Aula 2 ERITROPOESE

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Transplante halogênico (de uma pessoa para outra)
Para livrar a pessoa da leucemia é preciso uma quimioterapia pesada. (retira tudo que é visível e não visível em uma aspiração- o que está grudado no nicho) e depois uma transfusão para `limpar´ o resto que ficou na medula óssea (MO).
No transplante, é feita uma quimioterapia inicial e depois uma mais pesada, chamada de condicionamento. Esta quimio de condicionamento destrói o nicho, libera enzimas, metaloproteinases, libera complementos que irão destruir as células que seguram a célula tronco (CT) dentro do nicho. 
Dentro do condicionamento também pode ter a radioterapia ou radioterapia com irradiação total (TBI).
Com isso, há o esvaziamento do nicho desse paciente, ficando ele ávido por novas células tronco.
	Como o doador tem um nicho bom, como a medula óssea dele produz tudo direitinho, não faz sentido dar quimioterapia para ele.
É dado fator estimulador do crescimento (produzido naturalmente pelo corpo em resposta ao estresse) que solta as células tronco do nicho. Os Corticoides também ajudam na liberação das células tronco do nicho.
Então, corticoides são combinados com granuloquin (fator de crescimento) para induzir a mobilização das células tronco para o sangue periférico. Com isso, rompe as ligações com o nicho (ao romper o nicho há a permeabilização da barreira que separava a medula óssea do sangue). E a célula tronco sai do nicho e vai para o sangue.
OBS: os corticoides causam leucocitose (sobe os granulócitos).
O doador é colocado no aferes (máquina de coleta). 
O sangue é coletado por uma via separa a célula tronco devolve para o doador pelo outra via. 
Com o sangue coletado é feito uma dosagem de CD34 para verificar se tem célula tronco adequada com o peso do doador.
Esse sangue é transfundido para o paciente que está com o nicho avido por célula tronco. Assim, a célula tronco vai para o nicho e repovoa a medula óssea do doente que fica com a medula óssea normal. Esse é o princípio do transplante.
 	No transplante autólogo, muitas vezes a medula não está doente, as vezes é um linfoma. Assim, é preciso dar uma quimioterapia muito alta para matar a célula que está fora da medula e essa quimio acaba matando a medula. Dessa maneira, a própria célula tronco do paciente é coletada antes da quimio para depois ser recolocada, porque o problema não é na medula dele.
Essa é a propriedade de homing.
É verificado se tem PEGA (quando essa célula começa a se dividir para formar a serie vermelha, seria plaquetaria, branca...) repovoando a medula óssea.
Os mecanismo de integrina, seletina fazem com que a célula tronco fique aderida na rede endotelial. O próprio endotélio cria um gradiente para jogar o SDF1 para dentro (ele também tem receptores de SDF1 na sua superfície). Se é criado um gradiente com SDF1 dentro, a célula tronco é atraída para dentro da medula óssea. 
Na medula óssea as células que secretam SDF1 são as NEST, reticulares, osteoblasto... 
O nicho está cheio de SDF1, por isso que a célula tronco é puxada para o nicho.
Osteoclasto cava o osso liberando cálcio, atraindo a célula tronco para o nicho.
Osteopontina atrai CD44 
Gradiente de O2 também atrai a célula tronco para o nicho
As moléculas do complemento
Quando tem agressão externa, como a quimioterapia ou radioterapia, atrai a CT para o nicho, porque libera os esfingolipides (em termos de estresse). Essa atração por esfinglipides é as vezes até mais potente que o SDF1. Tudo isso localiza a célula tronco na região dela (nicho) que é o endosteo. 
Uma vez localizada no endosteo verifica-se que tem várias amarras, NEST, célula reticular, osteoblasto...que mantêm a célula tronco presa naquela região. Quando preciso a célula tronco é liberada aos poucos... 
OBS: O RANK L ajuda na diferenciação da CT em osteoclasto.
COMO?
O osteoblasto começa a expressar na sua superfície RANK L entra em contato com a CT que se diferencia em osteomacrofago vira osteoclasto.
A CT hematopoiética entrando em contato com RANK L e o fator de crescimento secretado pelo osteoblasto faz com que essa célula se diferencie em osteoclasto. O osteoclasto rompe o sincício-quebra as conexinas CT é liberada.
A CT rompe o sincício diminiu o SDF1 começa a expressar as metaloproteinases rompe a matriz ela pode ser mobilizada para a periferia, pode virar outras células tronco dentro da medula óssea ou se diferenciar em células mais maduras. 
Isso tudo pode acontecer em resposta ao estresse e são os mesmos fatores liberados na medula óssea.
O granulokine destrói osteoblastoinibe nest, inibe todas essas célulasestimula osteoclastosoltando a CT do nicho.
Inibindo as células que agarram o nicho e estimulando as que destroem a matriz a célula solta e vai embora independente do gradiente de cálcio.
Os outros gradientes são mais importantes.
O granulokine estimula a liberação da célula tronco e diferenciação no neutrófilo segmentado (o fator de crescimento de granulocitos).
A célula neurológica tem terminações na região e que em resposta ao estresse perde as amarras, tem receptor de catecolaminaproduz metaloproteinases CT se solta do nicho ativa via de autorenovação inversão do gradiente estimulado pelo adrenalina em reposta ao estresse.
ERITROPOESE – desenvolvimento da série vermelha 
Hemácia(HC) = eritrócito
ERITROPOESE é o processo de produção das hemácias
A produção de HC é de 200 milhões por dia feita pela medula óssea. 
O nosso papel é manter a hemoglobina constante. A Hb transporta oxigênio para os tecidos
Sem hemácia suficiente não há o transporte de Hb suficiente, nem de oxigênio nos tecidos, podendo surgir sinais de anemia e hipóxia, isquemia e outras coisas.
Vida de uma hemácias são 120 dias, ao longo da vida útil ela `anda` 480 km no nosso organismo.
E para manter o equilíbrio a taxa de produção/dia é igual a taxa de destruição/dia.
As hemácias morrem no sistema fagocítico mononuclear do organismo.
Essa produção/destruição diária dá mais ou menos 0,83% da nossa massa eritrocitária.
Os valores de hemoglobina normal vão variar de acordo com a idade:
Recém-nascido tem nível mais alto
Gestante tem nível mais baixo, porque ela fica inchada, retém liquido e aumenta o volume plasmático do Fe, então é uma anemia dilucional, não é uma anemia real.
A mulher tem o nível mais baixo que o homem por causa da menstruação. 
O desenvolvimento do nosso sangue começa pela série vermelha. Começa no saco vitelino (hematopoese primitiva ou extramedular) fígadobaçosó depois para a medula óssea (hematopoese definitiva).
Nas crianças, há medula óssea nos ossos longos e com o passar do tempo vai sendo substituída por medula óssea amarela. Na vida adulta, só terá medula óssea vermelha na epífise de ossos longos, no esterno, nas costelas (Eritropoese normal ocorre no esterno, na epífise dos ossos longos...)
Em estados patológicos, pode haver a produção de MO em outros locais: eritropoese (para a serie vermelha) / hematopoese (para todas as series) extramedular.
Talassemia- defeito genético na formação da globina, componente de hemogloblina, ou seja não tem Hb com formação adequada.
 O paciente talassemico passa a ter anemia hemolítica por mal formação das globinas. Assim, a medula óssea tenta aumentar a sua produção para compensar a periferia, mas há o crescimento de medula óssea dentro dos ossosexpandindo os ossoscausando deformidade óssea.
 Na talassemia major a mutação é tão grande que a MO acaba produzindo, mas não consegue maturar direito e a serie vermelha acaba morrendo dentro da MO. Então, há uma hematopoese aumentada, mas ineficaz.
 Nas outras talassemia, com mutações menores o corpo consegue fazer essa compensação.
Porém, os antigos órgãos que produziam MO voltam a produzir, por exemplo: o fígado (hepatoespleniomegalia) e o baço ficam gigantes. Essas massas perivertebrais passam a produzir MO para compensar a anemia (hematopoese extramedular).
 Outrasdoenças que infiltram a MO também podem fazer hematopoese extramedular, por exemplo: fibrose na MO, cicatriz na MO ou qualquer coisa que invada a MO cronicamente. 
A primeira alteração é a deformidade ósseadepois que começa a hematopoese extramedular (nem sempre consegue compensar a anemia e no talassemico major o tamanho do baço passa a prejudicar outras regiões do corpo e com o tempo tem mais efeito colateral, por exemplo: o estômago passa a ser comprimido pelo tamanho do baço.) 
Tratamento: como a deformidade óssea é causada pela anemia, então o tratamento indicado é a transfusão de sangue. Porém, a transfusão causa sobrecarga de Fe no organismo, que é toxico no nosso organismo. O outro tratamento possível é o transplante de medula. Hoje, também tem aconselhamento genético que pode ser indicativo de aborto quando descobre que o feto tem talassemia.
A transfusão para o talassemia em casos graves já não é eficaz pelo tamanho do baço e do fígado que passam a reter muito sangue e as hemácias se apertaram para passar nos sinusoides, assim, o sangue periférico tem hemácias nucleadas e dacriocitos (hemácias em lagrimas por tentar passar nos sinusoides).
As síndromes mieloproliferativas crônicas são defeitos das CT da MO:
Policetemia vera (PV)- aumenta principalmente a série vermelha, mas também afeta as outras.
Trombocetemia essencial (TE)- privilegia o aumento das plaquetas.
Leucemia mieloide crônica (LMC)- aumenta principalmente a série granulocítica (leucocitose).
Essas três cronicamente tendem a formar fibrose na MO e tem potencial de evoluir para a mielofibrose, que pode ser secundária a ela ou uma mielofibrose primaria.
Mielofribrose primária- defeito da CT que a MO óssea começa a produzir fibrose medular. Com a ocupação de fibrose da MO há a saída de célula imaturas da MO. As células imaturas povoam os outros órgãos e o baço, por exemplo, começa a produzir o sangue. O baço começa a jogar direto na sangue as células imaturas-> desvia a esquerda (células imaturas no sangue). 
Então, um paciente que chega com desvia a esquerda, hepatomegalia, anemia e dacriocitos tem chances de ter a mielofibrose.
Essas são as principais síndromes mieloproliferativas crônicas.
Sempre que tem um estado compensatório	
Anemia hemolítica autoimune: quando há autoanticorpos contra a hemácia e ao invés de durar 120 dias ela dura menos (por exemplo 20 dias). 
A HC é retirada da circulação precocemente.
Como o defeito não está na MO, ela começa a produzir mais e observa-se no mielograma um aumento da série eritroide na MO. 
A série eritróide vai maturando até produzir uma pré-hemacia: reticulócito. O reticulócito vira hemácia. 
O aumento do reticulócito é um parâmetro do sangue periférico que a anemia é por excesso de destruição e não por defeito de produção.
A eritropoese começa na CT com o progenitor mielóide comumorigina dois progenitores: eritróide e megacariocítico.
O mesmo progenitor que origina a serie vermelha origina a série plaquetária (série megacariocitica). 
Esse progenitor vai se dividindo para a unidade formadora de colônias (CFU) →BFU (parece uma explosão de células) → CFU→ Normoblasto → eritroblasto basófilo → eritroblasto policromatófilo → eritroblasto ortocromático → reticulócito → eritrócito.
 
Qual a primeira célula comprometida com a linhagem eritróide?
- O BFU
Compartimento de ÉRITRON
É um compartimento de células morfologicamente identificáveis, portanto, células precursoras (de próeritroblasto até hemácia), onde é possível contar e fazer uma avaliação geral da MO.
 
O citoplasma é cheio de RNA (azul) que é usado para hemoglobinizar. Então, do azul vira rosa (rico em hemogloblina).
O núcleo é condensado e fechado até que o núcleo é expulso do eritroblasto. Essa enucleação favorecer o alcance da microcirculação.
Para que ocorra esse processo é ligado e desligado alguns genes. Liga os gene de hemoglobinização (GATA), o EPO-R (receptor de eritropoetina), EKILF (ajuda a troca da hemoglobina fetal pela a adulta).
Hemácia nucleada dentro da MO pode significar reação da MO ao estresse, uma hemólise, mas pode ser que a MO esteja ocupada por alguma coisa, por exemplo: fibrose (quando a MO está reacional ela aumenta muito a produção e joga essas células para fora antes do normal).
O reticulócito forma hemoglobina com RNA que ele tinha (não produz mais RNA, porque está sem núcleo). Os reticulócitos são classificados de acordo com a quantidade de RNA que ele possui e quando ele perde todo o RNA ele vira hemácia.
O gene ativado para compensar o núcleo é a histona desacetilase (HDAC 2)é ativado de forma a condensar o DNA e reduzir a atividade nuclear, para atividade nuclear e ajuda na expulsão do núcleo.
Eritroblastos são hemácias nucleadas.
Dentro da MO tem o macrófagos ilhas de eritroblasto em volta do macrófago.
O macrófago faz conexões com proteínas eritroide macrofágica(EMP), integrinas (ajudam na ligação do eritoblasto com o macrófago). Essa ligação dá estimulo para o eritroblasto soltar o núcleo para dentro do macrófago.
Esse estímulo ocorre dentro da MO e o macrófago digere esse núcleo dentro da MO. 
Dentro do eritroblasto ocorre a divisão assimétrica que é estimulado por miosina do eritrócitoempurra o núcleo para um lado da célula e o outro lado da célula fica com o citoplasma. 
Nessa divisão assimétrica algumas proteínas estruturais da membrana vão sendo alteradas (alfa e beta ...) e a fosfatidilcerina é exposta. Com tudo isso, a fosfatidilcerina dá um sinal para o macrófago digerir o núcleo. O outro lado expõe o CD47 (se liga ao macrófago inibindo que ele seja comido pelo macrófago).
Pirinócito: núcleo isolado.
O macrófago serve como lixeiro para digerir esse núcleo solto pelo eritroblasto ortocromático (EO).
Os reticulócitos são liberados no sangue e terminam seus amadurecimento no próprio sangue 1 dias após sua `secreção` da MO. (ficam na MO uns 3,5 dias).
A medida que caminha do endosteo para o vaso para soltar a hemácia, esse processo vai acontecendo e começa a ter uma dependência de eritropoietina(EPO).
As hemácia nucleadas (normoblasto) ou eritroblasto não costumam aparecer no sangue periférico, quando aparecem são chamadas de reação eritroblástica/ eritroblastose ou eritroblasto circulantes.
Quando isso ocorre pode ser sinal de:
- algum estimulo no sangue periférico atraindo (hemólise, estresse, quimioterapia, assepsia). 
- alguma coisa ocupando a medula óssea expulsando a MO. (fibrose, leucemia, linfoma,etc).
O eritroblasto já tem hemoglobina, então a oxigenação dos tecidos ocorre.
Na MO tem proeritroblasto (citoplasma azulado, rico em RNA, não hemoglobinizou ainda, núcleo menos condensado)
O eritroblasto ortocromatico (EO) constuma ser o primeiro a ser jogado na periferia.
A dosagem tem que ficar entre 2 a 4 dos granulócitos(serie branca) para 1 da serie vermelha
 Granulócitos/eritrócitos (G/E)
Anemia hemolítica (pode ser autoimune ou não, pode ser defeito de membrana ou um autoanticorpo para sua hemácia-> estimula a MO) - tende a aumentar a serie vermelha e a relação G/E tende a ficar invertida. 
Como o reticulocito matura?
- Solta pedaços da membrana dele por vesiculação nessas vesículas tem o receptor de transferrina que vai ser importante para a captação do ferrocom o tempo ele vai soltando e perdendo esses receptores e formando hemácias (durante esse tempo deve ser captado toda a Hb que ele precisa).
O resto de coisas dentro da hemácia (núcleo, RNA, Fe) vão sendo tirados pelo baço esse processo é chamado de culling.
Numa hematopoese de estresse, as vezes não dá tempo de tirar esses restinho que ficam na hemácia, então pode ter pontilhado basófilo, corpúsculo de Howell-jolly, grânulos de Fe (corpúsculos de Pappenheimer), restinhos de hemoglobina (corpúsculos de heinz).
A presença desse restos é sinal que o baço não funcionando direito. As causas pode ser por acidente de carro, onde o baço parou de funcionar ou em situação de estresse que não dá tempo de limpar corretamente.A retirada do baço tem risco de assepsia, mas não tem grande repercussão para o paciente.
RETICULÓCITOS
Os reticulócitos determinam a capacidade funcional da MO, ajudam a investigar a causa de uma anemia e avaliar se tem um tumor infiltrando a MO, uma fibrose (os reticulócitos não conseguem ser produzidos), anemia hemolítica, sangramento (muito reticulócito).
Reticulócitos elevados = medula óssea funcionante e hiperestimulada (ex: sangramento, hemólise,...)
Se houver anemia diz-se anemia hiperproliferativa
Reticulócitos baixo = medula não funcionante ou hipoativa. (ex: leucemia, fibrose medular, aplasia, deficiência de ferro, deficiência de B12 ou folato...)
Se houver anemia diz-se que a anemia é hipoproliferativa
É necessário corrigir o reticulócito para saber se a anemia está sendo compensada.
Contagem de reticulócitos corrigida = ret (%) x hematócrito/45
ou 
Contagem de reticulócitos corrigida = ret (%) x hemoglobina/15
A correção do reticulócito verifica se ele está vivendo mais (não é que está tendo uma produção maior). Ele está vivendo mais tempo na periferia, então tem que corrigir para o nível de Hb, para a meia vida mais longa dele.
As hemácias são removidas pelo sistema fagócitico mononuclear (baço, fígado,MO...).
Eritropoese ineficaz- hemácia produzida e destruída dentro da MO.
Doenças que tem eritropoese ineficaz e consequentemente reticulócitos baixo:
Talassemia major (defeito na formação da Hb) 
Anemia megaloblástica (deficiência da vitamina B12, usada para formar o DNA da hemácia) - células acabam morrendo dentro da MO.
Na eritropoese ineficaz:
- Reticulocitos baixo
- Alteração morforlogica na sincronia da formação do núcleo e citoplasma (as vezes núcleo muito condensado, citoplasma ainda azul, carioteca- restos nucleares, fragmentação do núcleo)
hiperplasia eritróide + reticulócito corrigido baixo
Diseritropoiese:
Assincronismo de maturação N/C
Lobulação nuclear
Cariorrex
Fragmentação nuclear
Pontes internucleares
Multinuclearidade
Excrecências citoplasmáticas
Vacuolização citoplasmática
Pode haver elevação de bilirrubina indireta
A esplenectomia aumenta a vida das hemácias?
Em condições normais não
Em doenças como a esferocitose e a talassemia sim
Não funciona na falciforme, pois a destruição aumentada é hepática
Como os macrófagos identificam que a hemácia está velha?
Mecanismo de senescência da hemácia 
Ela começa a modificar as proteínas de membrana, por exemplo a Banda 3, começa a se agrupar e formar neoantigenoOs anticorpos reconhecem a banda 3 agrupada e o anticorpo com receptor no macrófago hemácia retirada da circulação.
 Os componentes da hemácias são reaproveitados para voltar a produzir o sangue.	
Como ocorre o estimulo para diferenciar a CT nas hemácias?
Inicialmente, tem o estímulo de interleucina 3, gene CSF, fatores de crescimento.
Hormônio eritropoietina- produzido nos rins e tem um pequeno percentual no fígado.
 Nos rins tem um sensor de O2 no tecido renal. Se há anemia, não há o transporte Hb com O2 suficiente. O sensor de O2 renal identifica isso.
A resposta mais eritropoetina receptor BFU, CFU, proeritroblasto estimula a proliferação da série vermelha(maturação).
Dois tipos de BFU:
- com receptor para outros fatores de crescimento (independente de eritopoetina)
- receptor para eritropoietina
CFU- só consegue proliferar com a série vermelha (totalmente dependente do hormônio eritropoietina-EPO)
O excesso de EPO pode ser:
- tumores renais (produtores de EPO)
-situações de baixa de O2 (altitude boliviana, cardiopatia crônica)
-defeito na CT
EPO- ativa genes internos para fazer diferenciação da célula, genes de síntese de Hb, síntese de ptn de membrana, genes que inibem a apoptose –morte dentro da medula. 
EPO-R = receptor de EPO
Via de JAk 2 com ativação do STAT 5 ativa a BCLX-L (gene antiapoptótico)
Gene de receptor de transferrina proteína que traz ferro (componente da Hb) para dentro da HC.
Ativa toda a maquinaria para proliferar a serie vermelha. 
Ausência de eritropoetina ou receptor de EPO gera falha da eritropoese definitiva/ terminal.
EPO-R tem um domínio transmembrana
Região proximal que estimula a proliferação e uma região que inibe o domínio proximal 
No domínio proximal tem o JAK2 – diferenciação eritroide
Região terminal
 SHP1- inibe o JAK 2
Defeito na CT que mantem o JAK2 sempre ligado. A HC prolifera demais defeito na policetemia vera.
96-99% tem mutação do JAK 2
Mutação no domínio terminal que inibia o JAK2 policetemia 
 EPOEPO-R receptor sofre dimerização autofosforilação no domínio do JAK2 fosforila a STAT 5núcleo ativa as vias de proliferação celular, diferenciação, inibição de apoptose proliferar a serie vermelha sem ela morrer.
Mecanismo inibitórios:
SHP, SOX, proteínas que inibem a proliferação 
Se tiverem mutadas podem ajudar no quadro de policetemia
A EPO é necessária para a proliferação, mas não é suficiente sozinha porque tem essas outras vias.
vias.
**CAI NA PROVA -- Mecanismo principal de resposta:
Situação de oxigênio normal (normoxia)
 Fator induzido por hipóxia (HIFα) vai sofrer uma prolilhidroxilação vai se juntar ao fator de von wipel****VERIFICAR ubiquitinação degradação
Situação de hipóxia 
O fator não sofre hidroxilação, não consegue se juntar ao fator de von... não é degradado
Ativa o gene da EPO passa a secretar eritropoietina em resposta a hipóxia.
É assim que ocorre o estimulo da EPO no rim.
↑eritropoetina ↑ série vermelha
Hipóxia com um paciente cardiopata ↑ EPO
Existe influência da EPO na CT (influência indireta) reduz o osso trabecular downregula o CXCL4 solta a CT do nicho consegue diferenciar CT entra no ciclo celular gerar hemácia.
Fatores que vão influenciar na diferenciação eritróide:
 GATA 2
SCL
MNO2
Ativação do GATA (participa da ativação do gene de formação de Hb) vai ajudar a diferenciar no sentido da série eritroide.
BCL2 gene antiapoptotico
Serie de genes que são necessário para a eritopoese, alguns para diferenciação outros para a maturação.
EKLF1- troca da Hb fetal pela a adulta
A EPO é o papel principal na proliferação e maturação da celular eritroides.
Interleucina 3, microRNA,fator estimulador de crescimento...
A serie vermelha responde ao estresse estimulando eritropoese (tem receptor de glicocorticoide)
A resposta ao estresse pula as divisões/etapas para responder mais rápido célula maior com VCM (volume corpuscular médio) maior.
Os linfócitos T grande granulares (CD8+) são supressores da eritropoese inibem o BFU
Ex: leucemia de linfócitos large granulares tem anemia.
INF γ inibem hematopoese
TGF acelera a diferenciação 
BFU é anterior ao CFU
A medida que ocorre a maturação adquire antígenos que identificam a série vermelha.
A medida que matura:
Diminui o potencial proliferativo
Diminui o potencial de autorenovação
Aumento o acometimento de linhagem, de diferenciação na linhagem
diminui a circulação em sangue periférico 
aumento o receptor de EPO
dimunui o receptor de maturidade como o CD34, HLADR...
aumento os antígenos de linhagem específicos como o CD36, glicoforina
começa a apresentar os grupos sanguíneos na superfície do eritrócito 
Com esses passos é possível identificar em que ponto da maturação está o eritroblasto. (com o antígenos)
Hb=9 Normal= 12
Como estão os reticulócitos?
Alto – segura a transfusão, que a pessoa está recuperando. 
Baixo – transfusão