IMUNOLOGIA

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IMUNOLOGIA
Especificidade é capacidade de conhecer algo sem confundir com outra coisa qualquer por mais parecido que seja, por exemplo, o anticorpo seja altamente especifico para o seu antígeno. Sensibilidade é a capacidade de determinar uma substancia, mesmo que a sua concentração seja muito baixa. A gente espera que os ensaios toxicológicos que tem muita sensibilidade, por exemplo se há 6 meses você usou droga, detecta, mesmo se usou quase nada, ele consegue reconhecer mesmo que em pequena quantidade. 
O conceito aplicado em imuno-ensaio é diferente, a gente diz que um teste é especifico quando ele consegue atuar melhor nas triagens, que ele consegue me dizer quem não tem a doença, enquanto que os testes mais sensíveis são mais utilizados nas confirmações, que com certeza tem a doença; 
O problema é que uma vez ou outra pode liberar resultados falsos positivos, se for negativo à triagem, eu tenho certeza que não tem a doença, mas se for positivo eu preciso fazer uma confirmação, na triagem o que esperamos encontrar é o verdadeiro negativo, o problema dos testes confirmatórios é que eles podem liberar uma vez ou outra um resultado falso positivo, na triagem o que eu espero encontrar é o verdadeiro negativo... 
Imagina que Zezinho, vai pro laboratório e pede um teste pra detecção de vírus HIV, uma triagem, se der negativa, ele n precisa fazer mais nada, porque ela confirma um resultado negativo, se a triagem é negativa, eu confio, se a triagem o resultado for positivo eu não posso dizer que ele tem a doença, preciso de uma confirmação porque a triagem pode dar um falso positivo, que é um efeito colateral da triagem, a confirmação é o oposto, se for positivo, tem a doença, a gente confia. A gente tem que fazer primeiro a triagem, depois uma confirmação, porque as triagens são mais especificas, e a confirmação é mais sensível. 
VALOR PREDITIVO POSITIVO, E VALOR PREDITIVO NEGATIVO.
Preditivo tem haver com prever, o positivo é a probabilidade de ele ser positivo, resultado ser verdadeiro. Negativo, probabilidade do resultado negativo, ser verdadeiro. VPP E VPN.
O calculo dos valores preditivos positivos e negativos se dá se dá através do teste dos imuno ensaio em soro controle, exemplo imagine que você é um dos biomédicos relacionados ao desenvolvimento de um diagnostico da ZIKA, do zika vírus, pra fazer avaliação do teste, se é melhor aplicado em triagem ou confirmação, com soros controles positivos e soro negativo, uso soro pra avaliar o teste, EXEMPLO: 70 soros controles positivos, e 65 soros negativos, fez zika em todos, chegou em resultados, imagina que dos 70 Positivos, dos 70, 63 deles foram positivos, esses 63 são verdadeiro positivo; os outros 7 são falso negativo, era pra ser positivo, mas o zika top negativou. Imagina que dos 65, o zika top negativou em 64 deles, os 64 são verdadeiro positivo, e aquele 1 que sobrou é falso negativo, agora a gente consegue calcular os valores negativos.
VPP=VP/VP+FP
VPN= VN/ VN+FN
O valor preditivo positivo é a razão entre o verdadeiro positivo, entre tudo que é positivo, verdadeiro e falso. Enquanto que o valor preditivo negativo é a razão entre os resultados verdadeiros negativos e tudo que é negativo, verdadeiro e falso. 
VPP= 
 0,98 % ou 98% de chances de liberar resultados verdadeiros positivos.
VPN=
 0,90 ou 90%.
O teste tem mais probabilidade de liberar verdadeiro positivo, ele é mais sensível, usado em confirmação. Quando é mais especifico, ele tende a negativar.
CUT-OFF: Limiar de Reatividade
O limiar de reatividade ou cut off de um teste é entendido como o ponto de corte de um teste, isto é, o valor acima do qual se deverá considerar o resultado como positivo, QUANTO MAIOR É MAIS CONFIÁVEL O SEU TESTE. A rigor, não existe um teste sorológico que estabeleça claramente o que é um resultado positivo e um negativo, pois sempre existem amostras cujos resultados ficam em uma zona “duvidosa”, que nem classifica como doente, nem como individuo sadio. 
- PRECIPITAÇÃO: Qualitativo. Baseada na presença de precipitados visíveis formados pela atração Ag-Ac. É geralmente um teste simples, de fácil execução e baixo custo, contudo apresenta falhas de sensibilidade e problemas com a reprodutibilidade.
- IMUNODIFUSÃO: Difusão de uma substância solúvel em um meio fluido. As técnicas de imunodifusão detectam a reação Ag-Ac por intermédio da formação de um precipitado.
- AGLUTINAÇÃO: É caracterizada pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contém determinantes antigênicos na superfície. Teste altamente sensível, utilizado no diagnóstico de vírus, bactérias, protozoário e fungos; doenças auto-imunes; detecção de hormônios e tipagem de grupos sanguíneos. De fácil execução (leitura visual) e baixo custo, apresenta boa especificidade e reprodutibilidade. Tem baixa sensibilidade e pouca estabilidade Ag-Ac.
TESTE DE AGLUTINAÇÃO DIRETA: Ac + Ag = Complexo precipitado. Testes feitos em diluições crescentes, com antígenos na mesma concentração, onde os resultados são expresso em título anti-soro - a máxima diluição onde ocorre a reação. Ex.: Tipagem sanguínea, Toxoplasmose, Salmoneloses, Tripanossomíase.
INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA: Ac + Vírus = Ausência de Aglutinação (positivo para presença de Ac na amostra) Antígenos virais aglutinam hemácias. Anticorpos presentes na amostra inibem a aglutinação indicando presença de anticorpos. Ex.: Rubéola, Sarampo, Influenza.
TESTE DE AGLUTINAÇÃO INDIRETA: (Ag + Partícula Inerte) + Ac = Aglutinação Partículas inertes e hemácias podem ser sensibilizadas por adsorção passiva (contato direto com o antígeno solúvel), por adsorção via agente químico (ácido tânico e cloreto de cromo), por conjugação do Ag (ligações químicas covalentes).
HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA: Proteínas podem ser adsorvidas a hemácias tratadas com ácido tânico e podem ser aglutinadas por Ac específicos. Geralmente é utilizado hemácias de carneiro ou humanas do grupo O. O teste considerado positivo: verifica formação de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em “V” (título será a máxima diluição em que se observa a formação de tapete). Enquanto que o teste será considerado negativo quando hemácias sedimentam formando “botão” compacto. Ex.: Pesquisa de Ac para Trypanosoma cruzi, Treponema pallidum (sífilis), Toxoplasma gondii.
- INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA: Baseia-se na competição, pelos sítios de combinação do Ac, entre o Ag fixado à hemácia e o Ag solúvel ou hapteno. O grau de inibição relaciona-se com a quantidade do Ag presente na amostra e com a afinidade pelos sítios de combinação do anticorpo. Ex.: Detecção de Ag na hepatite e na hemofilia.
- AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX: Partículas de látex são esferas de poliestireno utilizadas como suporte na adsorção. Empregado na pesquisa de Ag ou Ac, sendo a aplicação mais comum é na detecção de fator reumatoide.
- FATOR REUMATÓIDE: Detecção de anticorpo IgM (pentamérico) dirigido contra a Fc do anticorpo IgG (mas também pode ser IgA, IgM e IgE). IgG adsorvida ao látex, haverá exposição dos determinantes que reagem contra o FR, resultando em aglutinação. Se não houver aglutinação, resultado negativo.
- PROTEÍNA C REATIVA: Aparece no soro de pacientes na fase aguda de algumas doenças. É detectada sua presença com partículas de látex contendo anticorpos anti proteína C reativa. Pode ter normalmente no organismo da pessoa; necessário fazer diluições, para evitar pró-zona.
- VDRL: Emprega cristais de colesterol que são sensibilizados com lecitina e cardiolipina, para pesquisa de anticorpos na sífilis. Detecta Ac antilipídios que formam no hospedeiro como resposta ao material de natureza lipídica, liberado pelas células lesadas no início da infecção e ao material lipídico do próprio treponema. Leitura, após agitação, será positiva se ocorrer a formação de flóculos.
- TESTE DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO: Ensaio lítico realizado em duas fases: 1. Ag +Ac + complemento e 2. Hemáias sensibilizadas. Medida da atividade hemolítica determina a presença ou ausência do antígeno ou anticorpo. 
Qualitativo: Titulação do complemento residual não consumido.
Quantitativo: Usa-se quantidades fixas e bem determinadas; o complemento residual é medido por sistema indicador.
AUDIO 25/08
O exemplo clássico de teste imunológico de aglutinação, é a tipagem sanguínea, pega as hemácias no paciente, coloca em contato com os anticorpos monoclonais, teste direto, porque o reagente é o anticorpo. 3 reagentes, anti A, anti B, anti D, com uso desses reagentes eu consigo fazer a classificação sanguínea desse paciente usando dois sistemas sanguíneos, sistema ABO e Rh, mas não são os únicos, temos uma infinidade, mas esses são os mais imunogênicos. O sistema ABO, vai classificar em tipo a se tiver proteína A, em tipo B se tiver proteína B, em tipo AB, se tiver proteína AB, em tipo O se não tiver nenhuma, e o Rh, proteína D, quem tem Rh é positivo, quem não tem é Rh negativo. A tipagem é um passo inicial para um transporte de órgãos. Pego o sangue do paciente, boto em contato com os anticorpos. A aglutinação vai acontecer se formar um imunocomplexo, anticorpo monomérico duas ligações, anticorpo dimerico, tem 4 sitios de ligação, anticorpo pentamérico 10 sitios de ligação, o mesmo anticorpo pode se ligar em mais de um antígeno, e diferentes hemácias podem apresentar o mesmo antígeno, ou seja quando o ultimo se liga em vários antígenos presentes em diferentes hemácias, eu posso afirmar que as hemácias vão ser obrigadas a ficar próximas umas das outras. Aglutinação é sinônimo de juntar, unir, e imunoaglutinação, as particulas são obrigadas a ficar perto das outras por dentro da formação do imunocomplexo, o imunocomplexo leva a aglutinação de partículas. Quando se forma o imunocomplexo, é visível a olho nu, sempre leva ao estado de insolubilidade da partícula.
Testes: ASO, Anti streptolisina O, PCR Proteina C Reativa, e FT Fator Reumatóide. Três significados clínicos diferentes, principio e metodologia são os mesmos. Problema é que cai no problema pro-zona, chega num resultado falso negativo do paciente porque não houve proporção entre antígenos e anticorpos. Exemplo: Zezinho foi pra festa de IVETE com mais 5 amigos, ai os 6, na festa, se interessaram pela mesma menina, os 6 chegaram ao mesmo tempo, nenhum ficou com ela, não houve proporção, e não houve nenhum imuno complexo. Pra escapar do efeito pro-zona tenho que diluir a amostra. 
-ASO 
FEBRE	REUMÁTICA. 
- FATOR REUMATÓIDE: Detecção de anticorpo IgM (pentamérico) dirigido contra a Fc do anticorpo IgG (mas também pode ser IgA, IgM e IgE). IgG adsorvida ao látex, haverá exposição dos determinantes que reagem contra o FR, resultando em aglutinação. Se não houver aglutinação, resultado negativo. ARTRITE	 REUMATÓIDE. 	
- PROTEÍNA C REATIVA: Aparece no soro de pacientes na fase aguda de algumas doenças. É detectada sua presença com partículas de látex contendo anticorpos anti proteína C reativa. Pode ter normalmente no organismo da pessoa; necessário fazer diluições, para evitar pró-zona. 
INFLAMAÇÕES E INFECÇÕES AGUDA.
Na relação em que você tem muito mais anticorpos do que antígenos não existe proporção e a força de ligação é baixa, conforme vou diluindo as amostras, eu vou diminuindo a concetração dos anticorpos e eles chegam em um momento que a concentração do antígeno é a mesma dos anticorpos, nessa situação a forma de ligação é acida, se eu continuar diluindo vou caindo o efeito oposto, antígeno demais pra pouco anticorpo;
Zona de reatividade, que o antígeno e anticorpo estão na mesma proporção, antes da zona, efeito pro-zona, depois da zona, efeito pos-zona, nem no efeito pró-zona nem no pós-zona eu consigo observar reação, nas técnicas de aglutinação se eu diluir demais, já não existe mais formação de imuno complexo. 
Situação 1 amostra pura com reagente puro você visualizou o resultado não reagente e agora dilui a amostra, pelo menos mais 2 vezes, 1:2 não reagente, 1:4 não reagente, libero o laudo, NÃO REAGENTE. 
Situação 2 você fez a lamina 1:1 não viu reação, dilui a amostra, pelo menos 2 , 1:2 e 1:4, tenho que continuar até que eu visualize resultado não reagente, se der não reagente em 1:64. O laudo vai ser liberado como reagente até 1:32. Ou você pode gerar laudo como somente reagente. 
 VDRL também pode cair no efeito pro-zona, no momento inicial ele pode ter dado reagente pra sífilis e apresentou reagente até 1:256, ai ele começou tratamento, depois de 2 meses, ele fez um teste de controle, e ai deu reagente ate 1:2 foi eficaz? SIM, porque diminuiu o anticorpo, e a concentração de bactérias. Reagente até a ultima proporção que você ainda viu o ultimo imunocomplexo.
Situação 3 reagente até proporção 1:1, ou reagente sem titulo, na primeira diluição já não foi mais reagente, entendo que foi um cara que foi 1:1 reagente, 1:2 1:4 e não viu mais nada. Quem libera só como reagente, só fez 1:1 e não diluiu nada. 
Problema do efeito pró-zona, se não fizer diluição da amostra, pode liberar um resultado falso negativo. Toda técnica de aglutinação pode cair no efeito pró-zona. Não existe zona, depois de pós-zona.
IMUNOADSORÇÃO
Reconhecimento de ligação, teste imunoadsortivo, que liga algo ao imunocomplexo; 
Encontro na amostra ou antígeno ou anticorpo, no direto procuro antígeno, no indireto procuro anticorpo, o imunocomplexo sozinho não visualizo nada.
Algo que revele, que o imunocomplexo foi formado. O mais utilizado é o ELISA, Ensaio Imunoenzimático Colorimétrico, uso de uma enzima agindo sobre um substrato pra mudar a cor do meio. O meu sistema revelador, vai se dar pela mudança de cor do meio, houve reação de imunocomplexo, se não houve mudança de cor, não houve formação do imunocomplexo. Sempre tenho um antígeno ou anticorpo fixado a uma superfície solida, se o anticorpo tiver capacidade de se ligar forma imunocomplexo, se tiver formado, algo se liga pra identificar que ele foi formado. Ele é realizado em microplacas, e tem várias microcavidades, suporta de 500 a 600 microlitros de material, se meu teste é direto aderido a superfície já tem anticorpo; se for indireto na sua superfície já vem antígeno, a mudança de cor que vai revelar se houve ou não formação, mudança de cor, não é algo colorido, de azul p amarelo, ou de transparente pra uma cor qualquer, de uma cor pra outra, a mudança de cor que revela o imunocomplexo, a intensidade é diretamente proporcional a concetração do analito, quanto mais forte, mais analito, quanto mais fraco, menor a quantidade. TESTE QUANTITATIVO; Usa uma solução padrão, consegue liberar resultados quantitavos, regra básica do imuno-ensaio, qualquer anticorpo se ligando a qualquer antígeno, Diagnostico de qualquer coisa. 
Amostra biológica no poço, tenho na placa anticorpo, quando adiciona, todo material da amostra está no poço mas somente o analito se liga ao poço, depois disso, a gente faz a lavagem, retirar da fase solida, qualquer coisa que não tenha se ligado a parte solida, única coisa que fica é o anticorpo e o antígeno que se ligou, imunocomplexo formado, não vejo nada, não existe nenhuma diferença, tudo que faço p frente é se vai ser revelado ou não, adiciona um anticorpo conjugado a uma enzima, essa enzima atua sobre o substrato gerando um produto colorido, e só se torna colorido, se a enzima estiver presente, outra lavagem, se houver mudança de cor, e a intensidade é diretamente proporcional a concentração do analito. 
IMUNOFLUORESCENCIA
Reação de imunofluorescência indireta A- pesquisa de antígeno • amostra (Ag??) + Ac específico → Ag-Ac * • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * • microscópio de fluorescência
Reação de imunofluorescência direta - A reação Ag-Ac é detectada pela emissão de fluorescência Pesquisa de antígeno • amostra (Ag??) + Ac específico conjugado a substância fluorescente (conjugado)* • → microscópio de fluorescência. COMPOSTO QUE QUANDO EM PRESENÇA DE LUZ ULTRA VIOLETA É EXCITADO E EMITE BRILHO. 
RADIOIMUNOENSAIOS
Radiação emitidapela placa for alta, significa que quem se ligou mais no anticorpo foi o reagente, e a concentração do analito é baixa.
Se a emissão for emitida na placa é baixa, quer dizer que se ligou mais na placa a amostra do paciente, e a concetração é alta. Pode ser utilizado pra qualquer coisa, mas por conta dos riscos inerentes, ele é menos utilizado, é mais caro que o leitor de elisa, resultados mais confiáveis que o da elisa. Concentrações muito pequenas, é a técnica de escolha. QUANTIDADE DE REAÇÃO QUE É EMITIDA.
QUIMIOLUMINESCÊNCIA 
Determinada substancia complexa, quando entra em contato com enzima que é capaz de degradar, da origem a dois compostos livres, e também da emissão de luz, em fogos de artificio, realizada no imunodiagnostico, ou sistema revelador, atua sobre substancia química quebra e emite luz. Entrou em desuso... tem que trabalhar em ambiente escuro. Quando é positiva, ou em flash, ou algo que aumenta a intensidade e depois diminui, quantifica luz emitida, e também concentração do analito, utilizado pra qualquer coisa mas entrou em desuso.