Diagnóstico Molecular da Anemia Falciforme

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DIAGNÓSTICO MOLECULAR
DE ANEMIA FALCIFORME
MANUAL DA OFICINA PRÁTICA DE GENÉTICA, GENOMA E BIOTECNOLOGIA,
2004.
Pontifícia Universidade Católica de Goiás
Escola de Ciências Médicas, Farmacêuticas e Biomédicas
Módulo de Hematologia – 2° turma 2017/2
Goiânia – Setembro de 2017
Discentes: Thais Regina dos Santos e 
Thuanny Cordeiro do Carmo
Prof. Dr. Luiz Murilo Martins
INTRODUÇÃO À ANÁLISE MOLECULAR
Avanços na pesquisa molecular
Diagnóstico mais frequente de
doenças genéticas
Pode indicar indivíduos 
portadores de alelos mutantes, 
mesmo que não haja sintomas.
INTRODUÇÃO À ANÁLISE MOLECULAR
Síndromes onde a mãe, geralmente assintomática, 
apresenta 50% de chance de gerar um filho homem 
acometido pela doença em questão.
Síndromes genéticas recessivas 
ligadas ao cromossomo X 
Análise molecular
Riscos de gerar um 
individuo afetado
INTRODUÇÃO À ANÁLISE MOLECULAR
A análise molecular pode ser realizada através de
diferentes técnicas, definidas a partir de
características moleculares específicas da doença em
questão, tais como:
• Ocorrência e frequência de
mutações em determinadas
populações;
• Localização da mutação;
• Características específicas 
do gene em questão;
• Tipo de mutação
• mutação pontual
• grandes deleções
• inserções
• outras.
INTRODUÇÃO À ANÁLISE MOLECULAR
• Neste estudo foi realizado o diagnóstico
molecular da anemia falciforme através da
análise molecular de indivíduos normais,
heterozigotos e homozigotos para a mutação
HbS no gene da beta-globina
ANEMIA FALCIFORME
• Faz parte de um grupo de doenças genéticas recessivas 
hereditárias chamadas de hemoglobinopatias.
Anemia Falciforme
• podem consistir de variações estruturais na hemoglobina, 
ou de talassemias. 
Hemoglobinopatias
• alta incidência em regiões endêmicas e possui
características específicas de acordo com a região e
população em estudo.
Malária
ANEMIA FALCIFORME
• É de grande valia na análise genética de indivíduos
acometidos por algum tipo de hemoglobinopatia
Origem étnica 
• a chamada Hemoglobina S (HbS) possui maior significado
clínico, apresenta altas incidências na África, Arábia
Saudita e Ìndia
Variação estrutural
• atualmente encontra-se indivíduos afetados por diferentes
formas de hemoglobinopatias no mundo inteiro.
Migração populacional
ANEMIA FALCIFORME
• Os indivíduos portadores de dois alelos HbS (homozigotos)
são acometidos de Anemia Falciforme. Já os indivíduos
heterozogitos levam uma vida normal, embora suas
hemácias tenham uma meia-vida mais curta.
Alelos
• Anemia crônica e episódios de dor severa. Os sintomas são
consequência de uma alteração estrutural específica na
molécula de hemoglobina S.
Características
• O formato de foice impede que a mesma circule livremente
pelos capilares, podendo haver interrupção de fluxo
sanguíneo e morte tissular.
Molécula Hb S
ANEMIA FALCIFORME
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A MOLÉCULA DE HEMOGLOBINA
• Hemoglobina: proteína levemente esférica composta
por quatro subunidades: duas alfa, com 141 resíduos
de aminoácidos cada uma, e duas beta com 146
resíduos.
• A cadeia alfa é codificada pelo gene alfa-globina
enquanto a cadeia beta é codificada pelo gene
beta-globina.
A MOLÉCULA DE HEMOGLOBINA
Hemoglobina com as quatro cadeias peptídicas.
A MOLÉCULA DE HEMOGLOBINA
• Cada cadeia da hemoglobina
possui em seu interior um radical
heme que contém um átomo de
ferro.
• A Hb nada mais é que um
carregador do átomo de ferro,
que é altamente reativo e fica
fortemente ligado à proteína
quando a mesma circula pelo
sangue. Radical hemo com o
átomo de ferro no centro
A MOLÉCULA DE HEMOGLOBINA
Forma de uma proteína
Estrutura 
secundária
Estrutura 
terciária
Estrutura 
quaternária
Estrutura 
primáriaSequência de aa.
DNA
A MOLÉCULA DE HEMOGLOBINA
http://experimentoteca.com/biologia/perguntas/banco-de-questoes-genetica-hemoglobina-e-anemia-falciforme-2/
• Enquanto na hemoglobina normal há o ácido glutâmico ocupando a sexta
posição da sequência, na hemoglobina S é a valina que ocupa esta posição.
A MOLÉCULA DE HEMOGLOBINA
• A região do cromossomo 11, onde o gene da beta
globina está localizado, contém vários outros genes
relacionados, sendo a região denominada de região
cluster da beta globina.
• Nesta região há vários polimorfismos, que podem
envolver mais de um gene.
• Cada um dos padrões de polimorfismo é chamado
de haplótipo.
A MOLÉCULA DE HEMOGLOBINA
• Certos haplótipos são encontrados nos cromossomos
que carregam a hemoglobina mutante (Hb S) e
podem estar associados com a severidade clínica da
doença.
• No homem: 7 cadeias diferentes de hemoglobina
que se associam durante o desenvolvimento para
produzir 7 hemoglobinas diferentes. Cada uma
dessas cadeias é codificada por um gene
independente.
TÉCNICAS MOLECULARES
• Há várias técnicas para diagnóstico molecular;
• Todas têm como princípio básico o isolamento do
gene (ou região) do genoma onde localiza-se a
alteração que se quer analisar;
• É essencial que se conheça que gene, ou genes, são
responsáveis pela ocorrência da doença.
TÉCNICAS MOLECULARES
Fibrose cística
Doenças podem ser causadas 
por mais de um defeito genético 
Mais de 500 mutações no gene
conhecido como CFTR
Diagnóstico molecular facilitado quando se
conhece a mutação especifica da família.
TÉCNICAS MOLECULARES
Mutações 
pontuais
Causadas pela alteração de um único nucleotídeo
Anemia Falciforme
Deleções Distrofia Muscular de Duchenne
Expansão de 
nucleotídeos 
repetidos
Doença de Huntington 
Síndrome do X-frágil
Distrofia Miotônica
TÉCNICAS MOLECULARES
Identificada através de mudança no padrão 
eletroforético da hemoglobina, ou através da 
presença ou ausência do sítio de clivagem da 
enzima de restrição no gene da beta globina. 
Mutação falciforme
TÉCNICAS MOLECULARES
Neste estudo foi realizado o diagnóstico molecular
de Anemia Falciforme através da técnica de PCR e
posterior análise por enzimas de restrição de DNA
extraído de sangue.
EXTRAÇÃO DE DNA DE SANGUE
• Três etapas:
• Quebra da membrana celular para que o núcleo 
seja liberado; 
• Quebra da membrana do núcleo para liberação 
do DNA;
• Isolamento do DNA através de precipitação em 
solução com álcool e sal.
EXTRAÇÃO DE DNA DE SANGUE
• Estas etapas podem ser feitas com o uso de
detergentes, temperatura, processos mecânicos ou
processos enzimáticos;
• Kits comerciais para a extração de DNA dos mais
variados tecidos;
• No sangue, é necessário que todo o grupamento
heme presente nas hemoglobinas sejam removidos
– o ferro, altamente reativo, interfere nas reações
enzimáticas realizadas em seguida.
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
Princípio
a partir de quantidades mínimas de
DNA, multiplicar uma determinada
sequência, de modo que esta se torne
majoritária na amostra.
fragmento de DNA que desejamos
amplificar para o estudo – β globina
DNA 
alvo
Primers
pequenos fragmentos de DNA
complementares às extremidades
da região que se pretende
amplificar.
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
MIXPrimers DNTP
Taq
pol
DNA
alvo
Síntese do DNA
Nucleotídeos livres 
(adenina, guanina, timina e citosina)
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
95ºC
• Separação das fitas de DNA.
• Os primers se ligam às regiões complementares das fitas de DNA que 
estão separadas. 
72ºC
• A Taq irá promover a síntese de DNA somente a partirda região.
95ºC
• Nova separação de todo DNA em fitas simples. Ao final do primeiro
ciclo há duas fitas da molécula original de DNA, mais duas cópias da
região de interesse.
• Os primers irão se ligar aos 4 sítios nas novas duas cópias e também 
na molécula original de DNA.
72ºC
• As 4 fitas individuais são copiadas em 8.
Esses ciclos são repetidos geralmente 30 vezes.
55 a 
65ºC
55 a 
65ºC
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
• Os ciclos realizados num termociclador.
• Ao final dos ciclos de amplificação existem,
aproximadamente, 1 milhão de cópias do segmento
de DNA de interesse para cada molécula molde
originária da amostra inicial.
• É assim que podemos selecionar um fragmento
específico dentro de todo o genoma.
ANÁLISE COM ENZIMAS DE 
RESTRIÇÃO
Endonucleases
Proteínas bacterianas que cortam em
fragmentos a longa molécula linear de DNA.
São as principais ferramentas da tecnologia do
DNA recombinante.
Uma enzima de restrição reconhece uma sequência
específica de nucleotídeos, como AGCT, cortando o DNA
nos locais onde esta combinação de “letras” ocorrer.
ANÁLISE COM ENZIMAS DE 
RESTRIÇÃO
O número de pedacinhos produzido é estabelecido pelo número 
de sítios de restrição reconhecido pela enzima utilizada.
A digestão de DNA por enzimas de restrição é 
um processo simples
Quando o DNA é colocado em contato com a enzima a uma
temperatura ideal (geralmente 37°C), a enzima inicia o processo de
digestão imediatamente, cortando o DNA em diversos pedacinhos.
ANÁLISE COM ENZIMAS DE 
RESTRIÇÃO
ANÁLISE COM ENZIMAS DE 
RESTRIÇÃO
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
• O DNA é carregado em um poço do gel e este é submetido
a um campo elétrico.
• O DNA irá se mover na direção do pólo positivo, uma vez
que a molécula de DNA é negativa, devido à presença de
grupamentos de fosfato.
Eletroforese
é a técnica pela qual fragmentos de DNA
de diferentes tamanhos são separados
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
https://www.clentlifescience.co.uk/pcr-mastermix-
products/hotshot-diamond-pcr-master-mix
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
• Durante a corrida eletroforética, os fragmentos de menor
tamanho correm mais rapidamente que os fragmentos
maiores e, deste modo, a posição relativa dos
fragmentos no gel depende dos tamanhos dos mesmos.
• Após a corrida eletroforética, o gel deve ser tratado
com um corante específico para que se possa observar os
fragmentos de DNA.
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
• Por convenção, os géis são interpretados da esquerda
para a direita, com os poços orientados para cima e as
amostras são aplicadas no poço da esquerda para a
direita.
• O DNA das amostras ficará separado no gel de acordo
com o tamanho, sendo que os menores migraram mais
enquanto que os maiores migraram menos.
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
http://www.ageracaociencia.com/2016/01/14/a-tecnica-de-eletroforese/
QUESTÕES ÉTICAS DO DIAGNÓSTICO 
MOLECULAR
• 5 a 10% das mulheres afetadas apresentam a
forma hereditária da doença;
• Pelo menos dois genes podem estar envolvidos neste
tipo de câncer: BRCA 1 e BRCA 2;
• Mutações em um destes dois genes aumentam as
chances de desenvolver câncer de mama em algum
momento da vida;
• 90% dos casos de câncer de mama são esporádicos.
Câncer de mama
QUESTÕES ÉTICAS DO DIAGNÓSTICO 
MOLECULAR
• Ainda não existe cura definitiva para o câncer de
mama, embora a remoção do seio ou parte do
mesmo, e tratamentos específicos podem reduzir os
riscos de ocorrência da doença;
• Mulheres que possuem familiares com câncer de
mama ou ovário apresentam maior probabilidade
de terem alterações genéticas;
• Estas mulheres têm sido encorajadas a realizarem
mamografias e o auto-exame da mama desde
jovens.
QUESTÕES ÉTICAS DO DIAGNÓSTICO 
MOLECULAR
• Muitos médicos e cientistas acreditam que quanto
mais cedo o câncer for detectado, maiores são as
possibilidades de tratamento assim como as chances
de sobrevivência do paciente.
• No entanto, estes procedimentos, incluindo o
monitoramento por mamografias, ainda estão em
discussão na comunidade científica quanto à eficácia
em reduzir a taxa de mortalidade.
QUESTÕES ÉTICAS DO DIAGNÓSTICO 
MOLECULAR
• Vários laboratórios já realizaram o teste genético
para estes genes.
• A principal técnica utilizada é a PCR e várias
regiões destes dois genes são analisadas para
possíveis mutações.
• O resultado geralmente leva uma ou duas semanas e
é mantido sob sigilo.
SOBRE A ANÁLISE MOLECULAR
A análise genética pode expor uma pré-condição
antes desconhecida ao indivíduo, podendo ter sérias
implicações psicológicas para o mesmo.
As vezes, nem todos os indivíduos de uma mesma
família têm a mesma posição em relação á análise
genética e a realização do teste genético em um
indivíduo pode expor todo o resto da família
Há ainda casos onde a decisão da realização de um
diagnóstico genético está sob responsabilidade dos
pais, e não do indivíduo em questão.
SOBRE A ANÁLISE MOLECULAR
Além disso, em muitos países já existe a preocupação
de que este tipo de informação possa ser usada por
seguradoras de saúde na hora de negar cobertura
ao indivíduo sob a alegação de que se trata de
condição médica pré-existente
A maioria das doenças genéticas hereditárias ainda
não possui tratamento e por isso muitos indivíduos
argumentam que não há sentido em se buscar uma
informação que poderá apenas trazer danos
psicológicos ao indivíduo, não sendo de nenhuma
forma útil para o tratamento do paciente.
SOBRE A ANÁLISE MOLECULAR
Há quem diga que o diagnóstico molecular pode
ajudar o indivíduo a tomar certas decisões pessoais,
como constituir ou não família, ter filhos, fazer seguro
de vida, etc.
Este tipo de debate é especialmente visto em casos
de doenças genéticas de manifestação tardia como,
por exemplo, a Doença de Huntington.
Qual sua opinião em relação a estas questões?
OBRIGADA!