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Aula 18   Aula Processos de Separação e Purificação do Produto

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de microrganismos perigosos em sistema fechado;
 Inexistência de custos com auxiliares de filtração, membranas e produtos
químicos
Centrifugação
Princípio de separação: diferença de densidade (também o tamanho de partícula e viscosidade)
Método que acelera o processo de sedimentação por ação de um campo gravitacional centrifugo
Baseia-se na diferença de densidade entre a célula e o meio líquido, na viscosidade do meio líquido, 
na força motriz e a distância radial desde o centro da centrifuga até a célula e no diâmetro da 
partícula.
Centrifugação
Aplica-se em suspensões de no máximo 30 g/L de 
células
• Podem operar sob refrigeração 
• (13.000 a 17.000 x g)
• Capacidade limitada de volume
Centrífuga tubular
• Atuam em valores menores de centrifugação (5.000 a 
15.000 x g)
• Permite processamento contínuo 
• Reduzem o tempo necessário para centrifugação
Aplica-se em suspensões de no 
máximo 250 g/L de células
Centrífuga de disco
Etapas de um 
Processo de 
Purificação
• Tipo de microrganismo
• Tamanho da célula;
• Tolerância a tensões de cisalhamento;
• Necessidade de controle de temperatura;
• Gasto de energia;
 Aplicados após a separação e lavagem das células;
 Produtos associados às células (intracelulares) requerem o rompimento ou a permeabilização.
 Deve-se considerar alguns fatores:
Rompimento de células microbianas
 O equipamento de rompimento é selecionado com base no tipo de microrganismo, pois cada um
apresenta uma resistência específica ao rompimento.
 A escolha da técnica de rompimento determina o tamanho dos fragmentos celulares, que por sua
vez irão influenciar nas operações utilizadas para sua separação.
 A separação dos fragmentos celulares em solução é iniciada assim que as células foram
rompidas.
 Como resultado desta etapa o produto estará em uma solução com proteínas e outros
componentes solúveis.
Rompimento de células microbianas
As etapas até o término da fermentação influenciam o rompimento, ou seja, a susceptibilidade
ao rompimento varia:
de um organismo para outro
Ex. C. utilis é mais difícil de romper que S. cereviseae (tanto em alta pressão como em moinho de bolas)
com o estado fisiológico do organismo
Ex. - células crescidas em meio complexo são mais resistentes que as crescidas em meio simples
Métodos de Rompimento Celular
Parede Celular
Mecânicos Homogeneização a alta pressão
Agitação em moinho de bolas
Ultrassom (?)
Não Mecânicos Choque osmótico
Congelamento/descongelamento
Aquecimento
Secagem
Químicos Álcalis Ácidos
Solventes Detergentes
Enzimáticos Lise enzimática
Métodos de Rompimento Celular
Mecânico - Homogeneizador a alta pressão
Este tipo de rompimento provoca aumento
da temperatura do meio, por isso necessita
de sistema de refrigeração
Constituído por pistões projetados para a aplicação de altas pressões, forçando a passagem da
suspensão celular por um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície em uma câmara
de baixa pressão.
A redução instantânea da pressão
associada ao impacto provoca rompimento
celular sem danificar as
biomoléculas.
A quantidade de células rompidas é
proporcional à pressão empregada
Mecânico - Homogeneizador a alta pressão
O desempenho pode ser afetado por:
• Pressão de operação;
• Velocidade de alimentação;
• Temperatura;
• Estado fisiológico do microrganismo;
• Condições de cultivo;
• Tipo de célula e sua concentração.
 tamanho das células (maior => rompimento mais fácil)
 pressão (maior => maior eficiência)
Leveduras rompidas em homogeneizador de alta pressão
Mecânico – Moinho de Bolas
• Consiste na passagem da suspensão celular por uma câmara de trituração (vertical
ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitação e preenchida com esferas
de vidro.
• O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada pelas esferas de
vidro contra a parede celular das células.
Mecânico – Ultrassom
• O rompimento ocorre quando ondas sonoras
de altíssima frequência, são convertidas em
vibrações em um meio líquido e causam o
fenômeno de cavitação (isto é, áreas de vácuo
e compressão que se revezam).
• Com o tempo e as vibrações, as bolhas entram
em colapso, gerando uma onda de choques
que circundam pelo meio líquido, produzindo
uma tensão de cisalhamento.
• Deve-se controlar a temperatura
• Escala de laboratório (inviável em grande
escala)
Rompimentos Mecânicos
• Desvantagens:
• As elevadas forças de cisalhamento provocadas pelos rompimentos mecânicos podem destruir
organelas celulares e desnaturar enzimas;
• Com o rompimento integral das células todo o conteúdo intracelular, incluindo ácidos nucléicos,
organelas e fragmentos celulares é liberado junto com a molécula-alvo, sendo que o
homogeneizado celular pode conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.
As células recolhidas são ressuspensas em solução
tamponada contendo 20% (m/v) de sacarose.
Após equilíbrio (~30 minutos) centrifuga-se novamente e
ressuspende-se o pellet em água destilada a 4 oC.
Mesmo não rompendo integralmente a célula, propicia
permeabilização seletiva, permitindo a saída da molécula
alvo.
Não-mecânico – Choque osmótico
Consiste em ciclos de congelamento e descongelamento, em velocidade e temperaturas adequadas.
A ruptura total ou parcial da parede celular se dá pela ação dos cristais de água formados (cristais de
gelo que perfuram a célula ou a lesionam).
Os fatores de importância a se considerar são: tipo de célula, sua idade, temperatura final de
congelamento e velocidades de congelamento e aquecimento.
 Método demorado e de difícil implantação em grande escala
 Enzimas sensíveis ao congelamento podem ser inativadas
Não-mecânico – Congelamento/Descongelamento
Enzimático - Lise enzimática
 As enzimas são capazes de hidrolisar paredes celulares de células microbianas.
 Quando uma certa quantidade de parede é removida, a pressão osmótica interna rompe a
membrana citoplasmática, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado para o meio
externo.
 As paredes celulares de leveduras possuem duas camadas principias, sendo uma camada externa
do complexo proteina-manana e uma interna, de glucana. O sistema enzimático para o seu
rompimento é composto, portanto, de diferentes enzimas como glucanases, proteases e
mananases.
Bactérias gram negativas e gram positivas apresentam paredes celulares com composição
diferentes, o que implica a necessidade de enzimas diferenciadas no processo.
As principais enzimas bacteriolíticas são: glicosidases, acetilmuramilalanina amidases,
neuroaminidase, endopeptidades e proteases.
Métodos enzimáticos de rompimento de células são adequados para a recuperação de
biomoléculas sensíveis à tensão de cisalhamento ou pressão de trabalho, geradas pelos métodos
mecânicos.
Enzimático - Lise enzimática
 Vantagens:
Facilidade do controle de pH e temperatura, baixo investimento de capital, alta
especificidade e possibilidade de associação com métodos mecânicos ou não
mecânicos.
 Desvantagens: alto custo das enzimas e variação da eficiência da lise
enzimática em função do estado fisiológico do microrganismo.
Fatores que devem ser considerados:
- Presença de inibidores
- Possibilidade de reciclo da enzima
Enzimático - Lise enzimática
Fornecimento 
de oxigênio
Fornecimento de oxigênio
 Os bioprocessos podem ser desenvolvidos com e sem aeração.
 Aeração natural ou forçada.
 Aeração natural  o oxigênio necessário ao cultivo provém do ar ambiente
 Ex: grande parte dos processos em superfície e em fermentação no estado sólido.
 O oxigênio é pouco solúvel em água  torna-se impossível fornecer

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