Fatores que afetam a produção de etanol por Saccharomyces Cerevisiae

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS – UFSCAR.
CENTRO DE CIENCIAS AGRARIAS – CCA.
MTA – GESTÃO NO SETOR SUCROENERGÉTICO
Fatores que afetam no metabolismo de Saccharomyces Cerevisiae na produção de etanol.
Aluno: Roberto Missiatto Filho
ARARAS
2010�
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS – UFSCAR.
CENTRO DE CIENCIAS AGRARIAS – CCA.
MTA – GESTÃO NO SETOR SUCROENERGÉTICO
Fatores que afetam no metabolismo de Saccharomyces Cerevisiae na produção de etanol.
Monografia apresentada para a conclusão do curso de pós-graduação latu sensu MTA – Gestão de Tecnologia no Setor Sucroenergético.
Orientadora: Sandra Regina Cecatto Antonini
ARARAS
2010
Sumário
41-	Resumo	�
52-	Introdução.	�
83-	Objetivo.	�
84-	Fatores que influenciam o Crescimento e a Fermentação.	�
84.1- Condições Físicas.	�
84.1.1 – Temperatura	�
104.1.2 – Oxigênio.	�
144.2 – Substrato e Composição química do meio	�
144.2.3 –Açucares (Brix).	�
154.2.2 – A acidez (pH).	�
164.2.3 - Fonte de Nitrogênio	�
164.2.1 – Fontes de Minerais.	�
184.3 – Microrganismos e contaminantes.	�
184.3.1– Crescimento Microbiano.	�
204.3.2 – Leveduras Selvagens.	�
214.3.4 – Contaminantes.	�
234.4 – Sistemas de fermentação.	�
234.4.1 – Processo descontínuo	�
244.4.2 – Processo descontínuo alimentado	�
254.4.3 – Processo contínuo	�
275-	Resultados	�
296-	Conclusão	�
307-	Referências Bibliográficas	�
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Índice de Figuras
6Figura 1 - Metabolismo da glicose em leveduras.	�
12Figura 2 – Concentração de oxigênio ao longo do tempo em um processo de aeração.	�
13Figura 3 – Concentração de Açucares e Glicose para produção de etanol.	�
19Figura 4 – Número de microrganismos X tempo.	�
21Figura 5 – Efeitos das bactérias e leveduras selvagens na fermentação.	�
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Índice de Tabelas
10Tabela 1 – Influência da temperatura no tempo de geração.	�
18Tabela 2 – Constituintes inorgânicos das leveduras	�
27Tabela 3 – Principais fatores x Faixa ou condição ideal.	�
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 Resumo
Existem diversos tipos de leveduras fermentativas que degradam a glicose para a produção de etanol e dióxido de carbono. Contudo, Saccharomyces cerevisiae destaca-se pela velocidade com que fermenta e pela concentração de etanol que pode atingir.
Segundo Fernandes (2008) estirpes de S. cerevisiae chegam a produzir cerca de 20% v/v etanol, enquanto a maioria das outras leveduras fermentativas deixa de crescer e/ou de fermentar a partir de 6% v/v
Atualmente são utilizados alguns isolados em especial da espécie S. Cerevisiae para a fabricação do etanol em escala industrial. Em geral os microrganismos são influenciados por uma série de fatores ambientais, físico, químicos e biológicos que podem interferir na sua sobrevivência, produção de massa celular e produção de metabólicos de interesse como etanol. 
Este trabalho teve como objetivo verificar na literatura quais são os fatores que podem prejudicar ou melhorar a fermentação industrial e produção de massa celular de S. Cerevisiae. 
Assim constatou-se que a temperatura, oxigenação do meio, concentração dos açucares e nutrientes, acidez do meio (pH), microrganismos contaminantes e o tipo do processo utilizado são os principais fatores de interferência. Concluindo assim que o conhecimento dos diversos fatores é de fundamental importância para a produção do processo industrial.
Palavras Chave: Fermentação, Saccharomyces cerevisiae, Produção de etanol, Fatores de influencia. 
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 Introdução.
Segundo VILLEN (2009) Produtos de fermentação são usados desde a Antigüidade. Há registros que comprovam o uso de alimentos fermentados pelos sumérios, egípcios antigos, assírios e babilônios. A produção de bebidas alcoólicas pela fermentação de grãos de cereais já era conhecida antes do ano 6.000 a.C. As leveduras ocupam entre os microrganismos um lugar de destaque pela facilidade de exploração econômica. As leveduras são responsáveis pela indústria de bebidas alcoólicas como cerveja, vinho, champagne, cidra, bebidas destiladas (rum, wodka, whisky, conhaques, vermutes, aguardente, sakê, etc) e outras de comercializações mais restritas (ANGELIS, 1987).
Além de fermentações alcoólicas as leveduras são responsáveis pela fabricação de: pão, proteína microbiana, óleo de levedura, trealose, pigmentos carotenoídicos, enzimas, vitaminas, e etc. (ANGELIS, 1987).
O primeiro a efetuar um estudo quantitativo da fermentação alcoólica foi provavelmente Lavoisier, em 1789. Coube a Pasteur, a partir de 1857, a explicação clara sobre a natureza da fermentação alcoólica, atribuindo-a a seres vivos, as leveduras, como agentes causais Segundo ele, 100 partes de sacarose proporcionam 105,4 partes de açúcar invertido, que, por sua vez, produzem 51,1 partes de etanol, 49,4 partes de gás carbônico, 3,2 partes de glicerol, 0,7 parte de ácido succínico e uma parte de outras substâncias. (MENEZES, 1980).
A fermentação alcoólica é a transformação do açúcar (glicose) até resultar em etanol e CO2, esse processo envolve 12 reações em seqüência ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especifica (AMORIM, BASSO & ALVES, 1996). As reações podem ser vistas de forma geral na Figura - 1.
Figura 1 - Metabolismo da glicose em leveduras.
FERNANDES 2008
Abreviaturas das enzimas: HXK, Hexocinase; PGI, Fosfoglucose isomerase; PKF, Fosfofrutocinase; FBA, Frutose-fosfo-aldolase; GAPDH, Gliceraldeído- 3-fosfatodesidrogenase; PGK, 3-fosfoglicerato-cinase; PGM, fosfoglicerato-mutase; ENO, enolase; PYK, piruvatocinase; PDC, Piruvato-descarboxilase; ADH, Álcool-desidrogenase; PDH, piruvatodesidrogenase; ACS, acetil-coenzima A-sintetase; ALD, acetaldeído-desidrogenase; PYC, piruvatocarboxilase (adaptado de: PRONK et al., 1996; STRYER, 2000 in: FERNANDES 2008).
Atualmente o etanol tem sua importância ressaltada, pois é uma opção temporária para a matriz energética mundial que é baseada na queima de carvão mineral, petróleo e seus derivados, que são cada vez mais escassos e com preços inflacionados, além disso, a queima do etanol emite uma menor quantidade CO2 e outros gases de poluentes em relação aos combustíveis fósseis. O etanol ainda se apresenta como uma fonte renovável de energia com ampla possibilidade de exploração.
O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar e de etanol. A cana-de-açúcar é a maior fonte de energia renovável do País, com 15,9% de participação na matriz energética atual, superando pela primeira vez a oferta de energia hidrelétrica (14,8%), considerando-se o etanol combustível e a coogeração de eletricidade a partir do bagaço. Sua área plantada passa de 7 milhões de hectares; e sua produção gira em torno de 490 milhões de toneladas na safra 2007/08 (SOUZA et. al., 2009).
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 Objetivo.
Verificar na literatura quais são os fatores que influenciam e na eficiência da fermentação e produção de massa celular das leveduras, relatando assim sua influencia no processo.
 Fatores que influenciam o Crescimento e a Fermentação.
4.1- Condições Físicas.
4.1.1 – Temperatura
Segundo FURLETTI (1996), a temperatura é um fator de grande importância no processo fermentativo, pois possui influencia no tempo de fermentação, reprodução dos microrganismos, e surgimento de infecções. Onde VALSECHI (1960) ressalta que existe uma faixa de temperatura, onde se encontra o ponto ótimo para desenvolver suas atividades. 
Assim segundo LOURENCINI (1986), para as leve duras alcoólicas o ideal seria trabalhar com mosto a 30°C, o que ocorre geralmente na pratica, já VALSECHI (1960) diz que esta "zona ótima" de temperatura encontra-se entre 26 a 32°C. Portanto existe uma necessidade de um aquecimento inicial do mosto em épocas frias e um sistema de refrigeração quando a temperatura esteja elevada dependendo da latitude. 
PATARO et al. (1998) estudaram as características da fisiologia de crescimento de 210 linhagens de leveduras isoladas do estado de Minas Gerais.A maioria das linhagens foi fisiologicamente adaptada às condições ambientais observadas nas dornas de fermentação. Elas foram capazes de crescer a 35°C. em meio contendo até 25% de glicose e em concentração de 5 % (v/v) de etanol.A temperatura ótima para a fermentação é de 5-10 ºC acima do ótimo para o crescimento da levedura, que encontra-se na faixa de 25-30 ºC.
VALSECHI (1960) afirma que temperaturas abaixo da zona ótima enfraquecem gradualmente as atividades das leveduras, fazendo com que os microrganismos tomem uma forma de resistência, esporo na qual permanece em estado de vida latente. Assim, a levedura resiste a temperaturas extremamente baixas até 130°C abaixo de zero sem que deixe de recuperar todas as suas funções, logo que condições favoráveis à sua vida sejam restabelecidas. Não acontece o mesmo com as temperaturas acima da zona ótima, onde a ação do calor se, torna muito sensível. 
FURLETTI (1996) acusa que temperaturas muito elevadas favorecem o desenvolvimento de bactérias, alem de rápida evaporação do álcool formado, devendo ser evitadas pela refrigeração do sistema. VALSECHI (1960) ressalta que, temperaturas entre 32 a 38°C encontram-se uma faixa ótima de temperatura para um grande numero microrganismos prejudiciais à fermentação alcoólica. 
VALSECHI (1960), conclui que em temperaturas menores que 28°C, haverá apenas um pequeno retardamento no processo fermentativo, enquanto que em temperaturas maiores que 32°C, estaremos propiciando condições favoráveis no desenvolvimento de fermentações nocivas e também que sob altas temperaturas, as perdas de álcool por evaporação e por projeção aumentarão em razão progressiva. 
ALVES (1994) ressalta que estas considerações não condizem com o fato de que nas regiões tropicais a temperatura do processo facilmente atinge 40 ºC. STUPIELLO & HORII (1981) afirmam que a reprodução de células pode ocorrer até a temperatura da ordem de 38 ºC, havendo inibição da multiplicação a 40 ºC e na presença de 8 a 9 % v/v de etanol.
Parazzi C. (2010) mostra que a temperatura tem grande influencia na reprodução das leveduras, podendo retardar o tempo geração, quando não cessar esta reprodução, podendo assim levar a morte dos microrganismos sendo necessário uma nova formação do pé de cuba.
Tabela 1 – Influência da temperatura no tempo de geração.
	Temperatura (°C)
	Tempo de geração (h)
	Coef. espec. de cresc. g/l/h-1
	20
	5
	0.15
	24
	3.5
	0.21
	27
	3.0
	0.30
	30
	2.2
	0.31
	36
	2.1
	0.29
	38
	4.0
	0.19
	40
	-
	-
Adaptado de Parazzi C. 2010
4.1.2 – Oxigênio.
A levedura pode viver tanto na presença como na ausência de oxigênio. Entretanto, o seu modo de vida se diferencia de acordo com o ambiente em que se encontra, alterando assim seu metabolismo, adaptando-se ao meio, através de reações bioquímicas absolutamente diferentes.
Para preparação de culturas “starter” (ou inóculo) e no controle da fermentação alcoólica, é importante considerar a função do oxigênio no controle do metabolismo e crescimento da levedura. Quando o oxigênio está disponível, o metabolismo da levedura direciona para a respiração, rendendo teoricamente 38 moles de ATP para cada mol de glicose, desta forma, permitindo uma maior velocidade de crescimento, maior produção de biomassa, e a síntese de materiais de reserva, como esteróis e ácidos graxos. Desta forma, a aeração é usada na preparação de culturas “starter” quando uma quantidade maior de biomassa é requerida (HENICK-KLING, 1988). 
Segundo SCHMIDELL (2001), esta é uma situação distinta para o oxigênio, pois este elemento é muito pouco solúvel em água. De fato, a concentração de oxigênio dissolvido na saturação é apenas da ordem de 7 mg O2/L (ou 7ppm), ao se borbulhar ar atmosférico a pressão de 1 atm e a 35 ºC. Por esta razão é que se costuma afirmar que na extensão de um processo descontínuo aeróbio, para obtenção de leveduras depende enormemente da capacidade de se transferir o O2 para a fase líquida, especialmente nos instantes mais avançados do processo, onde a concentração celular pode ser elevada. Em outras palavras, se pode ocorrer situações em que a capacidade de transferência de oxigênio é que ditará as condições de operação, fermentação ou produção de massa celular.
Para uma manutenção das células do reator deve-se borbulhar certa quantidade de oxigênio. Assim se visa é transferir o oxigênio da fase gasosa para o líquido, fazendo com que o oxigênio seja dissolvido chegando às células suspensas e, finalmente, seja consumido.
Segundo CELESTINO & CELESTINO (2010) esse caminho a ser percorrido pelo oxigênio, existem muitas resistências, porém devemos considerar a resistência de uma película líquida ao redor da bolha de ar. A taxa de transferência de oxigênio pode ser descrita pela equação abaixo:
C = concentração de O2 dissolvido no meio de cultura.
Cs = concentração de saturação de O2 dissolvido no meio de cultura.
KL.a = coeficiente de transferência de massa.
 Variação da concentração de O2 dissolvido no meio de cultura com o tempo durante a aeração 
O parâmetro KL•a deve ser determinado experimentalmente, e é usado para avaliar a capacidade de aeração de um fermentador.
Para a determinação de KL•a, deve-se obter dados sobre a concentração de O2 dissolvido no meio de cultura ao longo do tempo até a saturação. O sinal de resposta de um eletrodo específico para a medição de oxigênio dissolvido é uma técnica muito utilizada. Consiste em inicialmente borbulhar nitrogênio no líquido (meio de cultura), a fim de retirar todo o O2 dissolvido, até que a sonda indique zero. A seguir, inicia-se a aeração e a agitação do meio líquido nas condições em que se pretende obter KL•a, passando então a registrar o sinal da sonda. Esse sinal sairá do valor zero, aumentando até atingir a concentração de saturação Cs . Na figura 2, a concentração de saturação (8 ppm) é atingida após 25 minutos (CELESTINO & CELESTINO, 2010).
Figura 2 – Concentração de oxigênio ao longo do tempo em um processo de aeração.
Fonte: CELESTINO & CELESTINO, 2010.
Segundo FURLETTI (1987) a areação do mosto tende a produzir menor quantidade de álcool, já que a levedura, por apresentar o “Efeito Pasteur” (inibição da fermentação na presença de oxigênio), passará a oxidar carboidratos por respiração.
VALSECHI (1960) diz que neste caso, a sua função multiplicativa atinge ao máximo, o peso de células produzidas pode atingir cerca da quarta parte do açúcar consumido. Pelo contrário, em ausência de ar e, portanto, de oxigênio livre, a função multiplicativa se reduz a zero, tornando-se máxima a faculdade de fermentação. O açúcar é na sua maioria, desdobrado com produção de álcool e de gás carbônico.
Evidentemente em uma situação ou outra a multiplicação fermentação pode existir ao mesmo tempo em que fermentação, dependendo este fato, da quantidade de ar (oxigênio livre) presente e à disposição da célula. Assim quando a multiplicação não é desejada, a ausência de ar é requerida, sendo, neste caso, máxima a produção de álcool.
A produção de etanol e massa celular possuem uma estrita relação com a concentração de oxigenio do meio e a concentração de açucares. A produção de massa celular predomina somente em condiçoes muito especificas onde a concentração de açucar é baixa e a de oxigenio é alta, do restante a fermentação é a via metabolica predominante, assim mostra a figura 3.
Figura 3 – Concentração de Açucares e Glicose para produção de etanol.
Fonte : Parazzi C. 2010
4.2 – Substrato e Composição química do meio.
4.2.3 –Açucares (Brix).
A concentração de glicose no meio tem provado ter uma importante função regulativa no metabolismo. A concentração de açúcar no caldo de cana-de-açúcar deve ser diferente nas duas etapas distintas do processo fermentativo. A primeira está relacionada com a propagação de S.cerevisiae que é feita sob intensa aeração. Normalmente é recomendado que o teor de açúcar não seja superior a 2-3%(p/v), já que concentrações mais altas prejudicam a respiração da célula, que é indispensável para um crescimento eficiente (MAIA et al., 1992; SCHWAN & CASTRO, 2001). 
PRESCOTT & DUNN (1959) ressaltam que a concentração de açúcar é mantida baixa no tanque de propagação com o objetivo de favorecer a utilização do açúcar para a produção de células. A concentração usual de açúcar no propagador varia entre 0,5 a 1,5% p/v, dependendo do processo.
Na fermentação o teor médio de açúcar tolerado pela levedura é cerca de 15% (p/v). Este limite pode ser variável de acordo com a levedura e as demais condições do processo fermentativo (MAIA et al., 1992; SCHWAN & CASTRO, 2001).
Segundo MAIA (2002) em cultura aeróbia, o substrato é reconhecido com agente regulador do metabolismo da glicose. O efeito Crabtree é descrito como o efeito repressor da atividade respiratória pela glicose livre. Assim, S. cerevisiae seria “sensível” à glicose, pois em concentrações de 100 a 200 mg/L já é iniciada a fermentação.
Dada a existência relacionada entre a concentração de sólidos e de açúcar, a concentração do mosto na prática, é medida pelo grau Brix e a quantidade ótima de sólidos (no mosto), que é obtida pela mistura de água com caldo, melaço ou xarope (LOURENCINI 1986). Segundo OLIVEIRA & MAGALHÃES (2002), deve-se diluir o caldo de cana-de-açúcar para uma concentração de sólidos solúveis totais entre 12 e 16 ºBrix. Teores de açúcar acima de 16 ºBrix podem acarretar fermentações mais lentas e freqüentemente incompletas.
Altas concentrações de açucares podem ocasionar alto teor alcoólico ou ocorrência de fermentações incompletas, com formações de subprodutos que podem baixar consideravelmente o rendimento alcoólico (FURLETTI 1987).
4.2.2 – A acidez (pH).
Em relação ao pH, sabe-se que as fermentações se desenvolvem numa ampla faixa de valores, sendo adequada a faixa entre 4 e 5. Nos mostos industriais, os valores de pH geralmente se encontram na faixa de 4,5 a 5,5 (LIMA et al., 2001). A tolerância à acidez é outra característica importante para as leveduras industriais (LIMA et al., 2001), porém, sabe se valores muito baixos de pH, além de ocasionarem perda de nutrientes como nitrogênio e potássio, segundo GOMES (1988), aumentam a sensibilidade ao etanol, aos ácidos orgânicos e ao SO2.
A acidez do mosto depende das características deste e está diretamente relacionada com a atividade de agentes fermentativos presentes neste (LOURENCINI 1986). Segundo VALSECHI (1960), verifica-se que cada espécie de microrganismo prefere viver em uma "zona ótima" de reação do meio, que é representada por determinados limites de índice pH.
FURLETTI (1987) afirma que a fermentação etanólica se conduz bem na faixa de pH de 4,0 a 4,5. Já VALSECHI (1960) diz que o caldo de cana tem um índice pH variável entre 5,0 a 5,8. Apesar disto, quando as outras condições são boas, a levedura alcoólica vive bem aí. Entretanto, advindo, por quaisquer razões, condições adversas, o emprego de um ácido, como o sulfúrico, em quantidades apropriadas, é sempre favorável. 
Assim VALSECHI (1960) recomenda um tratamento periódico do caldo com ácido sulfúrico, na razão de 0,2 - 0,5 mL por litro de mosto. Esta pratica alcança economicamente os fins desejados quando utilizada no tratamento do pé de cuba. Neste caso, a quantidade de ácido sulfúrico será de até 1 mililitro por litro de "pé", assim deve se agitar o mosto tratado por pelo menos 2 horas.
4.2.3 - Fonte de Nitrogênio 
As leveduras geralmente podem sintetizar todos os aminoácidos e bases nitrogenadas necessárias para seu crescimento celular a partir do íon amônio. O crescimento é acelerado quando estão disponíveis no meio de crescimento “unidades de construção”, como aminoácidos, para a síntese de enzimas celulares e componentes estruturais (HENICK-KLING, 1988). No entanto, ALVES (1994) comenta que a utilização de sulfato de amônio como fonte nitrogenada resulta em maior acidez do meio, que embora possa favorecer o controle da contaminação bacteriana (consequente redução da formação de ácido lático e acético), causa estresse à levedura, diminuindo a viabilidade e multiplicação. 
A reprodução de S. cerevisiae varia em função do nível de nutrientes encontrados na matéria-prima, e dentre estes o nitrogênio é o que apresenta uma resposta mais significativa. A levedura não assimila instantaneamente o nitrogênio quando adicionado na forma de uréia (46% de N) ou sulfato de amônio (21% de N) (PINOTTI, 1991). 
4.2.1 – Fontes de Minerais. 
As leveduras exigem diversos íons inorgânicos (minerais) em concentrações tanto micro como milimolar para manifestarem ótimos crescimentos e rendimento fermentativo. Deficiências ou concentrações elevadas de tais minerais, ou seja, um desequilíbrio entre os nutrientes minerais provocam alterações metabólicas significativas (AMORIM, BASSO & ALVES, 1996).
Os micro-elementos têm uma função importante no metabolismo celular, principalmente devido aos seus requerimentos como cofatores para várias enzimas Aparentemente, íons metálicos são vitais para todos os organismos, e desta forma, transportadores destes íons têm um papel crucial na manutenção da homeostase (AMORIM, BASSO & ALVES, 1996).
JONES & GREENFIELD (1984) dividem as funções destes íons em duas: enzimática e estrutural. Na função enzimática, alguns íons são o centro catalítico de uma enzima, como um ativador ou estabilizador da função enzimática, ou mantêm controle fisiológico por antagonismo entre ativadores e desativadores. Dentre estes, Zn 2+, Co 2+, Mn 2+ e Cu2+ são comumente centros catalíticos. A função estrutural é desempenhada pelos íons que agem neutralizando forças eletrostáticas presentes nas muitas unidades celulares aniônicas. Na maioria das vezes, K+ e Mg2+ são encontrados em polifosfatos, RNA, DNA e proteínas. Segundo LIMA (2001), a adição de sais minerais é vantajosa para corrigir deficiências que o caldo normalmente apresenta. De um modo geral, a adição não é feita em todo o volume do mosto, mas nos “pés de cuba”, ou periodicamente, nas dornas de fermentação. 
A composição elementar de uma célula microbiana depende de muitos fatores, como condições de cultivo, espécie do microorganismo, e até mesmo do substrato utilizado para seu crescimento (CARVALHO & SATO, 2001). 
Segundo AIBA et., al. (1973), fósforo, potássio enxofre e magnésio são os minerais mais encontrados na composição de microrganismos, e estes e outros elementos presentes em quantidades significativas devem ser suplementados ao meio de cultura. A seguir, são mostrados na Tabela 2 os constituintes inorgânicos de leveduras.
Tabela 2 – Constituintes inorgânicos das leveduras
4.3 – Microrganismos e contaminantes.
4.3.1– Crescimento Microbiano.
Segundo ANGELIS (1987) as leveduras têm seu ciclo de reprodução quase sempre vegetativo conhecido por germinação ou brotamento.
Em condições normais onde ocorre reprodução de microrganismos a curva de crescimento geralmente ocorre da forma apresentada pela figura 2. Esta curva apresenta quatro fases distintas: fase de latência; fase logarítmica; fase estacionaria; fase de declino ou destruição dos microrganismos. As seguintes fases se apresentam:
Figura 4 – Número de microrganismos X tempo.
Fonte: GAVA 1998
Fase de latência (AB) – também conhecida como fase estacionaria ou fase lag. Nesta fase, a célula procura se adaptar ao novo meio, não havendo, portanto multiplicação celular, sendo que algumas vezes pode ocorrer redução no numero de células viáveis (PENNA & LIMA, 2007). A duração desta fase é influenciada por vários fatores como: idade da cultura utilizada como inóculo, quantidade de inóculo, tempo de geração, tipo de microrganismo, características do meio (pH, oxigênio, temperatura, etc) (GAVA, 1998).
Fase logarítmica (BC) – ou fase log, quando o ritmo do crescimento é máximo. Esta fase chega ao seu final por diversos motivos, entre os quais podemos citar autilização de todos os nutrientes e a produção de metabólicos tóxicos ao próprio microrganismo (GAVA, 1998).
Segundo PENNA & LIMA (2007), a velocidade de crescimento nesta fase dX/dt é uma função de massa X e a velocidade específica μ é constante. Esta fase ocorre quando a quantidade de nutrientes é superior a necessidade.
Fase estacionária (CD) – quando o número de células permanece constante (GAVA, 1998). Segundo PENNA & LIMA (2007) nesta fase o numero de células que nascem é igual ao número de células que morrem. As possíveis causas desta parada de crescimento podem estar relacionadas com o acumulo de metabólicos tóxicos no meio, esgotamento de nutrientes e esgotamento de O2.
Fase de destruição (DE) – durante este período o numero de células viável decresce em face das condições adversas do meio (GAVA, 1998). PENNA & LIMA (2007), ressalta que depois de um tempo as células que morrem são em quantidade superior as que surgem. Eventualmente o meio pode se esterilizar.
4.3.2 – Leveduras Selvagens.
Segudo BASSO (2010) a fermentação está sujeita a contaminações, tanto bacterianas como também por leveduras do ambiente, ditas como selvagens. BASSO (2010) conduziu um estudo avaliando 326 linhagens selvagens isoladas nas últimas 4 safras de diversas destilarias, ele obteve um resultado que a grande maioria dos isolados acarreta sérios problemas na fermentação. Assim cerca de 63% dos isolados se mostraram formadores de espuma em excesso, 32% flocularam “per se” (ou seja, sem a indução por bactérias) e 53% não metabolisaram todo açúcar do mosto. Deste universo entre 3 a 5% dos isolados não eram Saccharomyces, com predominância dos gêneros Schizossacharomyces, Cândida e Bretanomyces (Dekkera), as quais uma vez instaladas no processo acarretam sérios prejuízos (BASSO, 2010).
Dessa forma apenas uma parcela diminuta das linhagens selvagens isoladas é que poderiam, mediante um processo seletivo posterior, resultar em linhagens com perspectiva de serem empregadas na indústria (BASSO, 2010).
O controle da contaminação bacteriana é possível a utilização de agentes antimicrobianos, o mesmo não pode ser dito em relação às leveduras selvagens ou “invasoras”. Algumas unidades industriais têm se deparado com problemas atribuídos à presença de leveduras contaminantes que, altamente competitivas dentro das condições existentes, passam a predominar na população de células presentes. A ocorrência dessas leveduras tem sido frequentemente associada a ocasiões em que se verificam reduções significativas da eficiência industrial, com queda no rendimento fermentativo, maior tempo de fermentação e maior formação de espumas pelo aumento da viscosidade (CECCATO-ANTONINI,1998 in: CECCATO-ANTONINI 2010).
Figura 5 – Efeitos das bactérias e leveduras selvagens na fermentação. 
 Adaptado de Alcoolbrás (2005) por: CECCATO-ANTONINI(2010)
4.3.4 – Contaminantes.
Os maiores prejuízos causados pela contaminação bacteriana são a degradação da sacarose e a formação dos ácidos lático e acético que ocasionam perda de açúcar e intoxicação das leveduras (YOKOYA & OLIVA-NETO, 1991; FREDERICK, 1994). Os contaminantes bacterianos presentes nas linhas de caldo causam perdas de sacarose que variam de 1 Kg.ton-1 de cana quando as condições são satisfatórias até 2,5 Kg.ton-1 de cana quando não são adequadas (YOKOYA, 1991).
Segundo GALLO (1991), alguns estudos realizados no exterior indicam que 13 % das perdas causadas pela contaminação bacteriana é devido à inversão, 25 % à atividade de enzimas livres e 62 % ao crescimento bacteriano nas moendas. YOKOYA (1991) enfatiza que é possível reduzir entre 17 e 35 % das perdas de sacarose devido às conseqüências da presença de microrganismos contaminantes apenas com o uso de práticas adequadas de limpeza e uso correto de agentes antimicrobianos.
A redução no rendimento da fermentação devido a contaminação por bactérias láticas é clara, pois quando uma molécula de glicose é convertida em duas de ácido lático, esta deixaria de produzir duas moléculas de etanol. Além disso, muitos nutrientes que utilizados na reprodução bacteriana deixam de ser aproveitados pela levedura.
Outro problema causado pela presença de bactérias contaminantes em processos de fermentação alcoólica é a floculação, que ocasiona redução na velocidade de fermentação, além de inconvenientes como entupimento de tubulações, aumento do fundo de dorna, dificuldades de operação das centrífugas devido ao entupimento dos bicos (SERRA et al., 1979; YOKOYA, 1989; YOKOYA & OLIVA-NETO, 1991). Além disso, constata-se que a floculação também dificulta o tratamento ácido de creme de levedura, reduz a eficiência das centrífugas e dos antibióticos comumente utilizados.
Bactérias dos gêneros Acetobacter, Lactobacillus, Bacillus, Clostridium, Enterobacter, Leuconostoc e Streptococcus são os contaminantes mais atuantes e geralmente associados aos fracassos da fermentação alcoólica devido à formação de ácido lático e outros ácidos orgânicos, além de estarem associados a floculação (AMORIM & OLIVEIRA, 1982; SERRA et al., 1979).
AMORIM, et., al. (1981) citaram que, quando a contaminação bacteriana atinge níveis superiores a 1,0x107 células/mL de mosto, pode ocorrer uma significativa queda no rendimento alcoólico. Os autores associaram às bactérias contaminantes perdas a níveis de até 55% do valor teórico. ALTERTHUM et al. (1984) verificaram quedas no rendimento alcoólico variável de 14 a 90% do teórico quando a concentração bacteriana atingiu 108 a 109 células/mL.
Amorim & Oliveira (1982) citaram que as bactérias contaminantes causam prejuízos à fermentação e inibem o crescimento da levedura através da produção de ácido láctico e outros ácidos orgânicos. Os autores constataram queda de 60% no rendimento de fermentações com valores de acidez entre 5 e 6 g/L; o não controle da contaminação bacteriana pode ocasionar indiretamente um abaixamento no rendimento da fermentação por dois motivos: aumento da viscosidade do vinho, ocasionando uma maior perda do fermento no vinho centrifugado e maior consumo de açúcar, desviando-o da produção de álcool.
4.4 – Sistemas de fermentação.
4.4.1 – Processo descontínuo
O processo de fermentação descontínua ou em batelada, o substrato e as células da levedura são adicionados juntos ao bioreator, sendo efetuado um inóculo por tanque. Os únicos materiais adicionados durante a fermentação são, soluções para controle de pH e anti-espumantes e o removido é os gases. Terminada a fermentação, descarrega-se a dorna e o meio fermentado segue para os tratamentos finais. Então, deve-se lavar a dorna, esterilizá-la e recarregá-la com mosto e inóculo. Uma das vantagens da operação em batelada (processo descontínuo) é a maior flexibilidade que pode ser alcançada usando um bioreator para várias especificações de produtos (SCHMIDELL et., al. 2001).
Por outro lado, a principal desvantagem da fermentação descontínua é o tempo gasto entre as bateladas, compreendendo a carga e descarga do fermentador, a limpeza, esterilização e a reinício do processo. Outra desvantagem é que a fermentação em processo descontínuo pode levar a baixos rendimentos e/ou produtividades, quando o substrato adicionado de uma vez só no início da fermentação exerce efeitos de inibição, repressão ou desvia o metabolismo celular para formação de produtos que não interessam (CARVALHO & SATO, 2001).
Em escala industrial, o processo descontínuo foi adaptado tendo em vista otimizar a produção, de modo a atender o objetivo de diferentes indústrias (BORZANI, 1975). No caso das destilarias de álcool, o processo com recirculação de microrganismo foi utilizado e como o próprio nome indica, usa como inóculo o microrganismo da batelada anterior. Para isto, o meio fermentado é centrifugado, separando assim as células e reutilizando-as. No entanto, como há a tendência de aumentar o número de contaminantes a cada nova batelada, as usinas normalmente empregam uma metodologia para eliminá-los. Consiste num tratamentodo leite de levedura (suspensão de leveduras altamente concentrada, obtida a partir da centrifugação do meio fermentado) com água e ácido sulfúrico. Deixado nessas condições, sob agitação por 2 a 3 horas, proporciona a eliminação de contaminantes, bem como de células que já se apresentam em fase de degeneração (CARVALHO & SATO, 2001)
4.4.2 – Processo descontínuo alimentado
Segundo DREWS (1964), a fermentação clássica em batelada simples ou descontínua foi rapidamente substituída pelo processo Melle-Boinot. Em meados dos anos 70 praticamente todas as destilarias já operavam o processo de batelada alimentada. Esta fermentação é como a batelada, somente diferenciada pela alimentação crescente de substrato (sem purga, que é a retirada do microorganismo ou seu produto do metabolismo, e até o volume máximo deste), seguindo a curva de crescimento da massa celular e conseqüente taxa de consumo de substrato, de maneira que as concentrações de açúcares totais permaneçam baixas e constantes, de modo que este não represente um fator de inibição do crescimento celular (BORZARINI, 1975).
Devido à flexibilidade de utilização de diferentes vazões de enchimento de dornas com o meio nutriente, é possível controlar a concentração de substrato no fermentador, de modo que, por exemplo, o metabolismo seja deslocado para uma determinada via metabólica, levando ao acúmulo de um produto específico (CARVALHO & SATO, 2001)
O processo descontínuo alimentado (ou batelada alimentada) é definido como uma técnica onde um ou mais nutrientes são adicionados ao fermentador durante o cultivo e os produtos permanecem no fermentador até o final da fermentação.
O processo se baseia na alimentação contínua e crescente do substrato à dorna Neste processo é empregado um tratamento ácido (pH entre 2,5 e 4,5) do creme de leveduras, com a finalidade de eliminar contaminantes e utilização deste como inóculo para a próxima batelada. Este método é utilizado na produção de levedura de panificação (CARVALHO & SATO, 2001).
4.4.3 – Processo contínuo
No processo contínuo, o material nutriente (o caldo de cana que é uma fonte rica em carbono e outros nutrientes) é bombeado continuamente dentro de uma dorna agitado, onde os microrganismos estão ativos e ao mesmo tempo, o produto é retirado do sistema (álcool). Neste tipo de processo, é essencial manter um volume de cultura constante (FACCIOTTI, 2001). O produto, o qual é retirado do topo de um bioreator, contém etanol, células e açúcar residual. A manutenção de volume constante de líquido no reator é de primordial importância, a fim de que o sistema atinja a condição de estado estacionário, condição na qual as variáveis de estado (concentração de células, de substrato limitante e de produto) permanecem constantes ao longo do tempo de operação do sistema (FACCIOTTI, 2001).
O interesse pelo processo de fermentação contínua no Brasil se intensificou na nos anos 80, devido à redução dos custos de produção e incentivos ao programa. Novos processos foram sendo desenvolvidos e desde então produtos com elevada produtividade são obtidos desta maneira como é o caso da extração à vácuo do álcool que reduz a toxicidade celular do produto produzindo um mosto três vezes mais concentrado. O diferencial do processo está no uso de um tanque a vácuo (o vácuo é obtido pelo uma coluna de água), acoplado ao sistema de fermentação contínua que permite extrair o etanol durante o processo fermentativo (ZARPELON & ANDRIETTA, 1992; ANDRIETTA; STUPIELLO, 1990).
As principais vantagens do processo contínuo de fermentação, em relação ao descontínuo tradicional, são decorrentes da operação em estado estacionário, dentre eles estão: a) aumento de produtividade do processo, em virtude de uma redução do “tempo morto” ou não-produtivo; b) obtenção de caldo fermentado uniforme, o que facilita o projeto das operações de recuperação do produto de interesse; c) manutenção das células em um mesmo estado fisiológico, o que torna o processo contínuo uma excelente ferramenta para estudos de mecanismo de regulação metabólica d) possibilidade de associação com outras operações contínuas de linha de produção; e) maior facilidade no emprego de sistemas de controle mais sofisticado; f) menor necessidade de mão-de-obra (FACCIOTTI, 2001; ANDRIETTA & STUPIELLO, 1990).
O processo contínuo possui algumas desvantagens ou problemas práticos (FACCIOTTI, 2001), que podem limitar o emprego deste tipo de sistema em escala industrial, para alguns processos fermentativos. Assim, podem-se destacar: a) maior investimento inicial da planta; b) possibilidade de ocorrência de mutações genéticas espontâneas, resultando na seleção de mutantes menos produtivos; c) maior possibilidade de ocorrência de contaminações por se tratar de um sistema aberto, no entanto, necessita de manutenção de condições de assepsia nos sistemas de alimentação e retirada de meio; d) dificuldades de manutenção de homogeneidade no reator, quando se trabalha com baixas vazões, ou quando o caldo adquire
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 Resultados
Tanto a fermentação como a produção de massa celular são afetados por diversos fatores como apresentados no texto. Os principais fatores e como eles influenciam na fermentação estão apresentados na tabela 3 a seguir:
Tabela 3 – Principais fatores x Faixa ou condição ideal.
	Fator
	Faixa ou Condição ideal
	
	Massa Celular
	Fermentação
	Temperatura
	25-30°C
	28-38°C
	Oxigênio
	Presença
	Ausência
	Açucares (Brix)
	0,5 - 3 °Brix
	12 - 16 °Brix
	Acidez (PH)
	4 a 6
	4 a 5
	Nutrientes
	*
	*
	Crescimento microbiano
	Fase Log.
	Fase estacionaria
	Leveduras Selvagens
	Nenhuma
	*
	Contaminantes
	Nenhum
	menor que 106 UFC
	* Apresentados no texto a seguir com mais detalhes
A temperatura possui uma faixa ideal apresentado na tabela, fora dessa faixa o crescimento microbiano ou a fermentação tem seu rendimento reduzido pois as enzimas estarão trabalhando fora da sua faixa ótima. Temperaturas muito abaixo dessa faixa retardam o crescimento microbiano e/ou rendimento fermentativo. Temperaturas muito acima dessa faixa podem acarretar a morte dos microrgânicos.
Na ausência de oxigênio a levedura fermenta o mosto, porem durante o processo fermentativo é necessário a aeração do meio para que os microrganismos se reproduzam, pois durante a fermentação ocorre à produção de etanol, este se acumula mo meio e em determinadas concentrações chega a ser toxico diminuindo o numero de células viáveis. Outro motivo da aeração é a morte natural que ocorre nas dornas, pois conforme as leveduras ficam velhas elas tem o rendimento fermentativo diminuído e logo morrem assim precisam ser substituídas. 
Açucares e Brix os teores ideais são apresentados na tabela 3, na produção de massa celular teores inferiores de açúcar pode causar na morte por falta de alimento, teores superiores causam inibição parcial da respiração e estimula a fermentação, retardando o processo de produção de massa. Na fermentação teores inferiores aos apresentados resultam em fermentações mais rápidas porem de baixa concentração de produto final, podendo causar morte dos microrganismos por falta de alimento, caso não realimentados no momento certo, caso de teores superiores ocasiona fermentações mais lentas e por ventura incompleta, podendo gerar subprodutos indesejados, e perdas de açúcar.
Quando um microrganismo se encontrar fora da faixa ideal de atividade, ocorre o retardamento das reações enzimáticas e possível morte quando essa atividade cessa, isso ocorre em zonas de pH onde a quantidade de íons H+ ou OH- é tão grande que chega destruir enzimas e as próprias células.
Os nutrientes são de fundamental importância, pois são necessários para formação de aminoácidos e constituintes de enzimas e proteínas vitais para as leveduras. A maioria deles está presente no mosto, pois são exigidos em pequenas quantidades, porem algumas vezes é necessário uma complementação. 
Tratando se de do crescimento microbiológico para leveduras,quando para obtenção de massa celular é importante que eles sejam mantidos na fase log como apresentado no item 4.3.1, pois o número de microrganismos aumenta exponencialmente, já na fermentação é interessante que a fase estacionaria seja mantida, pois enquanto a levedura fermenta o numero de células na dorna é mantido assim o consumo de açúcar para a manutenção do numero de células é somente o essencial.
Na obtenção de massa celular utilizado como fermento para pé de cuba utiliza-se mosto esterilizado, portanto o problema com leveduras selvagens e microrganismos contaminantes é praticamente eliminado. Já na fermentação onde o caldo não é pré tratado, ocorrem problemas com contaminantes que podem ser resolvidos com a utilização de antibióticos e / ou tratamento com acido, porem quanto as leveduras selvagens o problema é mais grave, pois os tratamentos não são eficazes sendo necessário renovação periódica das leveduras, com o descarte daquelas contaminadas.
Cada processo fermentativo apresenta suas vantagens e desvantagens, influenciando no tipo de controle que pode ser exercido em relação aos fatores que afetam a fermentação.
Conclusão
O conhecimento sobre os fatores e sua influencia no processo é de fundamental importância para o controle tanto para produção de massa de leveduras para fabricação de fermento como para a fermentação visando a produção de etanol assim como outros produtos.
A relação oxigênio x concentração de açúcares do meio é de fundamental importância para determinação do tipo de via metabólica desejada, resultando em produtos diferentes de acordo com a via determinada pelo processo. No caso de S. Cerevisiae a produção de etanol ou massa celular.
As interferências no processo devem ser feitas no momento correto para evitar perdas, morte de leveduras e redução de eficiência, para cada fator é necessário uma medida corretiva diferente, o tipo de condução de fermentação também influencia muito no tipo de controle a ser aplicado.
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