Espectrofotometria UV VIS atualizado em 2016

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A.A.M 1 
• Introdução 
•Espectro Eletromagnético 
•Interação da luz com a matéria 
•Equipamento 
•Lei de Lambert-Beer: cálculo 
•Curva Analítica 
•O Método da Adição-padrão 
•Análise de Mistura de Cromóforos 
•Desvios da Lei de Lambert-Beer 
Por Andréa Mello 
A.A.M 2 
Espectroscopia é um termo geral para a ciência 
que estuda a interação dos diferentes tipos de 
radiação com a matéria. 
 
Os métodos espectrométricos abrangem um grupo 
de métodos analíticos baseados na 
espectroscopia atômica e molecular referem-se às 
medidas das intensidades da radiação usando 
células fotoelétricas ou outros dispositivos 
eletrônicos. 
Definição 
A.A.M 3 
Como as interações da radiação com a matéria podem 
ocorrer tanto em nível atômico como em nível molecular, 
os métodos instrumentais espectrométricos se dividem 
em 4 classes: 
 
• Emissão (emissão atômica) 
 
• Luminescência (fluorescência atômica e molecular, 
fosforescência) 
 
• Espalhamento (Raman, turbidimetria e nefelometria) 
 
• Absorção (absorção atômica e molecular) 
A.A.M 4 
2
7
5
,3
 
3
4
1
,8
 
3
9
6
,1
 
4
7
4
,9
5
 
ABSORÇÃO ATÔMICA: O espectro é em forma de linhas finas (raias) 
devido aos níveis atômicos sem subníveis energéticos. 
ABSORÇÃO MOLECULAR: O espectro de absorção é caracterizado por bandas largas 
devido aos vários níveis e subníveis energéticos dos orbitais moleculares. 
5 
λmax 
A.A.M 6 
 Métodos espectrofotométricos de análise são 
baseados na medição da RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA 
emitida ou absorvida pela substância que se deseja 
analisar. 
 
A Espectrofotometria se divide em : ABSORÇÃO e 
EMISSÃO 
 
RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA: 
 E (hv) 
Espaço 
 
 ( Veloc.) 
Introdução 
A.A.M 7 
 Algumas propriedades ELETROMAGNÉTICAS da 
radiação devem ser descritas tratando-a como ONDAS 
SENOIDAIS que possuem , , P, V e A. 
 Para explicar o fenômeno da sua ABSORÇÃO e 
EMISSÃO é preciso tratá-la como MATÉRIA (como um 
fluxo de partículas, ou pacotes de Energia, chamados 
FÓTONS ou QUANTA). 
ONDA = propagação de E 
 = dist. Linear entre duas ondas consecutivas = V . P 
 = frequência = no de oscilações/ seg 
P = período = tempo em segundos de 1 oscilação 
 = 1/P P = 1/  = V/ 
A.A.M 8 
ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO
3 x 10
10
3 x 10
12
3 x 10
14
3 x 10
15
3 x 10
16
3 x 10
19
A B C DDD E F G
 (Hertz)
Radiações Ionizantes
A = ONDAS DE RÁDIO (curtas, médias e longas: AM/ TV/ FM) – 1013 a 108 nm 
 
B = MICROONDAS (e radar) - de 108 a 106 nm 
 
C = INFRAVERMELHO - de 106 a 103 nm 
 
D = LUZ VISÍVEL - de 750 a 400 nm 
 
E = ULTRAVIOLETA - de 400 a 10 nm 
 
F = RAIOS –X - de 10 a 1 nm 
 
G = RAIOS -  - de 1 a menos (raios Cósmicos < 0,001 Å) 
 
A.A.M 9 
Tipo de espectroscopia Faixa de 
comprimento 
de onda usual 
Faixa de número 
de onda usual, 
cm-1 
Tipo de transição 
quântica 
Emissão de raios gama 0,005 – 1,4 Å – Nuclear 
Absorção, emissão, fluorescência 
e difração de raios-x 
0,1 – 100 Å – Elétrons internos 
Absorção de ultravioleta de vácuo 10 – 180 nm 1x106 a 5x104 Elétrons ligados 
Absorção, emissão e fluorescência 
no UV/Visível 
180 – 780 nm 5x104 a 1,3x104 
 
Elétrons ligados 
Absorção no IV e espalhamento 
Raman 
0,78 – 300 μm 1,3x104 a 33 
 
Rotação/vibração de 
moléculas 
Absorção de microondas 0,75 – 375 mm 13 a 0,03 Rotação de moléculas 
A.A.M 10 
As ONDAS DE RÁDIO têm BAIXA ENERGIA, 
portanto não são estudas em Química. 
 
MICROONDAS: têm ENERGIA suficiente para alterar o 
ESTADO ROTACIONAL das MOLÉCULAS. 
 
 FORNO DE MICROONDAS: É uma fonte de 
microondas sintonizada numa FREQUÊNCIA em que as 
moléculas de água absorvem Energia. 
 O  ideal para penetração em água é 12,2 cm ( 1,22 x 108 
nm)/ 2450 MHz. 
 Como ocorre o aquecimento? 
O campo elétrico direciona (orienta) as moléc. NEUTRAS 
conforme suas cargas, VÁRIAS VEZES/SEG (), gerando 
uma alteração ROTACIONAL das moléculas (ela gira 
dentro do campo) que colidem com outras moléculas, 
gerando um atrito entre elas e com isso o aquecimento. 
Rotacional 
~ 0,01 kJ mol-1 
A.A.M 11 
 + - - + 
 H H 
 O O 
 H H 
*A água pura aquece menos (numa mesma ) do que uma 
sol. iônica, aonde a presença de íons aumenta a rotação 
das moléculas. 
 
*ALIMENTOS: Ptn (-NH2 e –COOH), gordura, carboidratos, 
água, sais...absorvem microondas. 
 
*Microondas NÃO altera as características físico-químicas 
das substâncias, por exemplo: a Ptn se degrada, mas no 
seu ponto isoelétrico; a água evapora, mas o P.E. 
permanece o mesmo. 
 
*Por NÃO ser uma energia IONIZANTE, NÃO é cancerígena 
(não rompe ligações covalentes, nem pontes de H). 
A.A.M 12 
INFRAVERMELHO: pode alterar o ESTADO VIBRACIONAL 
das LIGAÇÕES QUÍMICAS. Cada tipo de LIGAÇÃO tem seu 
próprio espectro de  de absorção, daí ser possível identificar 
ESTRUTURAS MOLECULARES. 
 
 
LUZ VISÍVEL: provoca alterações no NÍVEL de ENERGIA dos 
ELÉTRONS da camada de valência. Por isso é capaz de 
ROMPER LIGAÇÕES QUÍMICAS mais INSTÁVEIS, e é usada 
na Anál. QUANT. de subs. COLORIDAS ao olho humano. 
 
 
 
ULTRAVIOLETA: ROMPEM LIGAÇÕES QUÍMICAS, por 
serem radiações ionizantes. Provocam ALTERAÇÕES na 
ESTRUTURA MOLECULAR e iniciam várias reações químicas. 
 
Vibracional 
~ 1 kJ mol-1 
Eletrônica 
~ 100 kJ mol-1 
UV-Vis 
A.A.M 13 
RAIOS – X : ALTERAM A ENERGIA dos ELÉTRONS de 
camadas INTERNAS (K e L). Quanto mais interna a 
absorção, maior o desarranjo na molécula Com essas 
alterações em elétrons NÃO-LIGADOS, pode-se 
descobrir a COMPOSIÇÃO ATÔMICA de uma 
substância. 
 
 O Raio- X é mais penetrante que o ultravioleta , devido a 
 sua MENOR probabilidade de absorção (,  E& ). 
 
 
 RAIOS -  : EXCITAM as CAMADAS K e L. Podem 
 afetar o NÚCLEO ATÔMICO e provocar reações 
 nucleares. 
 
 Ex.: enriquecimento (do núcleo) de Urânio ( radioatividade) 
A.A.M 14 
A.A.M 15 
Interação da luz com a matéria 
 
 Os níveis de E dos elétrons e átomos são 
QUANTIZADOS. 
 Os elétrons assumem estados de E fixa e definida 
em cada nível e só passam de um nível energético para 
outro se receberem uma quantidade EXATA 
(QUANTIZADA) de E. 
 
 Essa Energia pode ser muita alta e fazer com que o 
elétron saia da estrutura atômica e o átomo neutro se 
tona um íon. 
A.A.M 16 
Como funciona? 
 
 A radiação eletromagnética (Luz) interage com 
a matéria através do seu campo elétrico. 
 
M Ei M+ 
 
 M E (hv ) M* (estado excitado) M + E (calor ou luz) 
 
 Quando um fóton se aproxima de um átomo ou 
molécula podem ocorrer 3 eventos: PASSAR DIRETO, ser 
REFLETIDO ou ser ABSORVIDO. 
A.A.M 17 
Como medir a absorção de “luz”? 
 
 Po P P/Po = T 
 
 T = 0 a 1 ou 
 b 0 a 100 
 (Transmitância) 
 
 Os fótons de determinada frequência podem ser 
ABSORVIDOS se estiverem “sintonizados” na frequência 
que fornece E necessária para a transição de um estado 
ROTACIONAL para outro, de um VIBRACIONAL para outro 
ou de um ELETRÔNICO para outro. 
A.A.M 18 
feixe de cores separadas Fenda seletora
Feixe luz branca
COR SELECIONADA
Equipamento 
 
 Fonte Monocromador Amostra Detector Registrador 
 
Filtro(Fotocolorímetro) X Prisma (Espectrofotômetro) 
 MONOCROMADOR: prismas ou redes (ou grades) de 
difraçãoA.A.M 19 
Equipamento 
A.A.M 20 
Monocromador 
A.A.M 21 
A.A.M 22 
Cores complementares 
A.A.M 23 
Lei de Lambert-Beer 
Medindo-se a transmitância de soluções- padrão de uma subst. 
em variadas Conc.: 
 T 
 
 
 
 Conc. 
 -log T 
 
 
 
 
 Conc. 
A relação gráfica T x C é uma exponencial. 
Para se obter uma RETA, basta aplicar o Log. na T: 
 - log T X Conc. 
A.A.M 24 
Como os valores são menores do que 1 (T= 0 a 1),aplica-se o 
Log do inverso de T. 
Log 1/T é  a C. Log 1/T = A 
 
Se a Conc. é constante e o caminho ótico (b) varia, a Absorbância 
varia LINEARMENTE e o gráfico A x b é idêntico ao gráfico 2. 
Logo: a A depende da C analito e do b. 
Então: A =  . b . C 
 
 = constante de proporcionalidade = Absortividade Molar = 
L/mol.cm 
a = Absortividade específica = L/g.cm 
 
A.A.M 25 
ESPECTRO DE ABSORÇÃO DO KMnO4 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Espectro de Absorção do KMnO4
400 450 500 550 600
 (nm)
A
12
3
A.A.M 26 
Repetindo-se o gráfico A x C, para os comprimentos de onda: 
1, 2, 3, nas mesmas condições de análise (b e C são os 
mesmos para cada reta): 
 
 A 
 
 
 
 
 
 Conc. 
 
A1 > A2 >A3 ( mesmo que 1 < 2 < 3). 
 
Como b e C são os mesmos,  é quem está variando para cada 
. 
A.A.M 27 
A melhor RETA é a que melhor distingue duas Conc. muito 
próximas e que dá maior sinal de respostas para amostras 
diluídas. 
 
A reta de 1 é a melhor, portanto 1 é aonde se dá a máxima 
ABSORBÂNCIA do analito. 
Portanto, 1 = máx. 
 
 
 é uma constante, que só depende da amostra, do solvente 
(meio) e do  usado. 
A.A.M 28 
Curva Analítica 
1. CALIBRAR O EQUIPAMENTO 
•Ajustar o 0 (ZERO) % de T com o feixe de luz OBSTRUÍDO; 
•Ajustar o 100% de T (0% A) com a cubeta com branco ótico; 
2. CURVA ANALÍTICA 
•Fazer a VARREDURA da solução da substância analisada; 
•No máx., proceder as medidas de T (ou A) de uma série de 
padrões da subst.; 
•Calcular as ABSORBÂNCIAS e construir o gráfico: A x C 
que servirá de base para o cálculo da conc. da amostra; 
•No gráfico (por interpolação) ou pela EQUAÇÃO DA RETA: 
Y = aX + b, calcular a conc. da amostra. 
A.A.M 29 
NEM SEMPRE É POSSÍVEL FAZER A LEITURA DIRETA 
DA AMOSTRA, POIS: 
•A amostra pode conter mais de 1 cromóforo; 
•As condições da amostra podem não ser reprodutíveis nos 
padrões; 
•A amostra pode estar fora da faixa ótima de trabalho. 
 
A CURVA DIMINUI A POSSIBILIDADE DE ERROS E 
PERMITE O CÁLCULO DE  OU a: 
 
 ou a = coef. Ang. reta  b (caminho ótico) 
A.A.M 30 
O Método da Adição-padrão 
Um constituinte indesejável pode INTERFERIR devido às suas 
propriedades óticas, ou por sofrer interações com o cromóforo a 
ser analisado, ou com os reagentes usados na determinação. 
 
Técnicas para eliminar ou minimizar os efeitos dos interferentes: 
SEPARAÇÃO FÍSICA / CONVERSÃO QUÍMICA (do 
interferente numa espécie opticamente inerte) & ADIÇÃO-
PADRÃO (É uma técnica INSTRUMENTAL rápida e simples que 
dispensa todos os procedimentos de eliminação de interferentes). 
 
DEFINIÇÃO: Consiste na adição de uma quantidade definida de 
padrão à amostra para leitura da Absorbância. 
A.A.M 31 
METODOLOGIA: Medir a absorbância da amostra antes e após 
a adição do padrão, nas mesmas condições espectrofotométricas. 
O efeito dos interferentes é praticamente o mesmo nas soluções de 
amostra e de amostra + padrão. 
Vx (aliq. AM) Vt  medir Abs 1 
Vx (Aliq. AM) + Vp ( aliq. padrão) Vt  medir Abs 2 
 
Abs 2  Abs 1 
 
A= .b.C 
 
 
A1 = b(Cx Vx / Vt) A2 = b(Cx Vx + CpVp/ Vt) 
 
Conc. após a dil. Conc. da sol. 
 
A.A.M 32 
Pode-se calcular a Cx, fazendo-se uma 
única adição de padrão: 
 
 A2  A1 = (.b.Cx / Vt + .b.CpVp/ Vt)  .b.Cx / Vt 
 
 
Cx = CpVp  (A2 – A1)Vx 
A.A.M 33 
Pode-se também calcular a Cx através da Curva de Adição–padrão 
Utilizando-se o Gráfico A X Vp 
A2 = b(Cx Vx / Vt) + b.Cp . Vp 
 Vt 
 const. = coeficiente linear const. = coeficiente angular , 
b, Vx, Vt, Cp = constantes para qualquer Vp. 
 
Pode-se fazer o cálculo graficamente dividindo o coef. Linear pelo 
angular e achar o valor de Cx: 
 
b(Cx Vx / Vt)  b.Cp = Cx Ou seja: 
 Vt 
Cx = coef. Linear / coef. Angular 
 
A.A.M 34 
OBJETIVO: Analisar dois ou mais cromóforos simultaneamente. 
Tais espectros apresentam regiões de superposição. 
O máx. escolhido deve corresponder apenas ao cromóforo de 
interesse. 
 Apesar dos outros cromóforos não estarem na região de 
Absorbância Máxima escolhido, eles absorvem em alguma 
medida neste comprimento de onda. 
Para dois cromóforos: X e Y, no máx. de X há uma contribuição 
de Y; no máx. de Y há contribuição de X: 
Atotal = Ax + Ay 
Análise de Mistura de Cromóforos 
A.A.M 35 
•Escolhe-se os máx. de cada um dos cromóforos (onde cada um 
deles tem maior sensibilidade) e calcula-se, pela Lei de Beer, a 
contribuição de cada um deles para a Abs. Total: 
Atotal(em x) = x,x.b.Cx + y,x.b.Cy 
 
Atotal(em y) = x,y.b.Cx + y,y.b.Cy 
 
•Sabendo-se as  e b, as incógnitas das equações são Cx e Cy, e 
resolvendo-se o sistema de equações de primeiro grau, pode-se 
calcular ambas as concentrações. 
•As , em cada comprimento de onda, podem ser calculados 
através de padrões de cada cromóforo. 
A.A.M 36 
A LEI DE BEER NEM SEMPRE É VÁLIDA!! 
( A  C  A =  . b . C  NEM SEMPRE !) 
 
TIPOS DE DESVIOS: 
 
1. POR LIMITAÇÃO DA LEI: Nem sempre a A é linearmente 
relacionada com o C: 
Interações do ANALITO com o solvente e demais solutos 
variam com o aumento da Conc. 
  I.R.sol. ()  Conc.     
A =  . b . C  A = [( . )  (2 + 2)2 ] . b . C 
 Correção em função do I.R 
 
Em geral, esta correção é DESPREZÍVEL para C < 0,01mol/L. 
 
Para: ,  + &  ,  - 
Desvios da Lei de Lambert-Beer 
A.A.M 37 
2. DESVIOS QUÍMICOS: Ocorrem devido a reações não-
completas (Kc ). 
Se Kc favorece o cromóforo nas conc. analíticas + altas,  é + 
Se Kc favorece o cromóforo nas conc. analíticas + baixas,  é – 
 
3. CAUSADOS PELA INSTRUMENTAÇÃO: Lembrar que: 
“A Lei de Beer é aplicável a luz MONOCROMÁTICA”. 
 
3.1. FILTROS: Os filtros acabam apresentando uma mistura de  
que absorvem menos que o máx. Daí a  é tanto MAIOR, 
quanto mais fora do máx. fizermos a leitura (pois a  não será 
máx.).  - 
 
3.2. LUZ ESPALHADA INTERNAMENTE NO APARELHO 
POR QUALQUER SUPERFÍCIE REFLETORA:  - 
 
3.3. CUBETAS SUJAS E NÃO UNIFORMES. 
 
A.A.M 38 
SOLUÇÃO: Diluir a amostra, para que a análise ocorra na faixa 
LINEAR da curva (desde que  e a sensibilidade do aparelho 
permitam). 
 
FAIXA NORMAL (de trabalho em espectrofotometria): 
10-2 a 10-7 mol/L 
 
OBS: Deve-se conhecer a faixa de conc. onde ocorre um 
DESVIO SIGNIFICATIVO da Lei, daí nunca EXTRAPOLAR 
resultados de uma curva para calcular a conc. da amostra cuja 
Absorbância caiu fora dos limites dos valores dos padrões.