Utilização da Epigenética na Ciência Forense

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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS FORENSES 
 
UTILIZAÇÃO DA EPIGENÉTICA NA CIÊNCIA FORENSE 
 
Getúlio Pereira de Oliveira Júnior
1
 
Túlio Cesar de Lima Lins
2 
 
1 Biólogo. Aluno da Pós-Graduação em Biociências Forenses pela Pontifícia 
Universidade Católica de Goiás/IFAR. 
2
 
Orientador. Bacharel em Química pela Universidade de Brasília, mestre em Ciências 
Genômicas e Biotecnologia pela Universidade Católica de Brasília. E-mail: 
lins.tulio@gmail.com 
 
Resumo 
 
Este trabalho é uma revisão sobre a possibilidade da utilização de técnicas 
espigenéticas complementares as técnicas normalmente utilizadas na genética forense. Serão 
abordados o sequenciamente bissulfito na determinação do padrão de metilação do DNA entre 
indivíduos, assim como a imunoprecipitação da cromatina para analisar as modificações na 
cromatina entre indivíduos. Essas técnicas são importantes na genética forense, pois podem 
ajudar na diferenciação entre gêmeos monozigóticos e na determinação da idade celular por 
meio de tecidos biológicos. Dentro de alguns anos será rotina nos laboratórios de genética 
forense a análise de marcadores epigenéticos complementares aos marcadores genéticos 
utilizados normalmente. 
Palavras-chave: Epigenética, metilação do DNA, cromatina, gêmeos monozigóticos. 
 
 
The use of Epigenetics in Forensic Science 
 
Abstract 
 
This paper is a review about the possibility of using complementary epigenetics 
techniques commonly used in forensic genetics. Will be discussed the bisulfite sequencing to 
determining the DNA methylation pattern of individuals as well as the immunoprecipitation 
of chromatin to analyze the changes in chromatin between individuals. These techniques are 
important in forensic genetics, and can help to distinguish between monozygotic twins and the 
determination of cellular age using biological tissues. Within a few years will be routine in 
forensic genetics laboratories analyzing epigenetic markers complementary to the commonly 
used genetic markers. 
Key words: Epigenetics, DNA methylation, chromatin, monozygotic twins 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
A existência de regiões variáveis no DNA humano foi reconhecida por um longo 
período de tempo como fonte de variação entre indivíduos, porém apenas no final de 1970 
que o uso de polimorfismos para mapeamento em larga escala de genes humanos foi proposto. 
Arlene Wyman e Ray White utilizaram loci de DNA polimórficos caracterizados por 
fragmentos de restrição de tamanho variáveis ou RFLP, em seguida, David Botstein mostrou 
que os RFLPs poderiam ser utilizados pra indicar diferenças genéticas entre indivíduos. 
Contudo, foi o geneticista norte-americano Alec Jeffreys que primeiro descreveu a técnica 
conhecida hoje como “DNA firgerprinting”, que consiste de um conjunto de marcadores 
genéticos chamados minissatélites ou sequências repetitivas de número variável (VNTR), que 
são altamente específicas a um indivíduo. As regiões de DNA conhecidas como VNTR são 
altamente polimórficas e compostas por um conjunto de sequências repetitivas em um local 
definido do genoma, que podem ser utilizadas para diferenciar membros de uma população 
(THOMPSON; ZOPPIS; MCCORD, 2012). 
Hoje em dia, os perfis de DNA são geralmente obtidos a partir de sequências de 
repetições curtas em tandem (STRs) que apresentam entre 3 e 5 bases de comprimento 
repetidas até centenas de vezes, sendo fonte de grande variação individual. Logo, a 
probabilidade de dois indivíduos que partilham um conjunto idêntico de polimorfismos, 
excluindo-se gêmeos monozigóticos, é pequena (HUNTER, 2010). 
a identificação individual de gêmeos monozigóticos (MZS) em circunstâncias forenses 
sempre foi difícil realizar. É impossível distinguir MZS utilizando marcadores genéticos 
convencionais de DNA, tais como os STRs e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). No 
entanto, MZS quase sempre mostram vários graus de discordância fenotípica. Na última 
década, evidências têm sido acumuladas de que modificações epigenéticas do DNA e histonas 
pode ter um papel primordial nos resultados fenotípicos, incluindo em doenças humanas (LI 
et al., 2011)(BELL; SPECTOR, 2011). 
No início de 1940 o termo Epigenética foi introduzido pelo biólogo do 
desenvolvimento Conrad Waddington, como o ramo da biologia que estuda as interações 
entre genes e seus produtos que fazem o fenótipo visível. No sentido original da sua definição, 
epigenética se referia a todas as vias moleculares que modulam a expressão de um genótipo 
em um fenótipo particular (DUPONT; ARMANT; BRENNER, 2009). A história da 
epigenética é ligada ao estudo da evolução e do desenvolvimento, mas durante os últimos 50 
anos, o significado do termo “epigenética” tem se submetido a uma evolução que aumentou 
significativamente o conhecimento científico dos mecanismos moleculares envolvidos na 
regulação da expressão gênica em eucariotos. Atualmente a epigenética pode ser definida 
como o estudo das mudanças nas funções gênicas herdáveis meióticas e/ou mitóticas que não 
podem ser explicadas pelas mudanças nas sequências de DNA (ALLIS; JENUWEIN; 
REINBERG, 2007). Grande parte da pesquisa epigenética está convergindo para o estudo de 
modificações covalentes e não covalentes de DNA e de proteínas histonas e os mecanismos 
pelos quais essas modificações influenciam na estrutura geral da cromatina (GOLDBERG; 
ALLIS; BERNSTEIN, 2007). 
A metilação do DNA está envolvida no controle celular normal de expressão gênica, 
enquanto a hipermetilação aberrante pode levar ao silenciamento de genes. A metilação do 
DNA ocorre quase exclusivamente em uma citosina de um dinucleotídeo CpG, e é conseguida 
pela adição de um grupo metil na posição 5 do anel de citosina mediada pela enzima DNA 
metil transferase (DNMTs) (CHUANG; JONES, 2007a). 
O estado da cromatina, e consequentemente o acesso ao código genético, é 
principalmente regulada por modificações pós-traducionais reversíveis (PTMs) no DNA ou 
nas proteínas histonas que levam a uma estrutura de empacotamento da cromatina mais aberta 
ou fechada influenciando no reconhecimento das marcas por fatores de transcrição e 
complexos protéicos (SCHNEIDER et al., 2011; YOST et al., 2011). Histonas estão sujeitas a 
vários tipos de PTMs incluindo acetilação, metilação, fosforilação, sumoilação, ubiquitinação, 
glicosilação. As metilações em caudas de histonas, que ocorrem principalmente na lisina e em 
resíduos de arginina localizados nas caudas N-terminais do núcleo das histonas, e são uma das 
PTM mais estudadas (YOST et al., 2011). 
Ao longo do desenvolvimento, as células e tecidos se diferenciam e mudam com o 
avanço da idade do organismo. Isso inclui alterações teloméricas, acúmulo de mutações no 
DNA, a senescência de estruturas celulares e de órgãos, e mudanças na expressão genética. 
Tanto a diferenciação de tecidos quando os efeitos do envelhecimento são pelo menos 
parcialmente causadas por modificações químicas no genoma, tais como a metilação do DNA 
(BOCKLANDT et al., 2011) (KOCH; WAGNER, 2011). 
Alterações epigenéticas restritas ao indivíduo pode ser uma ferramenta complementar 
em casos em que a genética forense não consegue resolver utilizando somente ferramentas de 
identificação de rotina, como os STR ou SNP, ou no caso de diferenciar gêmeos 
monozigóticos (MZS), além de estimar características fenotípicas de um suspeito, como a 
idade. Portanto, este trabalho busca revisar a literatura científica internacional a respeito da 
utilização da epigenética como mecanismo complementar à ciência forense. 
 
2 METODOLOGIA 
 
Para a elaboração deste trabalho de revisão foram utilizados artigos científicospublicados em revistas internacionais nos últimos 10 anos, acessados através do periódico 
CAPES, base de dados PubMed e da plataforma do centro nacional de informação 
biotecnológica (NCBI) disponível em: www.ncbi.nlm.nih.gov. As principais palavras-chaves 
utilizadas foram: epigenetic; forensic genetic; forensic epigenetic. 
 
3 DISCUSSÃO 
 
3.1 BREVE HISTÓRICO DA GENÉTICA FORENSE 
 
A identificação humana através de técnicas de análise de DNA transformou a ciência 
forense. Provavelmente, o desenvolvimento mais importante tem sido o enorme sucesso da 
utilização das sequencias de repetições curtas em tandem (STR). Além de processos 
criminais, este método tem agora uma vasta gama de aplicações, por exemplo, em teste de 
paternidade, identificação militar, investigações históricas sobre a população humana e outras 
espécies (GOEDECKE et al., 2004). Além disso, o teste de DNA foi importante na 
identificação das vítimas do atentado terrorista que ocorreu em 11 de setembro de 2001 no 
World Trade Center em New York (BIESECKER et al., 2005). 
O primeiro banco de dados criminal bem-sucedido foi criado na Europa em 1995. O 
banco de dados dos Estados Unidos, chamado de combined DNA index system (CODIS), foi 
criado em 1998 seguindo o sucesso do sistema Europeu. Nos últimos anos, a genotipagem dos 
STRs usando eletroforese capilar tornou-se um método cuidadosamente validado para 
identificação humana. Até mesmo algumas poucas cópias de moléculas de DNA, extraídos de 
cenas de crimes ou áreas de desastres, podem ser analisadas e caracterizadas (GOEDECKE et 
al., 2004). 
Os marcadores de STR são alvos de iniciadores direto e reverso em uma reação em 
cadeia da polimerase (PCR), que hibridizam em ambos os lados da região de repetição. Um 
dos iniciadores é marcado na extremidade 5’ com um corante fluorescente que permite a 
detecção do produto de PCR resultante da amplificação seguinte (Figura 1). A posição dos 
iniciadores define o tamanho geral dos produtos de PCR assim como o número de repetições 
presentes na região STR. Os produtos de PCR são separados por tamanho e cor do corante 
usando eletroforese seguida por indução a laser de fluorescência com detecção de múltiplos 
comprimentos de onda. Um padrão interno, contendo fragmentos de DNA de tamanho 
conhecido e marcados com um corante de cor diferente, é tipicamente analisado por 
eletroforese correndo juntamente com as amostras para calibrar os tamanhos de corrida a 
corrida. Os dados coletados na forma de eletroferogramas multicoloridos são analisados por 
software que automaticamente determina o tamanho dos alelos de STR baseado em uma curva 
padrão produzida a partir dos padrões internos de tamanhos conhecidos. A genotipagem de 
STR é feita por comparação dos tamanhos de alelos em cada amostra para os tamanhos de 
alelos presentes em uma escada alélica, que contém alelos comuns que tenham sido 
previamente sequenciados (BUTLER et al., 2004). 
 
 
Figura 1. Representação esquemática das posições dos iniciadores em uma PCR para 
amplificação de marcadores de DNA STRs. As setas únicas representam as posições dos iniciadores, a 
seta dupla ilustra o tamanho total do produtor de PCR usando um conjunto particular de iniciadores 
(BUTLER et al., 2004) com adaptações. 
 
A finalidade de um banco de dados de DNA é coletar e armazenar perfis de DNA (por 
exemplo, a partir de cenas de crime, de criminosos, ou casos de pessoas desaparecidas) e 
permitir a comparação dos perfis. Em casos de reincidência, os bancos de dados de DNA, são 
projetados para ajudar a resolver crimes futuros (GE; EISENBERG; BUDOWLE, 2012). Em 
novembro de 1997, o Federal Bureau of Investigation (FBI) selecionou 13 marcadores STR 
para servir como o núcleo do CODIS. Estes marcadores são CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, 
VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 e D21S11 
(Tabela 1) (BUTLER et al., 2004). 
Em junho de 2011, pesquisas sobre o CODIS já produziu mais de 147,200 pistas que 
ajudaram em mais de 141,300 investigações. Atualmente, o banco de dados CODIS contém 
mais de 10 milhões de perfis forenses e o número de perfis continua a aumentar (GE et al., 
2012) 
Tabela 1. Informações sobre os 13 marcadores STR utilizados pelo FBI no banco de dados 
CODIS e outros marcadores STR contidos em kits comerciais (BUTLER et al., 2004). 
 
 
Embora a utilização de marcadores nos 13 loci de STR do CODIS seja suficiente na 
maioria dos casos, abordagens de ampliação vem sendo estudadas, entre elas, a inclusão de 
mais loci à base de dados, Y-STRs para determinação da linhagem paterna, a utilização do 
DNA mitocondrial, já que mais mulheres e associações maternas podem vir a preencher o 
banco de dados no futuro, a utilização de nucleotídeos de polimorfismo único (SNP) (GE et 
al., 2012) e estratégias baseadas na utilização de mecanismos epigenéticos, que incluem as 
modificações pós-traducionais em caudas de histonas e a metilação do DNA, já que esta 
fornece informações que podem servir para a diferenciação de gêmeos monozigóticos, na 
determinação da idade biológica e nos recentes crimes onde o indivíduo tem seus alelos de 
STR dos loci do CODIS desvendados, em seguida sintetizados em laboratório e implantados 
na cena do crime para uma falsa acusação. 
 
3.2 METILAÇÃO DO DNA 
 
Uma das primeiras marcas epigenéticas estudadas em eucariotos é a metilação em 
citosinas do DNA, que atua como uma modificação de forma herdável estável afetando a 
atividade do gene e a biologia celular (FERNANDEZ et al., 2012). 
A metilação do DNA é uma modificação covalente na qual a posição 5’ da citosina é 
metilada em uma reação catalisada pelas enzimas DNA metil transferases (DNMTs) com a S-
adenosil-metionina como doador do grupo metil (Figura 2). Nos mamíferos, esta modificação 
ocorre nos dinucleótidos CpG e pode ser catalisada por três diferentes enzimas, DNMT1 e 
DMNT3a, e DNMT3b. A metilação do DNA desempenha um papel no silenciamento da 
transcrição e na formação da heterocromatina, que é a forma condensada da cromatina. Como 
uma modificação epigenética, a metilação do DNA permite que esses estados de 
silenciamento gênicos sejam herdados ao longo das divisões celulares (MIRANDA; JONES, 
2007). 
 
 
Figura 2. Mecanismo de metilação do DNA. A metilação do DNA envolve a adição de um 
grupo metil na posição 5 de um resíduo de citosina, mediada pelas enzimas DNMTs. A metilação do 
DNA acontece quase exclusivamente em citosinas anteriores a uma guanina em um dinucleótido CpG 
(CHUANG; JONES, 2007a) com adaptações. 
 
As ilhas CpG normalmente permanecem não metiladas, emquanto sítios esporádicos 
CpG no restante do genoma são normalmente metilados. Existe uma inversão gradual deste 
padrão durante o envelhecimento o que leva a uma metilação esporádica nas ilhas CpG e uma 
perda global de metilação, mas esta mudança ocorre particularmente durante a carcinogênese. 
A metilação de ilhas CpG em regiões promotoras é muitas vezes associada com o 
silenciamento de genes, e metilação anormal no DNA ocorre na maioria dos cânceres, 
levando ao silenciamento de alguns genes supressores de tumor (Figura 3) (CHUANG; 
JONES, 2007b). 
 
Figura 3. As regiões CpG no genoma são distribuídos desigualmente. As ilhas CpG podem 
ser encontradas nas regiões promotoras de cerca de metade dos genes e normalmente permanecem 
desmetiladas. Quando elas se tornam anormalmente hipermetiladas, como pode acontecer em muitos 
cânceres, elas levam ao silenciamento de genes (CHUANG; JONES, 2007a) com adaptações. 
 
A técnica considerada padrão-ouro na análise do estado de metilação de citosinas 
individuais é o sequenciamento bissulfito, nas quais as citosinas não metiladassão 
convertidas em uracilas e lidas como timinas, enquanto citosinas metiladas são protegidas da 
conversão. O rendimento do sequenciamento bissulfito mostra resolução ótima de dados, mas 
este método tem sido limitado na cobertura de genomas relativamente pequenos 
(FERNANDEZ et al., 2012). Uma vez que a conversão das citosinas não metiladas tenham 
ocorrido, as diferenças entre citosinas metiladas e não metiladas (convertidas em uracilas) 
podem ser analisadas por vários métodos, entre eles, sequenciamento, digestão usando 
enzimas de restrição, ensaios de extensão de nucleotídeos (MS-SnuPE), PCR com iniciadores 
específicos (MSP), ou pirossequenciamento. Estes métodos são valiosos já que não são 
laboriosos e requerem quantidades pequenas de DNA. No entanto, estes métodos são 
geralmente limitados uma vez que só se pode estudar um único gene ou locus por rodada. Os 
métodos anteriores que consistiam na utilização de enzimas de restrição sensíveis a metilação 
e Southen blotting para a determinação de metilação em genes específicos foram substituídos 
para aqueles métodos mais convenientes (YANG et al., 2004) 
 
3.3 MODIFICAÇÃO NA CROMATINA. 
 
A cromatina é uma estrutura altamente dinâmica de nucleossomos que são compostos 
por DNA e estão envolvidos em torno do núcleo das proteínas histonas (H2A, H2B, H3 e H4) 
(TOTH et al., 2010). Esta estrutura é crucial para a regulação da expressão gênica, que é feita 
através do recrutamento de complexos proteicos e pelo remodelamento da cromatina. As 
modificações covalentes no núcleo das histonas tem um papel crítico na regulação da 
expressão gênia por meio da acetilação, metilação (GOLBABAPOUR; ABDULLA; 
HAJREZAEI, 2011), fosforilação, ubiquitinação, sumoilação e essas modificações em 
histonas são mais dinâmicas do que a metilação do DNA uma vez que podem ser colocadas e 
removidas por uma ampla variedade de enzimas (VAN MONTFOORT et al., 2012). 
 
Figura 4. Representação das caudas de histona na formação da fibra de DNA de 30-nm. (A) 
Os pontos de saída aproximadas das oito caudas de histonas, quatro de cada subunidade, que se 
estendem a partir de cada nucleossomo. (B) Um modelo especulativo mostrando como as caudas de 
histona podem ajudar a embalar nucleossomas juntos na fibra de 30-nm. Este modelo baseia-se em (1) 
Evidência experimental de que as caudas de histonas ajudam na formação da fibra 30-nm, (2) A 
estrutura cristalina do nucleossomo vista por raio-x, e (3) evidência de que as caudas histona 
interagem com o DNA (ALBERTS et al., 2002) com adaptações. 
 
Ao contrário da metilação do DNA, que é geralmente envolvido na repressão da 
transcrição, modificações em caudas de histonas exibem grande variedade de funções (VAN 
MONTFOORT et al., 2012). A hiperacetilação das histonas H3 e H4 ocorrem principalmente 
em promotores e correlacionam com a ativação gênica, enquanto a hipoacetilação é 
caracterizada pela repressão gênica. A metilação de histonas está associada tanto com a 
ativação quanto repressão de genes, dependendo de quais resíduos de lisina na histona são 
mono-, di- ou tri-metilados. Em geral, os genes transcricionalmente ativos estão associados 
com H3K4me3 e H3K36me3, enquanto que a trimetilação de H3K9, H3K27 e H4K20 ocorre 
principalmente em genes reprimidos (TOTH et al., 2010). 
Para entender como ocorre o mecanismo de interação do DNA com proteínas, como 
visto no caso das modificações em histonas, é utilizada a técnica de imunoprecipitação da 
cromatina (ChIP). A ChIP tem sido amplamente utilizada para mapear a localização de 
modificações pós-traducionais encontradas em caudas de histonas no genoma ou em loci de 
genes específicos, ou para mapear a associação de fatores de transcrição ou de enzimas 
modificadoras da cromatina do genoma (COLLAS; DAHL, 2008). 
A ChIP é uma técnica eficiente que permite a análise da interação entre fatores de 
transcrição e de complexos reguladores da cromatina com o DNA em células vivas, 
proporcionando assim uma imagem da célula viva com a estrutura nativa da cromatina e 
fatores ligados a genes em diferentes estados funcionais. Tipicamente, a técnica ChIP 
primeiro envolvia o crosslinking entre proteína-proteína e proteína-DNA. Resumidamente, a 
cromatina isolada bruta é então sonicada para produzir pequenos fragmentos, normalmente de 
300-1000 pb de tamanho médio. Em seguida, os anticorpos são usados contra proteínas que 
supostamente se ligam a uma determinada parte do DNA para imunoprecipitar fragmentos da 
cromatina. Para finalizar pode ser feita análise por PCR do imunoprecipitado, usando 
oligonucleótidos que medem uma sequencia de DNA, revelando quando a proteína está ligada 
in vivo a uma região de DNA (SANDOVAL et al., 2004). 
 
Figura 5. Duas maneiras em que a estrutura da cromatina pode influenciar a expressão gênica. 
Uma região de cromatina não embaladas, chamada eucromatina, em que os genes são acessíveis é 
flanqueado por dois segmentos mais compactos, chamados heterocromatina. Na eucromatina, o 
posicionamento dos nucleossomas influenciam a expressão gênica. À esquerda, os nucleossomos têm 
espaçamento regular, no lado direito, o posicionamento nucleossomo mudou e uma pequena extensão 
de DNA, de aproximadamente 300 pb, é exposta (BROWN, 2002) com aptações. 
 
3.4 EPIGENÉTICA NA IDENTIFICAÇÃO DE GÊMEOS 
MONOZIGÓTICOS 
 
Gêmeos monozigóticos compartilham o mesmo genótipo. Entretanto, várias 
discordâncias fenotípicas podem ser observadas entre a maioria dos gêmeos monozigóticos, 
como as diferenças na susceptibilidade a doenças e em várias características antropomórficas. 
Existem algumas possíveis explicações para essas observações, desde variações 
submicroscópicas no DNA após ciclo celular meiótico, até a existência de diferenças 
epigenéticas (FRAGA et al., 2005). Essa variação entre os organismos com sequências de 
DNA virtualmente idênticas tem sido largamente atribuída para os efeitos do ambiente. 
Fatores ambientais podem ter um forte efeito sobre alguns fenótipos, mas evidências de 
experiências em animais e humanos sugerem que o impacto do ambiente tem sido exagerado. 
Portanto, os pontos de vista sobre as causas das diferenças fenotípicas em organismos 
geneticamente idênticos requerem uma revisão (WONG, A. H.; GOTTESMAN; PETRONIS, 
2005). 
Duas áreas que podem se beneficiar das diferenças epigenéticas observadas em 
gêmeos monozigóticos são a ciência forense e a medicina de transplante de órgãos. Embora os 
gêmeos não tenham maior probabilidade de serem criminosos comparados com a população 
em geral, um em cada 250 pessoas são gêmeos MZ e os processos judiciais envolvendo 
gêmeos MZ são de alto perfil. Por exemplo, a identidade genética compartilhada de gêmeos 
MZ pode permitir que os gêmeos forneçam uns álibis entre si em casos criminais. Diferenças 
nos perfis epigenéticos entre gêmeos MZ, se consistentemente comprovado, poderia conduzir, 
no futuro, um preenchimento dessa lacuna (BELL; SPECTOR, 2011). 
Um dos primeiros estudos envolvendo mecanismos epigenéticos em gêmeos MZ 
examinou diferenças globais e locus-específica na metilação do DNA e na acetilação das 
histonas de um grande grupo de gêmeos monozigóticos (FRAGA et al., 2005). Eles 
descobriram que, embora os gêmeos sejam epigeneticamente indistinguíveis durante os 
primeiros anos de vida, gêmeos MZ mais velhos apresentaram diferenças marcantes em seu 
conteúdo geral e na distribuição genômica de 5-metilcitosina no DNA e na acetilação de 
histonas, afetando os seus perfis de expressão gênica (Figura 5). Estes achados indicam uma 
lacuna com relação aos conceitos da epigenética sobre a nossa compreensão de como 
diferentes fenótipos podem ser originados a partir do mesmo genótipo. Essas diferençasnos 
perfis epigenéticos podem ser explicadas pela influência de fatores externos e internos. O 
hábito de fumar, atividade física, dieta, são fatores externos que podem influenciar nas 
modificações epigenéticas (FRAGA et al., 2005). 
 
 Figura 6. (Acima) Quantificação do conteúdo total de 5mC do DNA (esquerda), acetilação 
das histonas H4 (Centro), e acetilação da histona H3 (Direita) por HPLC e eletroforese capilar de alta 
performance. (C Baixa) Comparação dos valores epigenéticos entre os irmãos de cada par de gêmeos 
com 3 e 50 anos de idade (FRAGA et al., 2005). 
 
Em 2010 foi investigada quantitativamente a metilação do DNA em regiões 
promotoras do gene receptor de dopamina 4 (DRD4), o gene transportador de serotonina 
(SLC6A4/SERT) e o gene ligado ao X da monoamina oxidase A (MAOA) utilizando 
amostras de DNA em 46 pares de MZ e 45 pares de gêmeos dizigóticos (DZ) (total n = 182) 
nas idades de 5 e 10 anos. Os dados sugeriram que as diferenças na metilação do DNA são 
visíveis já na infância, até mesmo entre indivíduos geneticamente idênticos, e que as 
diferenças individuais na metilação não são estáveis ao longo do tempo (Figura 6). O estudo 
do autor sugere ainda que as influências ambientais são fatores importantes na contabilização 
das diferenças de metilação interindividuais de DNA, e que essas influências diferem do 
genoma (WONG, C. C. et al., 2010). 
 
Figura 7. Nível médio de metilação no DNA em DRD4, SERT e MAOA em idades de 5 e 10 
anos. MZ, gêmeos monozigóticos, DZ, dizigóticos; MZM, gêmeos monozigóticos do sexo masculino; 
MZF, gêmeos monozigóticos femininos; DZM, dizigóticos do sexo masculino; feminino, DzF 
dizigóticos (WONG, C. C. et al., 2010). 
 
Outro estudo analisou 22 pares de gêmeos MZ adultos. O DNA genômico foi 
modificado com bissulfito e em seguida foram analisadas 27,000 ilhas CpG. Os resultados 
indicaram que gêmeos MZ apresentaram diferenças notáveis nas suas 5-metilcitosina entre 
seus genomas (LI et al., 2011). De acordo com um conjunto de critérios de seleção, 377 sítios 
CpG com diferenças significativas de metilação foram escolhidos. Embora a metilação do 
DNA mostre apenas estabilidade parcial, os resultados primário deste estudo sugerem 
fortemente que a metilação em ilhas CpG pode ser um biomarcador para distinguir gêmeos 
MZ uns dos outros (LI et al., 2011). 
Para explorar a variação e herdabilidade da metilação do DNA, outro estudo 
(GERVIN et al., 2011) realizou sequenciamento bissulfito de 1,760 ilhas CpG em 186 regiões 
do complexo de histocompatibilidade humana (MHC) em linfócitos CD4+ de 49 pares de 
gêmeos monozigóticos (MZ) e 40 dizigóticos (DZ). Os resultados mostraram que indivíduos 
apresentam grandes variações na metilação do DNA, tanto entre genes e dentro das regiões do 
complexo MHC. Além disso, muitas regiões também têm um padrão complexo de variação 
(GERVIN et al., 2011). Globalmente, parece ser uma distribuição bimodal de metilação de 
DNA nas regiões, mas uma fração significativa das ilhas CpG são também heterogeneamente 
metiladas. A classificação das regiões em ilhas CpG (intragênica e intergênica), final 5’ de 
genes não associado a uma ilha CpG definida, regiões não-codificadoras conservadas, e sítios 
aleatórios CpG, mostraram diferenças em variação e hereditariedade de acordo com a região 
analisada. As análises revelaram menores diferenças intra-par entre MZ do que entre os pares 
DZ, sugerindo algumas influências genéticas sobre a variação da metilação do DNA, com a 
maior parte da variância atribuída a não genéticos fatores. Em geral, as estimativas de 
herdabilidade de metilação do DNA foram baixas (GERVIN et al., 2011). 
 
3.5 PREVENDO A IDADE POR MEIO DA EPIGENÉTICA 
 
O envelhecimento afeta as funções fisiológicas e pode ser definido como a 
acumulação de danos nas moléculas, células e tecidos durante toda a vida. Muitas vezes esse 
processo diminui a capacidade de um organismo para manter a homeostase em condições de 
estresse, e implica um maior risco para muitas doenças (câncer, doenças cardiovasculares e 
doenças neurodegenerativas). A identificação de fatores que regulam o envelhecimento é 
limitada pela complexidade do processo e pela considerável heterogeneidade entre indivíduos 
e mesmo entre tecidos dentro de um corpo. Ao nível celular, o evento mais proeminente em 
um tecido de envelhecimento é a senescência celular, uma consequência da exposição 
intrínsecas e extrínsecas à fatores de envelhecimento. É caracterizada pela acumulação 
gradual de danos no DNA e alterações epigenéticas na estrutura do DNA que afetam a 
expressão gênica correta e levam a uma alteração da função celular (RODRIGUEZ-RODERO 
et al., 2011). 
No contexto de determinar a idade celular por meio de mecanismos epigenéticos, os 
gêmeos monozigóticos (MZ) são um modelo atraente para estudar mudanças de metilação 
com a idade. No momento da separação dos embriões, ambos têm padrões de metilação quase 
idênticos. Enquanto certas mudanças de metilação são geneticamente controladas, a exposição 
ambiental e processos estocásticos podem conduzir a alterações no padrão de metilação. 
Dessa forma, gêmeos idênticos podem ser considerados replicatas do mesmo experimento de 
desenvolvimento e envelhecimento. Vários estudos têm investigado o estado epigenético de 
um pequeno número de genes selecionados e ilhas CpG em indivíduos de diferentes idades ou 
mediram as mudanças globais na metilação do DNA com o aumento da idade. Recentemente, 
estudos imparciais do genoma têm documentados os efeitos da idade sobre a metilação do 
DNA em cultivo de células, camundongos, e os seres humanos (BOCKLANDT et al., 2011). 
O primeiro estudo que buscou analisar padrões de metilação relacionados à idade foi 
publicado em 2009 e utilizou modelo de camundongos da linhagem C57BL/6J (n = 12 por 
grupo) de duas idades diferentes, 2 meses (jovens) e 10 meses (adulto), e mães com idade 
entre 2 meses (n = 6 casais reprodutores por grupo). Os comportamentos sociais e 
exploratórios foram examinados na prole. As conclusões dos autores foram que os filhotes de 
pais mais velhos tinham comportamento social menor (p = 0,02) e exploratória (p = 0,02) 
comparados com a prole de pais mais jovens. Não houve diferenças significativas na medição 
de atividade motora. A conclusão do trabalho diz que evidência de efeitos deletérios do 
avanço da idade paterna no comportamento social e exploratório. Alterações cromossômicas 
de-novo e/ou mudanças epigenéticas são os fatores mais aceitáveis para explicar essas 
mudanças (SMITH et al., 2009). 
Dois importantes artigos foram publicados em 2011 e utilizaram humanos para 
determinar a idade celular. O primeiro artigo, mostrou que os padrões da metilação do DNA 
mudam com o aumento da idade e contribuem nas doenças relacionadas à idade 
(BOCKLANDT et al., 2011). Os autores identificaram 88 regiões dentro ou próximas de 80 
genes nos os quais o grau de metilação de citosina foi significativamente correlacionado com 
a idade. Para a realização deste estudo, os autores utilizaram saliva de 34 pares de gêmeos MZ 
homens entre 21 e 55 anos de idade. Além disso, eles validaram regiões nos promotores de 
três genes e replicaram os resultados usando amostras da população geral de 31 homens e 29 
mulheres entre 18 e 70 anos de idade. A metilação em três regiões, nos promotores dos genes 
EDARADD, TOM1L1, e NPTX2 foram consideradas lineares com a idade ao longo de um 
intervalo de cinco décadas (Figura 7). Usando apenas duas citosinas encontradas neste loci, os 
autores construíram um modelo de regressão que explicou 73% da variação na idade, e foram 
capazes de prever a idade de um indivíduo com uma precisão média de 5,2 anos 
(BOCKLANDT et al.,2011). 
Os dados mostrados podem ser utilizados na ciência forense, tornando possível estimar 
a idade de uma pessoa, baseada em uma amostra biológica isolada (BOCKLANDT et al., 
2011). 
 
 
Figura 8. Porcentagem de metilação versus a idade para os três marcadores validados em três 
conjuntos de amostras. Amostras originais de gêmeos foram marcadas em azul, amostras controles de 
homens estão marcadas em vermelho e as amostras de controle do sexo feminino em verde. As linhas 
de tendência linear são mostradas nas cores das amostras individuais. A) Edaradd r = -0.81 (gêmeos), r 
= -0.73 (controles do sexo masculino), r = -0,75 (controles do sexo feminino) B) NPTX2 r = 0,52 
(gêmeos), r = 0,79 (controles do sexo masculino), r = 0,03 (controles do sexo feminino) C) Tom1L1 r 
= -0,70 (gêmeos), r = -0.49 (controles do sexo masculino), r = -0,24 (controles do sexo feminino) 
(BOCKLANDT et al., 2011). 
 
Outro importante artigo publicado em 2011 (KOCH; WAGNER, 2011) buscou perfis 
de metilação no DNA de vários tipos de células em depósitos de dados públicos por meio da 
plataforma HumanMethylation27 BeadChip que representa 27.578 regiões CpG. Cinco 
conjuntos de dados englobando os tecidos da derme, epiderme, esfregaço cervical, células-T e 
monócitos foram utilizados para construir o modelo Pavlidis para identificar 19 regiões CpG 
que são continuamente hipermetiladas pelo envelhecimentos (R> 0,6; p-value <10
-13
). Quatro 
destas regiões CpG (associadas aos genes NPTX2, TRIM58 e GRIA2 e KCNQ1DN) e uma 
região adicional CpG hipometilada (BIRC4BP) foram usados para prever a idade dos 
doadores. Esta assinatura epigenética da idade foi testada para validação de um grupo de oito 
conjuntos de dados independentes correspondentes a vários tipos de células de tecidos 
diferentes. Em geral, as cinco regiões CpG revelaram mudanças na metilação do DNA 
associadas à idade em todos os tecidos. A diferença média absoluta entre as idades previstas e 
cronológicas reais foi cerca de 11 anos. Este método pode ser utilizado para prever a idade do 
doador em várias preparações celulares – por exemplo, na utilização na ciência forense 
(KOCH; WAGNER, 2011). 
 
Tabela 2. Regiões CpG com as mudanças mais significativas associadas à idade (KOCH; 
WAGNER, 2011). 
 
O modelo Pavlidis foi usado para identificar regiões CpG que apresentassem alterações mais 
significativas associadas à idade. Regiões de 19 ilhas CpG revelaram hipermetilação com um 
coeficiente de correlação R de Pearson > 0,6 em todas as amostras do grupo de treinamento. 
Correlações significativas associadas à idade também foram observadas na maioria dos dados 
individuais. As regiões CpG da assinatura epigenética da idade estão indicados em cinza. *Uma região 
CpG hipometilada adicional (cg23571857) foi incluída no preditor (KOCH; WAGNER, 2011). 
 
4 CONCLUSÃO 
 
Pelo exposto neste trabalho de revisão bibliográfica conclui-se que é necessário um 
aprimoramento nas ferramentas utilizadas pela genética forense clássica, que utiliza 
marcadores STR validados, como por exemplo, o banco de dados CODIS. Dentre as 
perspectivas de melhorias incluem-se a utilização de mais loci, de marcadores para linhagens 
maternas, como o DNA mitocondrial, marcadores de linhagem paterna, como as regiões Y-
STR e, principalmente, marcadores epigenéticos que possibilitem a diferenciação de gêmeos 
MZ e permitam uma assinatura epigenética da idade biológica. 
Estudos mostraram que uma forma de diferenciar gêmeos MZ o que pode ser 
importante em casos forenses pode ser feita por meio da análise do padrão de metilação em 
algumas regiões CpG e também pela análise das acetilações presentes em aminoácidos de 
proteínas histonas H4 e H3. As regiões promotoras dos genes DRD4, MAOA, SLC6A4/SERT 
são candidatas da assinatura epigenética da idade e podem ser analisadas pelas metilações no 
DNA. 
A idade biológica celular pode ser medida pelo padrão de metilação do DNA 
acumulados durante o envelhecimento causados por fatores ambientais. Os principais genes 
marcadores da correlação entre metilação no DNA e envelhecimento são as regiões 
promotoras dos genes EDARADD, TOM1L1, NPTX2, TRIM58, GRIA2 e KCNQ1DN, que 
são metilados ao longo do envelhecimento. Ao contrário disso, a região promotora do gene 
BIRC4BP apresentou decréscimo na metilação ao longo do envelhecimento. Essas regiões 
podem ser importantes na análise biológica de vestígios em cenas de crime. 
A utilização destas técnicas na ciência forense ainda não é comum, porém podem 
fornecer informações valiosas na busca e julgamento de criminosos em casos que a genética 
forense clássica não pode ajudar. Futuramente, nos casos complexos no qual existir o 
questionamento sobre irmãos monozigóticos ou estágio da vida do suspeito em relação ao 
material biológico da evidência essas técnicas deverão ser utilizadas rotineiramente. 
Laboratórios forenses em todo o mundo serão equipados para realizarem essas aferições, 
conforme as técnicas sejam criteriosamente estabelecidas e menos laboriosas além dos custos 
operacionais se tornarem mais acessíveis. 
 
 
 
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
ALBERTS, B. et al. Cell junctions, cell adhesion, and the extracellular matrix. 2002. 
ALLIS, C. D.; JENUWEIN, T.; REINBERG, D. Epigenetics. New York: John Inglis, 2007. 
502 ISBN 13:978-0-87969-724-2. 
BELL, J. T.; SPECTOR, T. D. A twin approach to unraveling epigenetics. Trends Genet, v. 
27, n. 3, p. 116-25, Mar 2011. ISSN 0168-9525 (Print) 0168-9525. 
BIESECKER, L. G. et al. Epidemiology. DNA identifications after the 9/11 World Trade 
Center attack. Science, v. 310, n. 5751, p. 1122-3, Nov 18 2005. 
BOCKLANDT, S. et al. Epigenetic predictor of age. PLoS One, v. 6, n. 6, p. e14821, 2011. 
BROWN, T. A., 2002. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20821850 >. 
BUTLER, J. M. et al. Forensic DNA typing by capillary electrophoresis using the ABI Prism 
310 and 3100 genetic analyzers for STR analysis. Electrophoresis, v. 25, n. 10-11, p. 1397-
412, Jun 2004. 
CHUANG, J. C.; JONES, P. A. Epigenetics and microRNAs. Pediatr Res, v. 61, n. 5 Pt 2, p. 
24R-29R, May 2007a. 
COLLAS, P.; DAHL, J. A. Chop it, ChIP it, check it: the current status of chromatin 
immunoprecipitation. Front Biosci, v. 13, p. 929-43, 2008. 
DUPONT, C.; ARMANT, D. R.; BRENNER, C. A. Epigenetics: definition, mechanisms and 
clinical perspective. Semin Reprod Med, v. 27, n. 5, p. 351-7, Sep 2009. 
FERNANDEZ, A. F. et al. A DNA methylation fingerprint of 1628 human samples. Genome 
Res, v. 22, n. 2, p. 407-19, Feb 2012. 
FRAGA, M. F. et al. Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins. 
Proc Natl Acad Sci U S A, v. 102, n. 30, p. 10604-9, Jul 26 2005. 
GE, J.; EISENBERG, A.; BUDOWLE, B. Developing criteria and data to determine best 
options for expanding the core CODIS loci. Investig Genet, v. 3, p. 1, 2012. 
GERVIN, K. et al. Extensive variation and low heritability of DNA methylation identified in 
a twin study. Genome Res, v. 21, n. 11, p. 1813-21, Nov 2011. 
GOEDECKE, N. et al. A high-performance multilane microdevice system designed for the 
DNA forensics laboratory. Electrophoresis, v. 25, n. 10-11, p. 1678-86, Jun 2004. 
GOLBABAPOUR, S.; ABDULLA, M. A.; HAJREZAEI, M. A concise review on epigenetic 
regulation: insight into molecular mechanisms. Int J Mol Sci, v. 12, n. 12, p. 8661-94, 2011. 
GOLDBERG, A. D.; ALLIS, C. D.; BERNSTEIN, E. Epigenetics: a landscape takes shape. 
Cell, v. 128, n. 4, p. 635-8, Feb 23 2007. 
HUNTER, P. Anything you touch may be used against you. EMBO reports, v. 11, n. 6, p. 
424-7, Jun 2010. 
KOCH, C. M.; WAGNER, W. Epigenetic-aging-signature to determine agein different 
tissues. Aging, v. 3, n. 10, p. 1018-27, Oct 2011. 
LI, C. et al. Identical but not the same: The value of DNA methylation profiling in forensic 
discrimination within monozygotic twins. Forensic Science International: Genetics 
Supplement Series, 2011. 
MIRANDA, T. B.; JONES, P. A. DNA methylation: the nuts and bolts of repression. Journal 
of cellular physiology, v. 213, n. 2, p. 384-390, 2007. 
RODRIGUEZ-RODERO, S. et al. Aging genetics and aging. Aging Dis, v. 2, n. 3, p. 186-95, 
Jun 2011. 
SANDOVAL, J. et al. RNAPol-ChIP: a novel application of chromatin immunoprecipitation 
to the analysis of real-time gene transcription. Nucleic acids research, v. 32, n. 11, p. e88-
e88, 2004. 
SCHNEIDER, T. D. et al. Stage-specific histone modification profiles reveal global 
transitions in the Xenopus embryonic epigenome. PLoS One, v. 6, n. 7, p. e22548, 2011. 
SMITH, R. G. et al. Advancing paternal age is associated with deficits in social and 
exploratory behaviors in the offspring: a mouse model. PLoS One, v. 4, n. 12, p. e8456, 
2009. 
THOMPSON, R.; ZOPPIS, S.; MCCORD, B. An overview of DNA typing methods for 
human identification: past, present, and future. Methods in molecular biology, v. 830, p. 3-
16, 2012. 
TOTH, Z. et al. Epigenetic analysis of KSHV latent and lytic genomes. PLoS Pathog, v. 6, n. 
7, p. e1001013, 2010. 
VAN MONTFOORT, A. P. et al. Assisted reproduction treatment and epigenetic inheritance. 
Hum Reprod Update, v. 18, n. 2, p. 171-97, Mar-Apr 2012. 
WONG, A. H.; GOTTESMAN, II; PETRONIS, A. Phenotypic differences in genetically 
identical organisms: the epigenetic perspective. Hum Mol Genet, v. 14 Spec No 1, p. R11-8, 
Apr 15 2005. 
WONG, C. C. et al. A longitudinal study of epigenetic variation in twins. Epigenetics, v. 5, n. 
6, p. 516-26, Aug 16 2010. 
YANG, A. S. et al. A simple method for estimating global DNA methylation using bisulfite 
PCR of repetitive DNA elements. Nucleic Acids Res, v. 32, n. 3, p. e38, 2004. 
YOST, J. M. et al. Targets in epigenetics: inhibiting the methyl writers of the histone code. 
Curr Chem Genomics, v. 5, n. Suppl 1, p. 72-84, 2011.