Relatório PROTEINAS

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INTRODUÇÃO 
 
As proteínas são substancias orgânicas constituídas por aminoácidos 
(Aa) unidos entre si, formando uma cadeia polipeptídica. 
As finalidades de uma proteína, em qualquer ser vivo, costumam ser 
uma das duas seguintes: estrutural ou funcional. Digamos, como referencia 
apenas, que um conjunto de proteínas constitui o musculo do coração, visível a 
olho nu, e o outro conjunto faz o órgão funcionar. Nessa base, as proteínas 
são, por exemplo a estrutura que garante a força do movimento muscular, a 
ligação dos músculos com os ossos e destes entre si. Além disso, são a base 
estrutural do sistema nervoso. 
Um animal superior é um conjunto de proteínas estruturadas de modo a 
uma encaixar perfeitamente na outra, esta pilha tem milhares de proteínas 
diferentes. Se uma delas perde a sua conformação original, chamada nativa, 
não se encaixa mais em suas vizinhanças, e o conjunto todo acaba se 
desorganizando. Por isso afirmamos que forma é igual à função, e essa 
mudança de conformação chamamos de desnaturação. 
Quando o agente agressivo se aprofunda, chegamos a casos de lesão 
das estruturas protéicas que são chamadas de hidrólise, coagulação, 
precipitação, etc. em todas as vezes, essas lesões são posteriores à 
desnaturação, ocorrem sobre proteínas já desnaturadas. 
As proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que 
está relacionada com suas propriedades físicas e biológicas. A modificação na 
estrutura tridimensional nativa de uma proteína, com a consequente alteração 
de suas propriedades é conhecida como desnaturação. A desnaturação 
envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária de 
proteínas, mas não da primária. A desnaturação, usualmente decresce a 
solubilidade das proteínas, a diminuição da solubilidade pode ser explicada 
pela exposição de radicais hidrofóbicos e outros que prejudiquem a interação 
proteína-água e favoreçam a interação proteína-proteína. A floculação e a 
coagulação, que muitas vezes são confundidos com desnaturação de 
proteínas, são manifestações visíveis das alterações estruturais causadas 
pelos agentes desnaturantes. 
O grau de dissolução depende da interação entre soluto e solvente. 
Quanto maior for a interação entre a proteína (soluto) e a água (solvente), 
maior a quantidade de proteína se dissolverá. O oposto também vale: quanto 
menor o grau de interação soluto/solvente, menor será o índice de dissolução. 
O resultado combinado das interações eletrostáticas envolvidas no 
salting in são ainda discutíveis, mas não é discutível que nele aumenta muito a 
interação soluto/solvente. No salting out, o excesso de sais domina as cargas 
de solvente. Então o soluto tem pouco onde se agarrar e, dessa forma, 
aumenta a interação soluto/soluto e diminui a interação soluto/solvente, 
podendo acontecer a precipitação das proteínas. 
Esse princípio, além de interesse fisiológico, também é extremamente 
útil como processo de separação das proteínas presentes em um determinado 
meio. Jamais duas proteínas diferentes têm o mesmo coeficiente de 
solubilidade a uma mesma concentração de sais. 
 
OBJETIVOS 
 
 Caracterizar a presença de proteínas em material biológico. 
 Demonstrar as reações de coloração para proteínas. 
 Verificar experimentalmente a precipitação de proteínas com e sem 
desnaturação. 
 Relacionar as observações práticas com a teoria de propriedades gerais, 
estrutura e isolamento de proteínas. 
 
MATERIAIS E MÉTODOS 
 
Solução de proteínas a 10% 
Hidróxido de sódio 2,5 mol/L 
Ácido tricloroacético (TCA) a 10% 
v/v 
Álcool etílico absoluto 
Cloreto de sódio 1 mol/L 
Solução saturada de sulfato de 
amônio 76,6g% p/v 
Solução de ninhidrina 0,1% 
Solução de sulfato de cobre a 1% 
Acetato de chumbo a 5% p/v 
Clara de ovo in natura 
Solução de Bradford 
 
Preparo da solução com clara de ovo 
 
Em um béquer, com solução de cloreto de sódio (0,9g%) em 100mL de 
água, adicionou-se 10mL de clara de ovo 10% para homogeneização da 
proteína do ovo. 
 
Experimento 1 – Reação com Ninhidrina 
 
Após o preparo do reagente de ninhidrina, numerou 2 tubos de ensaio e 
em seguida adicionou-se 2mL do reagente ninhidrina e 5 gotas em um tubo 
para o teste de coloração e no segundo tubo foi feito o teste branco da reação 
com 2mL do reagente ninhidrina e 5 gotas de água para comparar os 
resultados, o tubo com a proteína foi levado a fervura por 5 minutos em banho 
maria à 100ºC. 
A reação da Ninhidrina é de extrema importância na Bioquímica e é 
utilizada na detecção de aminoácidos por ter a característica amina primária. 
 
Experimento 2 – Reação do Biureto 
 
Após o preparo do reagente do Biureto, adicionou-se em 2 tubos de 
ensaio, 1mL da proteína a 10%, 5 gotas de hidróxido de sódio e 3 gotas de 
sulfato de cobre a 1% para o teste de coloração, no segundo foi feito o teste 
branco da solução com 1mL de água destilada, 5 gotas de hidróxido de sódio e 
3 gotas de sulfato de cobre a 1%. 
O reagente de biureto é um reagente analítico feito de hidróxido de 
potássio (KOH) e sulfato de cobre (CuSO4), junto com tartarato de sódio e 
potássio (KNaC4H4O6·4H2O). Este reagente de coloração azul torna-se violeta 
na presença de proteínas, e muda para rosa quando combinado 
com polipeptídeos de cadeia curta. 
 
Experimento 3 – Reação de Bradford 
 
Após o preparo do reagente de Bradford, em um tubo de ensaio 
adicionou-se 1 mL do reagente de Bradford e 0,1 mL da proteína, foi feito em 
outro tubo de ensaio o branco, com 1 mL do reagente de Bradford e 0,1 mL de 
água destilada e observou-se o resultado. 
 
Experimento 4 – Quantificação de Proteína pelo método de Bradford e 
Biureto. 
 
Proteínas: 
Clara do ovo 
Albumina 
Azocazeína 
Leite em pó (1%) 
Gelatina (1%) 
BSA 
 
Parte 1 – Método Bradford. 
 
Em 7 tubos de ensaio foram colocados 0,5 mL do reagente de Bradford 
que já estava preparado, 0,1 mL de cada uma das amostras de proteína e 1 mL 
de água destilada, sendo um desses o branco da reação. Após o preparo das 
soluções de proteína com o reagente, foram lidas em espectrofotômetro a 
595nm. 
 
Parte 2 – Método Biureto 
 
Em 7 tubos de ensaio foram colocados 0,5 mL de cada uma das 
amostras de proteína e 2 mL do reagente de Biureto. Após esse procedimento 
foram lidas em espectrofotômetro. 
 
Experimento 5 – Precipitação por sais neutros 
 
Em dois tubos de ensaio foram colocados 2mL de proteína, e em um 
deles foi colocado 4mL de solução saturada de sulfato de amônia, no outro 
2mL de solução de cloreto de sódio. 
 
Experimento 6 – Precipitação por calor 
 
Em um tubo de ensaio foi colocado 5mL da proteína e levado a fervura 
por 5 minutos. 
 
Experimento 7 – Precipitação com solventes orgânicos. 
 
Em dois tubos de ensaio, foi colocado 2 mL de proteína com 4mL de 
etanol gelado, uma das amostras foi acrescentado NaCl. 
Foi feito os procedimentos descritos acima, usando dessa vez a 
acetona. 
Em dois micro tubos foi colocado 0,5 mL de proteína e 1,5mL de 
Clorofórmio e outro com Fenol. 
 
Experimento 8 – Precipitação por solventes inorgânicos. 
 
Em um tubo de ensaio foi colocado 1mL de proteína e 1mL de ácido 
tricloroacético. 
Foi repetido o procedimento acima usando acetato de chumbo. 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
Preparo da solução com clara de ovo 
 
A precipitação de proteínas em solução salina é um processo importante 
para separar misturas complexas de proteínas, uma vez que a concentração de 
sal necessário é diferente para cada proteína. 
 
Experimento 1 – Reação com Ninhidrina 
 
Incialmente tinhauma coloração transparente. Após o aquecimento do 
tubo, pode observar que apareceu uma coloração de violeta claro. A reação de 
ninhidrina é uma reação corada própria de aminoácidos, por a ninhidrina ser 
um agente oxidante muito poderoso, reage com o aminoácido da cadeia, que 
dá origem a um composto de cor púrpura que varia de cor. 
 
 
Branco da Reação 
 
 
Reagente Ninhidrina 
 
Experimento 2 – Reação do Biureto 
 
Observou que no branco da reação, não houve alteração de cor, sendo 
esta transparente. Na reação com a proteína observou o aparecimento de uma 
cor violeta. Uma vez que a reação do biureto é caracterizada por identificar a 
presença de proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos, 
no qual uma substancia adicionada, o sulfato de cobre interage com as 
ligações peptídicas e por isso ocorre a coloração. 
 
 
Branco da reação 
 
Reagente Biureto 
 
Experimento 3 – Reação de Bradford 
 
No tubo com o branco da reação, pode observar que tinha uma cor 
marrom. Já no tubo em que foi adicionada a proteína, obteve-se uma cor azul 
escura. O método de Bradford é baseado na interação entre o corante BG-250 
e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais 
básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto 
peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do 
corante para a forma aniônica e ocorrendo a mudança de coloração. 
 
 
Branco da Reação 
 
 
Reagente Bradford 
 
Experimento 4 – Quantificação de Proteína pelo método de Bradford e 
Biureto. 
 
Método de Bradford 
 
Em cada amostra de proteína pode observar diferentes tons de azul, 
exceto na amostra de azocazeina que teve uma cor verde. 
 
Ovoalbumina – cor azul 
 
Albumina – cor azul 
 
Azocazeína – cor verde 
 
Leite em pó (1%) – cor azul opaca 
 
Gelatina (1%) – cor azul 
 
BSA – cor azul 
 
Branco – cor turquesa 
 
 
Método de Biureto 
 
Em todas as amostras observou também diferentes tons de azul, exceto 
na de azocazeina que teve uma cor marrom intensa quase preto. 
 
Clara do ovo – cor azul escuro intenso 
 
Albumina – cor azul intenso 
 
Azocazeína – cor marrom intenso 
 
Leite em pó (1%) – cor azul opaca 
 
Gelatina (1%) – cor azul escuro 
 
BSA – cor azul claro 
 
Branco – cor azul 
 
 
Após a leitura no espectrofotômetro, obtiveram-se os seguintes 
resultados: 
 
 Bradford Biureto 
Ovoalbumina 0,690 µg/mL 0,935 µg/mL 
Albumina 0,810 µg/mL 1,083 µg/mL 
Azocazeína 0,746 µg/mL 5,88 µg/mL 
Leite em pó 1,003 µg/mL 0,986 µg/mL 
Gelatina 0,411 µg/mL 0,398 µg/mL 
BSA 0,577 µg/mL 0,083 µg/mL 
Branco 0 µg/mL 0,034 µg/mL 
 
 
 
Pode-se concluir que após as leituras, o leite em pó foi o que teve maior 
concentração de proteína pelo método de Bradford e a azocazeína teve maior 
concentração de proteínas pelo método do Biureto. 
 
Experimento 5 – Precipitação por sais neutros 
 
Na precipitação com o Cloreto de sódio, notou-se que a proteína se 
solubilizou ainda mais na solução. Já com o sulfato de amônia, percebeu-se a 
solvatação da proteína. 
Quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento 
da força iônica do sistema. Assim, quando adicionamos pequenas quantidades 
de sal a uma solução contendo proteínas, as cargas provenientes da 
dissociação do sal passam a interagir com as moléculas proteicas, diminuindo 
a interação entre elas. A esse fenômeno dá-se o nome de salting-in. 
Quando certa quantidade de sal neutro é adicionada a uma solução 
aquosa de proteína a água, que apresenta um grande poder de solvatação, 
passa a interagir com as duas amostras: as proteínas e os íons provenientes 
da dissociação do sal. Porém, as moléculas de água apresentam maior 
tendência de solvatação de partículas menores (nesse caso, os íons). As 
moléculas de água, ocupadas em sua interação com os íons, abandonam a 
estrutura proteica. Como consequência, temos: maior interação proteína-
proteína, diminuição da solubilidade em meio aquoso e, consequentemente, 
precipitação da proteína. A esse fenômeno de insolubilização da proteína em 
decorrência de um considerável aumento da força iônica do meio dá-se o nome 
de salting-out. 
 
 
Precipitação com NaCl 
 
 
Precipitação com sulfato de amônia. 
 
Experimento 6 – Precipitação por calor 
 
Depois que foi retirada a proteína da fervura, pode perceber-se que ouve 
a precipitação, ficando com um aspecto mais ‘duro’ e branco, ou seja, houve a 
coagulação da proteína. 
As proteínas possuem uma estrutura tridimensional (conformação) bem 
definida, da qual dependem fundamentalmente suas propriedades físicas, 
químicas e biológicas. Essa estrutura é relativamente sensível à ação do calor, 
que causa desorganização das cadeias peptídicas, com consequente alteração 
conformacional. Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação, e altera as 
estruturas quaternária, terciária e secundária da proteína sem afetar sua 
estrutura primária. 
 
 
Precipitação por calor 
 
Experimento 7 – Precipitação com solventes orgânicos. 
 
Percebeu-se que ao colocar o etanol ou a acetona, parte da proteína 
ficou concentrada no meio da solução, após a agitação a proteína se precipitou 
ainda mais. Nas amostras com NaCl percebeu também a a proteína se 
precipitou melhor do que somente com etanol ou acetona. O fenol e o 
clorofórmio, esses solventes precipitam e desnaturam a proteína, com o fenol 
se observou um aspecto leitoso após a sua adição, e com o clorofórmio formou 
duas fases, a proteína se desnaturou e ficou na parte de cima da fase. 
A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em 
água. Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de 
soluto é diferente para cada solvente. 
Os solventes orgânicos apresentam valor de constante dielétrico bem 
inferior à da água, a interação proteína-proteína é maior que o poder de 
solvatação da água (interação água-proteína), consequentemente a proteína 
precipita. 
A ação desses solventes vai depender da sua maior ou menor 
polaridade e, portanto, da sua capacidade de interagir com certos grupos 
laterais das proteínas através de pontes de hidrogênio ou promovendo ruptura 
de ligações hidrofóbicas. 
 
 
Precipitação com etanol 
 
 
Precipitação com acetona 
 
 
Precipitação com fenol 
 
 
Precipitação com clorofórmio. 
 
Experimento 8 – Precipitação por solventes inorgânicos. 
 
Na precipitação com o TCA, observou que a precipitação teve um 
aspecto leitoso, isso ocorre por que o TCA age com as interações básicas da 
proteína. Já o ácido acético se liga com a parte negativa da proteína. 
Os cátions de metais pesados formam precipitados insolúveis de 
proteínas, denominados de acordo com o elemento formador. Essa 
precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). 
Isso porque, acima do pI, a carga líquida sobre a proteína é negativa 
favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal. Quando a 
proteína está abaixo do seu pI, a carga líquida total da molécula é positiva. Isso 
facilita a interação da molécula com os ânions provenientes de ácidos. Nas 
duas situações o precipitado pode ser ressolubilizado através de alterações do 
pH 
 
 
CONCLUSÃO 
 
 As reações de coloração e precipitação de proteínas permitem a 
caracterização dessas pela analise de suas propriedades químicas e físicas, 
como ligações peptídicas, solubilidade e estrutura molecular. As reações de 
coloraçãonão alteram a estrutura da proteína. Várias reações específicas são 
empregadas para detectar cada tipo de proteína, de forma qualitativa e, 
posteriormente, quantitativa. 
 
QUESTIONÁRIO 
 
1- Em que se fundamenta a reação ninhidrina e que classes 
instanciais reagem positivamente? 
Esta reação é utilizada para verificar a presença de aminas em solução, 
dando positivo para proteínas, peptídeos, aminoácidos, aminas primárias e 
amônia. 
Esta reação é muito importante, pois é universalmente utilizado para 
detectar qualitativamente e quantitativamente os aminoácidos. Para os 
aminoácidos esta é a única reação de coloração verdadeiramente importante. 
A ninhidrina (hidrato de tricetoidrindeno) reage com aminoácidos 
produzindo cor púrpura. É uma reação inespecífica quanto à identidade do 
aminoácido, sendo a reação dependente da presença de grupos amina livres. 
 
2- Em que se fundamenta a reação do biureto e que grupos 
proteínas são responsáveis por esta reação? 
Está reação é específica para substâncias que possuem pelo menos 
dois grupos CO-NH unidos por carbono ou nitrogênio como ocorre no biureto, 
que empresta o seu nome para a reação. Biureto é o nome dado à estrutura 
originada a partir da decomposição da uréia, quando esta é submetida a uma 
temperatura de, aproximadamente, 180oC 
 
As proteínas e seus produtos de hidrólise que contém duas ou mais 
ligações peptídicas dão resultado positivo neste teste. A reação é também 
positiva para as substâncias que contém 2 grupos carbamínicos (-CO-NH2) 
ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio. 
Esta é uma reação geral para proteínas. Esse fenômeno deve-se à formação 
de um complexo entre o íon Cu2+, presente no reativo, e os átomos de 
nitrogênio presentes na molécula. 
 
 
 
3- Qual a importância da reação do biureto? 
A reação do Biureto é importante para demonstrar a presença de 
proteínas em materiais biológicos, como também para quantificá-las, uma vez 
que o complexo cobre-proteína apresenta uma absorção máxima 545nm; a 
intensidade da cor depende exclusivamente da concentração de proteína. Para 
que a reação do Biureto seja positiva há necessidade da presença de pelo 
menos duas ligações peptídicas na molécula, portanto, aminoácidos e 
dipeptídeos não dão reação do Biureto positiva. 
 
4- Em que se fundamenta a reação com Bradford? Que aminoácidos 
ou grupos das proteínas são responsáveis por esta reação? 
O método de Bradfordé uma técnica para a determinaçãode proteínas 
totais que utiliza o corante de “Coomassie brilliantblue” BG-250. 
Este método é baseado na interação entre o corante BG-250e 
macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais 
básicas ou aromáticas. No pH de reação, ainteração entre a proteína de alto 
peso molecular e o coranteBG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do 
corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm. O método 
Bradford é vantajoso por ser simples e rápido, além de que, não permite que 
compostos fenólicos interfiram na medida das proteínas. 
 
 
5- Qual é a importância das reações de precipitação de proteínas 
por reagentes dos alcaloides e por sais de metais pesados? Quais os 
mecanismos das precipitações. 
Os cátions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ 
formam precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o 
elemento formador (ex: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo, etc.). 
Essa precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico 
(pI). Isso porque, acima do pI, a carga líquida sobre a proteína é negativa, 
favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal. Quando a 
proteína está abaixo do seu pI, a carga líquida total da molécula é positiva. Isso 
facilita a interação da molécula com os ânions provenientes de ácidos como o 
tunguístico, o fosfotunguístico e pícrico. Nas duas situações o precipitado pode 
ser ressolubilizado através de alterações do pH. Verifica-se que na adição de 
sais de metais pesados como de ácidos orgânicos fortes ocorreram 
precipitação. 
6- Explique os mecanismos que levam uma proteína a se dissolver 
quando há um pequeno aumento na força iônica da solução e mecanismos que 
levam uma proteína a precipitar quando há um aumento na força iônica da 
solução. 
Quando sais neutros são adicionados ao sistema ocorre um aumento da 
força iônica do sistema. Os íons carregados provenientes da dissociação dos 
sais passam a interagir com as moléculas proteicas, diminuindo a interação 
entre as próprias moléculas da proteína. Deste modo, temos um aumento na 
solubilidade da proteína em meio aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome de 
salting-in. 
Em condições de elevada força iônica, as moléculas de água 
apresentam maior tendência de solvatação de partículas (nesse caso, os íons). 
As moléculas de água, desse modo, interagem mais com os íons, desfazendo 
suas interações com a estrutura proteica. Como consequência, temos: maiores 
interações proteína-proteína, resultando na diminuição da solubilidade em meio 
aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome de salting-out. 
 
7- Que mudanças ocorrem com uma proteína quando em contato 
com o etanol? 
A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em 
água. Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de 
soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de 
interação do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica. A água 
apresenta constante dielétrica bastante elevada (aproximadamente 80). Numa 
solução contendo, exclusivamente, água e moléculas protéicas temos: 
interação água - proteína e interação proteína-proteína. Nesse caso, podemos 
afirmar com certeza que o primeiro tipo de interação prevalecerá sobre o 
segundo porque a água possui grande capacidade de separação das partículas 
do soluto (constante dielétrica elevada). 
Os solventes orgânicos apresentam valor de constante dielétrica bem 
inferior à da água, a interação proteína-proteína "vence" o poder de solvatação 
da água (interação água-proteína). A proteína precipita. A precipitação por 
solventes orgânicos depende muito da temperatura. Os solventes orgânicos, 
quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis na separação de 
misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem 
levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e 
estabelecimento de interações apolares, importantes na manutenção da 
conformação proteica. 
 
8- As solubilidades de duas proteínas em função da concentração de 
sulfato de amônio estão mostradas no diagrama abaixo. Como esta 
observação pode ser usada para separar as proteínas A e B? 
 
A adição de sais neutros, principalmente sulfato de amônio a elevadas 
concentrações reduz a disponibilidade da água devido à hidratação dos íons 
criando condições para a precipitação, a qual ocorre principalmente por 
interação das zonas hidrófobas. O sal e outros precipitantes não provocam a 
precipitação de todas as proteínas do meio, pois o seu efeito é o de reduzir a 
solubilidade. Com isso, a concentração de sal ou solvente que provoca a 
precipitação varia com a concentração da proteína e a presença de outras 
proteínas contaminantes.