
0





y = 0,3595x + 0,2419
R
2
 = 0,9993
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 2 4 6 8
[S] (g/L)
[S
]/V
o 
(h
)
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Método de Hofstee
5957,15957,1
3638,4
Portanto,
3638,45957,1




KmKm
v
S
v
v
v
S
v
Kmv
máx
máx
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Método de Hofstee
5957,15957,1
3638,4
Portanto,
3638,45957,1




KmKm
v
S
v
v
v
S
v
Kmv
máx
máx
Método de Lineweaver-Burk - exemplo
Para uma enzima (com concentração de 5µM), as seguintes velocidades iniciais
foram determinadas como função da concentração de substrato:
Substrato (mM) V0 (mM.s
-1)
0,02 10,83
0,04 18,57
0,07 26,76
0,1 32,50
0,15 39,00
0,2 43,33
0,3 48,75
0,5 54,17
0,7 56,88
A partir dos dados determine:
(a) O gráfico de Michaelis Menten para essa enzima
(b) O gráfico de Lineweaver Burk para essa enzima
(c) Os valores de kM e vmax para essa enzima
0
10
20
30
40
50
60
0 0,2 0,4 0,6 0,8
v0
 (
m
M
/s
)
[S] (mM)
a)
[S] v 1/[S] 1/v
0,02 10,83 50,0 0,092
0,04 18,57 25,0 0,054
0,07 26,76 14,3 0,037
0,1 32,5 10,0 0,031
0,15 39 6,7 0,026
0,2 43,33 5,0 0,023
0,3 48,75 3,3 0,021
0,5 54,17 2,0 0,018
0,7 56,88 1,4 0,018
Dados Calculados
𝑚 =
∆𝑦
∆𝑥
=
(0,018 − 0,092)
(1,4 − 50)
= 0,00154
b)
y = 0,0015x + 0,0154
R² = 1
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0
1
/v
0
 (
m
M
-1
.s
)
1/S (mM-1)
c)
y = 0,0015x + 0,0154
R² = 1
0,000
0,050
0,100
0,0 20,0 40,0 60,0
1
/v
0
 (
m
M
-1
.s
)
1/S (mM-1)
1
𝑣
=
𝑘𝑀
𝑣𝑚𝑎𝑥
1𝑆
+
1
𝑣𝑚𝑎𝑥
1
𝑣𝑚𝑎𝑥
= 0,0154
𝑣𝑚𝑎𝑥 = 64,93 𝑚𝑀𝑠
−1
𝑘𝑀
𝑣𝑚𝑎𝑥
= 0,0015
𝑘𝑀 = 0,097𝑚𝑀