Eletroforese: Princípios e Aplicações

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Eletroforese 
Princípios da técnica 
• Separa as macromoléculas 
– Por diferenças de tamanho 
– Por diferenças na conformação estrutural 
– Por diferenças na carga elétrica 
 
 
Técnica 
 
Separação 
 
Separação 
 
Materiais analisados 
• DNA 
– DNA total 
– Produtos de amplificação de DNA 
– DNA digerido por endonucleases 
– Marcadores moleculares de diferentes setores do 
genoma 
• Proteína 
– Proteína total desnaturada (SDS) 
– Isoenzimas 
• RNA 
Aplicação da eletroforese 
• Controle de purificação de macromoléculas 
 
• Isolamento de macromoléculas 
 
• Caracterização de moléculas 
 
• Determinação de perfis moleculares 
Purificação 
 
Tipos de eletroforese 
• Eletroforese comum (vertical ou horizontal) 
– As moléculas migram em um mesmo sentido 
pela ação de uma corrente elétrica 
 
• Eletroforese de campo pulsado 
– A migração se dá em duas direções. Pulsos 
emitidos alternadamente em dois sentidos 
Eletroforese de campo pulsado Eletroforese unidirecional 
Tipos de eletroforese 
unidimensional 
• Eletroforese horizontal 
– Gel de agarose 
– Gel de amido 
• Eletroforese vertical 
– Poliacrilamida 
Eletroforese horizontal 
gel de agarose 
 
Eletroforese vertical 
Gel de poliacrilamida 
 
Variáveis que são consideradas 
na escolha da eletroforese 
 
• Tipo de eletroforese 
– comum x campo pulsado 
• Tipo de gel 
– Agarose x acrilamida 
• Concentração do gel 
– Agarose (0,3 a 2%) 
– Poliacrfilamida (7% a 12%) 
 
Tamanho do fragmento a ser 
separado 
 
Concentração do gel e separação 
do material analisado 
 
Separação de Moléculas amplificadas 
pela técnica de RAPD 
 
Passos para eletroforese 
• Preparo do gel 
– Tampão do gel (TBE ou TAE 1X) 
– Concentração do gel- tamanho da macromolécula 
• Corrida eletroforética 
– Tampão de corrida (TBE ou TAE 1X) 
– 50 a 120 Volts 
• Revelação das bandas 
– Brometo de etídeo (DNA e RNA) 
– Nitrato de prata (Proteínas, DNA e RNA) 
– Cromassie Blue (proteínas) 
Corrida 
 
Tampões de corrida e do gel 
 
Revelação de bandas por 
Brometo de etídeo 
Coloração com brometo de etídeo 
 visualização com UV 
 
 
 
Coloração com Nitrato de prata 
 
Coloração com prata 
 visualização direta 
 
 
 
Registro e análise de dados 
 
 
Interpretação 
 
PCR 
 
Amplificação de DNA in vitro 
PCR 
 
Produto de PCR