diagnostico molecular

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Alternative Molecular Methods for Improved Detection of
Meningococcal Carriage and Measurement of Bacterial Density
Introdução
A infecção com Neisseria meningitidis geralmente é caracterizada por
assintomático ou minimamente sintomático, transporte de bactérias
na faringe; septicemia meningocócica e / ou meningite é uma
evento raro ocorrendo em apenas 1/100 a 1 / mil colonizados
indivíduos. Por esta razão, a pressão seletiva induzida pelos antimicrobianos
ou por imunidade naturalmente adquirida ou induzida por vacina é
exerceu principalmente sobre bactérias transportadas por transportadores assintomáticos.
Portanto, a epidemiologia das infecções meningocócicas não pode
ser entendido sem considerar transportadoras (1, 2).
O transporte de N. meningitidis é relativamente incomum e, portanto,
Determinar a prevalência do transporte exige pesquisas em larga escala (3),
que geralmente são conduzidos usando técnicas microbiológicas
desenvolvido há várias décadas. Detecção de transporte meningocócico
envolve três etapas principais que poderiam ser melhoradas, isto é,
amostragem, transporte para o laboratório e identificação de
de meningococos. A maioria dos estudos focados na otimização
Métodos para a coleta de esfregaços faríngeos; esses estudos têm
mostrou que um cotonete peroral tomado atrás da úvula é mais provável
produz um resultado positivo e aumenta o aumento de dois esfregaços sequenciais
sensibilidade (4-6). Até recentemente, pouco foi feito para
melhorar os métodos de transporte (7, 8), e estamos cientes de apenas dois
estudos destinados a melhorar a identificação de meningococos por
usando métodos moleculares (9, 10). Teste de PCR no DNA extraído
diretamente de um cotonete tem sido empregado em alguns estudos, mas um
Pesquisa recente de adolescentes do Reino Unido mostrou que esse método
foi menos sensível do que a cultura padrão seguida por PCR (11).
Desenvolvemos dois novos métodos para detectar meningococos
transporte, análise molecular do DNA extraído obtido após a cultura durante a noite no caldo de Todd-Hewitt (THB) ou de um
papel de filtro em que um swab foi pressionado e comparado o
resultados obtidos por esses métodos para aqueles obtidos por convencional
microbiologia e confirmada por PCR em um estudo sobre meningococos
transporte em 999 escolares gambianos.
Materiais e métodos
MATERIAIS E MÉTODOS
Estudo de design e participantes. Após a sensibilização da comunidade,
e com permissão das autoridades educacionais, uma seção transversal
A pesquisa de transporte foi realizada de 1 a 30 de julho de 2013, o início de
a estação chuvosa, em crianças que frequentam escolas de ensino médio ou secundário no
área periurbana de Fajikunda, Gâmbia, África Ocidental. Escola saudável
Os participantes entre 10 e 18 anos foram recrutados sequencialmente até
1,000 foram matriculados. Nenhuma criança ou pais convidados a participar do estudo se recusaram a participar. O consentimento esclarecido e escrito foi obtido a partir de 18-
estudantes de um ano de idade. Consentimento assente e por escrito de um dos pais ou responsável
foram obtidos de estudantes de 10 a 17 anos. Um questionário que
investigaram possíveis fatores de risco para o transporte de meningococos.
para todos os participantes. Foram coletados três esfregaços faríngeos
de cada aluno na mesma ocasião. Um cotonete foi marcado diretamente
em uma placa de agar selectivo Thayer-Martin, um segundo foi colocado em THB,
e um terço foi manchado em uma tira de papel de filtro. Crianças foram randomizadas
antes da coleta das amostras para um dos três grupos, o que indicava
a ordem em que as três amostras foram coletadas (Fig. 1), para
Certifique-se de que o primeiro, segundo e terceiro esfregaços tiveram a mesma chance de ser
testado por cada um dos três métodos laboratoriais.
O estudo foi aprovado pelo Comitê Científico de Coordenação de
unidade do Conselho de Pesquisa Médica (MRC), Gâmbia; pelo gambiano
Comitê de Ética Conjunta do Governo / MRC; e pelo Comitê de Ética
da London School of Hygiene & Tropical Medicine.
Microbiologia convencional. Os métodos convencionais empregados para
identificar N. meningitidis pelo Consórcio MenAfriCar foram descritos em
detalhes anteriormente (12) e são relatados brevemente aqui. Os swabs foram estriados
diretamente sobre uma placa de agar seletiva Thayer-Martin seletiva no campo,
e os pratos foram mantidos em um jarro de CO2 de 5% até serem transportados para o
Laboratório dentro de 6 h da coleção. Após 24 h de subcultura no chocolate
placas de ágar, um teste de oxidase e uma coloração de Gram. Todos os oxidasepositivos,
Os diplococos Gram-negativos (OPGNDC) foram testados quanto a-galactosidase
atividade com orto-nitrofenil-D-galactopiranósido (ONPG),
para a atividade da glutamiltransferase (GGT) e para a esterase de butirato (tributação)
atividade. ONPG-negativo, GGT-positivo, bactéria tributyrin-negativa
foram serogruposados ​​por aglutinação de slide, inicialmente com o serogrupo A e
W e, se negativo, com anti-soro de serogrupo X e Y. DNA
foi extraído de todos os isolados OPGNDC por extração com um kit Qiagen de
uma suspensão bacteriana fervida por 20 min e depois testada por multiplex
PCR em tempo real (RT-PCR) conforme descrito abaixo. Na microbiologia convencional
grupo, isolados de OPGNDC que eram ONPG negativos, GGT positivos,
e tributyrin negativo e também PCR positivo (ver abaixo) foram considerados
para ser isolados de N. meningitidis.
Cultura do caldo. Antes do estudo de campo, a capacidade de duas culturas de caldo
para apoiar o crescimento de N. meningitidis foi testado usando alíquotas
cravado com diluições em série de uma estirpe de referência do serogrupo A (ATCC
13077), começando com uma diluição de? 1.200? 108 UFC por ml. O primeiro
O teste de teste médio foi Mueller-Hinton (MHB, Oxoid, Basingstoke,
UK) suplementado com VCNT (contendo vancomicina [3 mg / litro],
colistina [7,5 mg / litro], nistatina [1,250 U / litro] e trimetoprim [5 mg /
litro]) (número de catálogo SR0091E; Oxoid). O segundo meio investigado
foi THB (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) suplementado com 0,5% de fermento,
soro de coelho (B & K Universal Ltd., Grimston, East Yorkshire, Reino Unido) para facilitar
pré-incubação antes da chegada ao laboratório, e o mesmo antibiótico
combinação como a descrita acima. O DNA foi extraído de
culturas de caldo usando um kit Qiagen de acordo com o fabricante
instruções (com eluição em 200? l). Todd-Hewitt médio suportado
crescimento bacteriano em diluições mais altas do que o caldo Mueller-Hinton (Tabela
1), e este meio foi usado no estudo de campo.
Cartões de papel de filtro. A capacidade das tiras de papel de filtro (FTA MiniCard,
número de catálogo WB 120055; Whatman) para preservar o DNA de N. meningitidis
antes da extração de DNA foi explorada no laboratório usando serial
diluições de uma suspensão de uma estirpe de referência meningocócica do serogrupo A
(ATCC 13077); Amostras com diferentes diluições de bactérias
A suspensão foi manchada em tiras de papel de filtro e mantida à temperatura ambiente
(18 ° C a 23 ° C) durante 48 h antes das extrações de DNA utilizando um kit Qiagen.
Em seguida, a eluição foi feita duas vezes com um volume de 25? L, um volume menor do que
o volume habitual de 200-? l, para concentrar o DNA. No laboratório,
foi possível detectar? 1 N. meningitidis por A cópia do gene por RT-PCR. Dentro
O campo, um cotonete foi manchado diretamente em uma MiniCard, que foi realizada em
temperatura ambiente durante várias semanas antes da extração. No campo, um
o cotonete foi manchado diretamente em uma MiniCard, que foi mantida no quarto
temperatura de 6 a 12 meses antes da extração, como é sabido que
O DNA coletado em cartões FTA pode ser preservadopor anos à temperatura ambiente.
Ao usar um soco, um pequeno segmento do papel de filtro (? 6 mm em
diâmetro) foi obtido a partir do centro do esfregaço, e o DNA foi extraído
como descrito acima. Uma segunda amostra foi obtida tão perto quanto
possível ao centro e testado usando o mesmo procedimento, como foi
considerou que as bactérias poderiam ter sido concentradas fora do centro quando
o cotonete foi comprimido na MiniCard.
Multiplex RT-PCR para detecção de N. meningitidis. Detecção de N.
meningitidis foi realizado visando os genes porA e sodC
e a região intergenica nula da cápsula (cnl) simultaneamente. Genogrupo
de todas as amostras positivas de PorA e / ou CC, consideradas N. meningitidis,
foi feito de acordo com um método desenvolvido anteriormente por Wang et al. (13)
para os genogrupos A, W e Y, seguidos pelos genogrupos B, C e X. Todos
amostras de N. meningitidis que não poderiam ser caracterizadas desta forma
sofreu uma PCR multiplex para genogrupos H, E e Z (ver Tabela S1 em
o material suplementar). As condições de ciclismo eram as mesmas para todos
testes: 1 ciclo de 2 minutos a 50 ° C, 1 ciclo de 10 min a 95 ° C e 50 ciclos de 15
s a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. O ciclador rápido ABI 7500 foi usado para executar
a reação e os resultados foram analisados ​​usando 7500 softwares rápidos.
As amostras foram mantidas a 4 ° C após a amplificação. Tanto para o exame de
Amostras THB e confirmação por PCR de isolados obtidos por convencional
métodos microbiológicos, um ciclo de limiar rigoroso (CT) de 25 foi
usado para os genes porA e sodC para selecionar verdadeiros positivos. Este limiar
mostrou-se ideal em comparação com controles positivos diluídos
em diferentes concentrações e plotadas em curvas padrão. Para genogrupo
PCR multiplex, a TC convencional de 35 foi utilizada como
limiar de positividade e amostras com valores entre 36 e 40
foram novamente testados após diluição de 10 vezes de acordo com o método descrito
anteriormente, por Wang et al. (13). Para teste de papel de filtro, usando positivo
controles em diferentes diluições plotadas em curvas padrão, melhores resultados
foram obtidos com o por-monoplex RT-PCR do que com o multiplex
PorA-sodC-cnl ensaio durante a nossa avaliação preliminar, e, portanto, nós
usado apenas por A monoplex RT-PCR durante o estudo de campo, com uma TC
O limite de 35 é o critério da positividade.
Medição da densidade bacteriana. Para o cálculo da densidade bacteriana,
A estirpe de referência do genogrupo W de N. meningitidis ATCC 35559 foi colhida
de uma cultura cultivada durante a noite e diluída em tampão fosfato
salina (PBS) para atingir um padrão de 4,0 McFarland. As diluições em série foram
feito, e a extração de DNA foi feita usando kits Qiagen de acordo com o
Recomendações do fabricante para construir curvas padrão para DNA
quantificação por RT-PCR. As curvas padrão das medidas de DNA foram
feito usando um espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Scientific, EUA)
e um ensaio de quantificação de DNA de DNA (dsDNA) de PicoGreen (Life
Tecnologias, França). A média de ambas as medidas de DNA foi utilizada
quando os valores eram discrepantes. Os números de cópias do genoma foram estimados por
usando a massa da fórmula? Número de pares de bases de DNA por genoma? 1
mol / 6.022 140? 1023? 660 g por mol, onde 6,022 140? 1023 é
O número de Avogadro (moléculas por mole) e 660 g / mol é a média
peso molecular de uma molécula de DNA de cadeia dupla. Bactéria extraída
O DNA foi então submetido a PCR como descrito acima.
Análise estatística. O estudo foi projetado para ter 80% de potência para
detectar um aumento da prevalência do transporte a partir de uma prevalência estimada de transporte
de 5% no grupo de microbiologia convencional a pelo menos 7% de
amostras pareadas empregando uma das duas novas abordagens para o transporte
detecção; isso exigiu um tamanho de amostra de 870. Os dados foram analisados usando
Stata v12.0. As sensibilidade foram comparadas entre os métodos usando o
Probabilidade de significância McNemar exata. Diferenças na prevalência do transporte
por grupo (por exemplo, idade e sexo) foram investigados usando chi-quadrado
testes e regressão logística.