4._Prática_3_Coloração_de_Gram

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PAREDE CELULAR E COLORAÇÃO DE GRAM
Preparo
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Executar a técnica de coloração de Gram. 
Relacionar a composição química da parede celular das bactérias com os corantes de Gram. 
Determinar e interpretar o mecanismo de reação de Gram, como um método de coloração diferencial.
Objetivos
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Parede Celular dos Procariotos
Funções
Manter a forma da bactéria
Proteção das alterações do ambiente externo
Prevenir a ruptura da célula em situações adversas
Ponto de ancoragem para os flagelos
Utilizada para diferenciar bactérias
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Estrutura das paredes celulares (PC) de procariotos:
Diferenças na constituição das PC de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
Parede celular atípicas: Mycoplasma e Archaea
INTRODUÇÃO
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Parede Celular de Gram-positivas
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COMPONENTES ESPECIAIS DA PAREDE CELULAR DAS BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS
LIPOPROTEÍNA
estabilizar a membrana externa e fixá-la à camada de peptideoglicana.
 MEMBRANA EXTERNA 
Possui canais especiais protéicos (porinas) permitem a difusão passiva de compostos hidrofílicos de baixo peso molecular.
Barreira para certos antibióticos, enzimas, detergentes, etc.
 Mais suscetíveis ao rompimento mecânico
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Membrana Externa (Gram-Negativas)
Lipopolissacarídeos (LPS), lipoproteínas, fosfolipídeos
Delimita o periplasma
 Porinas: canais p/entrada e saída de substâncias hidrofílicas de ↓ peso molecular
Proteção contra fagócitos, sistema complemento e antibióticos
http://www.grupoa.com.br/tortoramicrobiologia10ed/m/ani/virulence_endotoxins.swf
Diferentemente da membrana celular, ela não possui somente fosfolipídeos, mas também polissacarídeos e proteínas
LIPOPOLISSACARÍDEOS
Lipídio ‘A’  proporciona barreira contra moléculas hidrofóbicas e funciona como endotoxina.
Antígeno ‘O’  determinante antigênico. Ex: E. coli O157:H7
ESPAÇO PERIPLASMÁTICO
Espaço compreendido entre membrana externa e interna
Proteínas de ligação para substratos específicos, enzimas hidrolíticas que degradam substratos não transportáveis, enzimas detoxificantes.
Composição da Membrana Externa 
O LPS também tem propriedades tóxicas
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Parede Celular de Gram-negativos
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Parede celular de Gram-negativas
Parede celular de Gram-positivas
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Fonte: Madigan et al., 1997.
Bacillus subtilis
Escherichia coli
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Técnicas de coloração diferencial
São empregados 2 corantes que vão gerar colorações diferentes em grupos distintos de bactérias.
São usados para: 
separar diferentes grupos de bactérias 
visualizar estruturas particulares de alguns grupos bacterianos.
Ex: coloração de Gram, Coloração Ácido-Resistente e coloração de endósporos.
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Coloração diferencial de GRAM
A coloração de Gram é o método bacterioscópico mais importante e mais utilizado atualmente na bacteriologia 
 Sua finalidade é a classificação de micro-organismos com base em suas características tintoriais, tamanho, forma e arranjo celular.
A técnica de coloração de Gram geralmente respeita um protocolo de ações que a padroniza.
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Coloração diferencial de GRAM
Desenvolvida por Hans Christian Gram em 1884, esse procedimento separa as bactérias em dois grupos: Gram-positivas e Gram-negativas.
Baseia-se em diferença na composição da parede celular.
São usados 4 reagentes:
Cristal violeta
Iodo
Etanol 95% ou solução etanol-acetona
Safranina ou fucsina
Resultado da coloração:
Gram-positivas: púrpuras (roxo).
Gram-negativas: vermelhas.
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Esfregaço a partir de cultura em meio líquido
Tomar o tubo com a cultura em meio líquido:
Agitar levemente a cultura;
Retirar o tampão de algodão com o dedo mínimo e flambar a boca do tubo;
Introduzir a alça até tocar o meio e retirá-la após coletar uma gota da suspensão;
Flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampão de algodão.
Transferir o inóculo coletado na alça para o centro da lâmina e espalhá-lo com movimentos de rotação.
Deixar o esfregaço secar naturalmente, nas proximidades da chama.
Para fixar o esfregaço, passar a lâmina pela chama lentamente por no mínimo 3X.
PROCEDIMENTO
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Esfregaço a partir de cultura em meio sólido
 Procedimento anterior
Colocar uma pequena gota de solução fisiológica com auxílio da alça de platina ou pipeta Pasteur na lâmina para confeccionar o esfregaço.
Espalhar o material retirado da cultura em meio sólido na gota com movimentos circulares.
Deixar o esfregaço secar naturalmente, nas proximidades da chama.
Não assopre o esfregaço ou balance a lâmina ao ar, pois outros micro-organismos podem contaminar a sua amostra!
PROCEDIMENTO
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Para fixar o esfregaço, passar a lâmina pela chama lentamente por no mínimo 3X.
Fazer esfregaço bem homogêneo, fixar pelo calor e deixar esfriar;
Lembrar: Toda a atenção é necessária quando se trabalha com a chama e as culturas de micro-organismos. Evitar as conversas paralelas. Caso tenha dúvidas, chamar o professor ou os monitores.
PROCEDIMENTO
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Como fazer a coloração de Gram?
Antes de iniciar a coloração, assegure-se de que o esfregaço esteja seco. 
Para fazer a coloração, siga os seguintes passos:
	Cubra o esfregaço com Cristal Violeta e deixe por aproximadamente 1 minuto;
Após este passo, todas as células ficam coradas com o cristal violeta (corante primário).
	Escorra o corante e lave em um filete de água corrente.
	Cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) 
 Deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
PROCEDIMENTO
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Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;
	O iodo da solução de Lugol forma um complexo insolúvel com o corante primário. O complexo cristal violeta-iodo (CV-I) tem uma cor mais intensa (violeta escuro) do que o CV livre e é mais difícil de remover das células. 
Adicione álcool etílico (95%) sobre a lâmina; deixando cair a solução de álcool gota a gota sobre a preparação, descorando-a, até que não desprenda mais corante;
	Este é o passo chave na diferenciação entre bactérias Gram negativas e Gram positivas. As primeiras perdem o complexo CV-I e as últimas retêm-no. As células de bactérias Gram positivas ficam, pois, coradas de violeta-escuro e as Gram negativas ficam incolores.
PROCEDIMENTO
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6. Lave em um filete de água corrente;
7. Cubra a lâmina com fucsina e deixe agir por aproximadamente 1/2 minuto;
	As células incolores de bactérias Gram negativas ficam coradas de cor-de-rosa (cor do contra-corante fucsina).
8. Lave em um filete de água corrente;
9. Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo.
PROCEDIMENTO
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MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM
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SEQUÊNCIA DE PROCEDIMENTOS UTILIZADOS NA COLORAÇÃO DE GRAM. 
Core o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto. 
(B) Remova o corante com água corrente. 
(C) Coloque a solução de Lugol sobre o esfregaço durante 1minuto. 
(D) Remova a solução de Lugol com água corrente. 
(E) Lave o esfregaço com etanol 95%. 
(F) Remova o etanol com água corrente. 
(G) Adicione a fucsina durante 30 segundos. 
(H) Remova a fucsina com água corrente. 
Seque com papel filtro 
(Fonte: Vermelho et al., 2006).
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Gram-positivas
Gram-negativas
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APÓS COLORAÇÃO DE GRAM, LEVAR AO MICROSCÓPIO E
 REGISTRAR AS OBSERVAÇÕES
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Princípio da Coloração de Gram
Baseia-se na diferença de composição da parede celular (PC) e na capacidade dessa PC de reter o corante.
As células se coram pelo cristal violeta associado ao iodo (CV-I). Esse complexo se liga a componentes da parede celular de Gram-positivas e é de difícil remoção.
O álcool-acetona serve para descorar, uma vez que age dissolvendo os lipídeos e desidrata as células.
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Princípio da Coloração de Gram
Gram-positivas tem PC mais espessa= complexo CV-I não pode ser removido.
Gram-negativas após lavagem com álcool tem a camada externa de lipopolissacarídeos rompida = complexo CV-I é removido.
O álcool-acetona serve para descorar, uma vez que age dissolvendo os lipídeos e desidrata as células. As células descoradas sofrem ação do contra-corante.
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