Resumo Imunologia pratica teste de fixação de complemento

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Imunologia- Prática do teste de fixação de complemento
Imunologia- Prática do teste de fixação de complemento
O teste de fixação de complemento (FC) é um método sorológico usado para determinar a presença ou semi-quantificar anticorpos ou antígenos pela inibição da fixação do complemento, em uma amostra, utilizando a ação do sistema complemento.
O teste de fixação de complemento tem como base a via clássica, onde o complemento liga-se ao sítio ativo formando pelo complexo antígeno-anticorpo.
Quando moléculas dos anticorpos se ligam ao antígeno, os sítios ativos da região FC tornam-se disponíveis para a ligação do complemento.
Relembrando: Na via clássica, primeiro os anticorpos do hospedeiro se ligam a antígenos do patógeno, presentes na membrana plasmática. O complexo proteico C1 se liga aos anticorpos e inicia-se então a cascata da via.
Por haver formação do complexo antígeno-anticorpo, tal via relaciona-se com a imunidade adquirida.
A ativação do sistema complemento por anticorpos ligados a antígenos resulta na formação de complexos de ataque à membrana, que podem romper a membrana celular. Se o anticorpo é ligado a antígenos adsorvidos nas hemácias, estas são destruídas e ocorre a hemólise.
Pode ser então um teste qualitativo ou semi-quantitativo quando é realizada uma diluição seriada da amostra, observando-se a máxima diluição onde ocorre reação positiva.
Vantagens do teste de fixação de complemento:
->Baixo custo;
->Boa especificidade;
->Boa sensibilidade;
Desvantagens do teste FC:
Pode dar falso-negativo devido a:
-Perda da atividade do complemento;
-Diluições inadequadas;
-Contaminação em soluções (gerando efeito anticomplementar);
-Sensibilização insuficiente de hemácias
Probabilidade para falsos-positivos devido a:
-Hemácias fragilizadas;
-Soro não-inativado;
-Baixa especificidade (dependendo do antígeno adsorvido na hemácia)
Fixação do complemento:
1)Soro do paciente é incubado para a inativação do complemento provavelmente existente, para que não haja interferência no teste;
2)O soro inativado é incubado com hemácias que contêm antígeno específico para os anticorpos pesquisados, adsorvidos em sua membrana. O anticorpo pesquisado, caso esteja presente na amostra, se ligará ao antígeno da superfície das células;
3)O complemento é inserido para identificar a presença ou não do complexo antígeno-anticorpo. Em caso positivo, as proteínas do sistema complemento se ligarão a porção FC dos anticorpos, iniciando uma cascata de reações que culminarão com a lise das hemácias, liberando hemoglobina.
4)Após a centrifugação, o que se observa é uma solução vermelho-amarronzada homogênea, devido a liberação de hemoglobina das hemácias.
5)Em caso de resultado negativo, ou seja, não havendo anticorpo específico para o antígeno pesquisado, não ocorre hemólise e nem liberação de material intracelular (hemoglobina). Assim, após a centrifugação será observado no fundo dos tubos um precipitado avermelhado, que corresponderá às hemácias não lisadas.
Inibição da fixação do complemento:
1) O soro do paciente é incubado para a inativação do complemento provavelmente existente, para não causar interferência no teste;
2)O soro inativado é incubado com anticorpo monoclonal dirigido para o antígeno pesquisado. Caso haja o antígeno pesquisado na amostra, os sítios de ligação do anticorpo monoclonal ficarão ocupados;
3)A solução de soro-anticorpo monoclonal é então incubada com o sistema hemolítico e com o sistema complemento. Caso ao anticorpos monoclonais estejam previamente ligados aos antígenos da amostra, eles não se ligarão com os antígenos na membrana das hemácias, não havendo hemólise e nem liberação de hemoglobina.
4)Sendo assim, em caso de resultado positivo, o que se observa é um precipitado avermelhado no fundo do tubo;
5)No caso de não haver o antígeno pesquisado na amostra, o anticorpo monoclonal ficará com os seus sítios de ligação livres, podendo se ligar ao antígeno adsorvido na membrana da hemácia, ativando o complemento e causando hemólise, com a liberação de hemoglobina. Havendo o antígeno pesquisado, o anticorpo monoclonal terá os seus sítios ocupados e este não se ligará aos antígenos da membrana, não havendo hemólise.