aglutinação imunocromatografia

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Imunoensaios: Ensaios de Aglutinação
A importância da sorologia reside na possibilidade de pesquisar de Anticorpo (Ac) ou Antígeno (Ag) específicos por testes rigorosamente padronizados é de grande valia na definição da suspeita clínica, na identificação da fase da infecção (p. ex: IgM: processos agudos e IgG: processos crônicos - imunoglobulina de memória), no diagnóstico de doenças congênitas, na seleção de doadores/receptores de sangue e de órgãos, na avaliação do prognóstico da doença, na avaliação da eficácia terapêutica, na avaliação da imunidade adquirida ou induzida e na verificação do agravamento do processo patológico (presença de imunocomplexos depositados em nível de glomérulos, identificados pela imunoflorescência indireta anticomplemento, indicativa de piora da patologia). Apresenta, ainda, importância epidemiológica estabelecendo a prevalência da doença, verificando a erradicação ou a reintrodução de uma doença em uma área/população.
Testes sorológicos ou Imunoensaios são técnicas para a detecção e/ou quantificação de antígenos e anticorpos, ou outras substâncias que desempenhem o papel de antígeno no ensaio, tais como drogas, hormônios, DNA, RNA, citocinas.
- AGLUTINAÇÃO: É caracterizada pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contém determinantes antigênicos na superfície. Teste altamente sensível, utilizado no diagnóstico de vírus, bactérias, protozoários e fungos; doenças auto-imunes; detecção de hormônios e tipagem de grupos sanguíneos. De fácil execução (leitura visual) e baixo custo, apresenta boa especificidade e reprodutibilidade. Tem baixa sensibilidade e pouca estabilidade Ag-Ac.
A reação de aglutinação caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície. Está entre os imunoensaios mais consagrados e tradicionais. 
A aglutinação pode ocorrer tanto com partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície (hemácias, bactérias, protozoários, etc.) como com partículas inertes (partículas de látex, poliestireno, bentonita, etc.). No primeiro caso, a reação é dita aglutinação direta, e no segundo, aglutinação indireta ou passiva. 
As reações de aglutinação são muito empregadas para o diagnóstico laboratorial de doenças causadas por vírus, bactérias, protozoários e fungos, doenças autoimunes, na detecção de hormônios, na tipagem de grupos sanguíneos dos sistemas ABO e Rh, etc. 
Os testes de aglutinação podem ser realizados em tubos ou placas. Se o soro possuir um elevado título de anticorpos aglutinantes, pode-se observar o fenômeno de prozona, já explicado anteriormente, obtendo-se falsos resultados negativos. Esse efeito é eliminado empregando-se diluições seriadas do soro. 
Teste de Aglutinação Direta 
Na reação de aglutinação direta utilizam-se partículas antigênicas insolúveis em sua forma íntegra ou fragmentada. Hemácias, bactérias, fungos, protozoários podem ser aglutinados diretamente por anticorpo. Os testes para detectar anticorpos específicos são realizados empregando-se diluições em série do anticorpo, frente a uma quantidade constante de antígeno. Após um período de incubação, a aglutinação se completa e o resultado é geralmente expresso como a máxima diluição em que ocorre a aglutinação.
TESTE DE AGLUTINAÇÃO DIRETA: Ac + Ag = Complexo precipitado. Testes feitos em diluições crescentes, com antígenos na mesma concentração, onde os resultados são expresso em título anti-soro - a máxima diluição onde ocorre a reação. Ex.: Tipagem sanguínea, Toxoplasmose, Salmoneloses, Tripanossomíase.
INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA: Ac + Vírus = Ausência de Aglutinação (positivo para presença de Ac na amostra) Antígenos virais aglutinam hemácias. Anticorpos presentes na amostra inibem a aglutinação indicando presença de anticorpos. Ex.: Rubéola, Sarampo, Influenza.
TESTE DE AGLUTINAÇÃO INDIRETA: (Ag + Partícula Inerte) + Ac = Aglutinação Partículas inertes e hemácias podem ser sensibilizadas por adsorção passiva (contato direto com o antígeno solúvel), por adsorção via agente químico (ácido tânico e cloreto de cromo), por conjugação do Ag (ligações químicas covalentes).
Teste de Aglutinação Passiva ou indireta 
Para o teste de aglutinação passiva, as hemácias e as partículas inertes (látex, bentonita, “sepharose”, leveduras, etc.) podem ser sensibilizadas por adsorção passiva, devida ao contato direto com os antígenos solúveis, por adsorção via agentes químicos, como ácido tânico, cloreto de cromo e por conjugação do antígeno, por meio de ligações químicas covalentes, fornecendo reagentes estáveis. Devido à grande diversidade de antígenos que podem se ligar às células ou partículas, a aplicação dos testes de aglutinação passiva é muito variada.
Teste de Hemaglutinação Passiva 
Hemácias estão entre os melhores suportes de antígenos para os testes de aglutinação, pois há uma série de antígenos que pode ser ligada à sua superfície para fornecer um sistema indicador sensível na detecção de anticorpos. Além disso, os testes em placa permitem que a determinação do ponto final da reação seja feita diretamente.
Hemácias possuem uma superfície complexa, o que facilita a ligação de muitos antígenos e, frequentemente, acarreta a presença de anticorpos heterófilos indesejados no soro de muitos animais. Tais anticorpos devem ser removidos antes da execução do teste. Antígenos polissacarídeos prontamente aderem a hemácias, enquanto antígenos protéicos requerem pré-tratamento com ácido tânico ou cloreto de cromo.
O teste em placa utiliza pequenas quantidades de reagentes e é considerado positivo quando se verifica a formação de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em “V”, e negativo quando as hemácias sedimentam formando um “botão” compacto. O título da amostra testada será a máxima diluição em que ainda se observa a formação do tapete.
O teste detecta anticorpos das classes IgG e IgM e, embora os anticorpos IgM sejam 750 vezes mais eficientes na aglutinação que os IgG, a quantidade de antígeno necessária para se obter a máxima reatividade com IgM é muito maior do que a necessária para a máxima reatividade com IgG.
HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA: Proteínas podem ser adsorvidas a hemácias tratadas com ácido tânico e podem ser aglutinadas por Ac específicos. Geralmente é utilizado hemácias de carneiro ou humanas do grupo O. O teste considerado positivo: verifica formação de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em “V” (título será a máxima diluição em que se observa a formação de tapete). Enquanto que o teste será considerado negativo quando hemácias sedimentam formando “botão” compacto. Ex.: Pesquisa de Ac para Trypanosoma cruzi, Treponema pallidum (sífilis), Toxoplasma gondii.
Teste de Inibição de Hemaglutinação Direta 
A inibição da hemaglutinação direta é baseada na capacidade que certos antígenos virais têm de, espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemácias. Os anticorpos, se presentes na amostra, revestem as partículas virais, resultando na inibição da aglutinação, indicando um teste positivo para a presença de anticorpos. Estes testes não distinguem entre IgG e IgM. Este método é usado para detectar anticorpos contra o vírus da rubéola, sarampo, influenza e certos enterovírus.
O teste de aglutinação pode ser modificado para ser usado na medição de antígenos solúveis. Este teste é chamado inibição de hemaglutinação. É chamado inibição de hemaglutinação porque é medida a habilidade de um antígeno solúvel de inibir a aglutinação por anticorpos de células vermelhas sanguíneas cobertas por antígenos. Neste teste, uma quantidade fixa de anticorpos dirigidos ao antígeno em questão é misturada com uma quantidade fixa de células vermelhas sanguíneas cobertas com o antígeno (veja hemaglutinação passiva acima). 
Também estão incluídas na mistura diferentes quantidades da amostra a ser analisada para a presença do antígeno.Se a amostra contém o antígeno, o antígeno solúvel irá competir com o antígeno que cobre as células vermelhas sanguíneas pela ligação com os anticorpos, inibindo dessa forma a aglutinação das células vermelhas sanguíneas.
hCG Látex - Teste de Gravidez (Inibição da Aglutinação)
O hormônio placentário, Gonadotrofina Coriônica Humana (hCG) aparece na urina de mulheres grávidas e geralmente indica um teste positivo de gravidez. O teste é realizado em urina de mulheres, após ausência da menstruação, para detecção de Gonadotrofina Coriônica Humana. O teste irá detectar o hormônio por inibição da aglutinação hCG LÁTEX EBRAM. hCG LÁTEX EBRAM pode detectar a gravidez positiva após 3 dias de atraso da menstruação. Porém, resultados negativos podem ser observados em testes de gravidez realizado precocemente, devido ao baixo nível de hCG. Nestes casos, os testes poderão ser repetidos depois de uma semana. Os componentes do teste consistem de um antígeno na forma de suspensão de hCG aderidos na superfície das partículas de látex e um reagente contendo anticorpos anti-hCG, subunidade Beta. O hCG aderido às partículas de látex irá reagir com anticorpos e causar aglutinação do mesmo. Quando o anticorpo é misturado com hCG da urina de mulheres grávidas, o anticorpo é bloqueado e não irá aglutinar o látex. Não havendo hCG na urina, o anticorpo não será bloqueado e o látex irá aglutinar. Assim, a aglutinação do látex indica um teste de gravidez negativo.
Teste de Aglutinação do Látex 
Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser utilizadas como suportes na adsorção de proteína solúvel e antígenos polissacarídicos, funcionando como sistema indicador da reação antígeno-anticorpo.
O teste pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos. A aplicação mais comum é na detecção do fator reumatoide, que é anticorpo da classe IgM pentamérico dirigido contra IgG. Adsorvendo IgG passivamente às partículas do látex, haverá a exposição dos determinantes de IgG que reagem com o fator reumatoide, resultando em aglutinação. Fator reumatoide (FR) é um anticorpo contra a porção Fc da IgG. O fator reumatoide e a IgG se unem para formar complexos imunes que contribuem para causar doenças reumatológicas. Essa técnica também é empregada na pesquisa da proteína C que aparece no soro de pacientes na fase aguda de várias infecções, como estafilocócica ou estreptocócica, febre reumática, etc.
- AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX: Partículas de látex são esferas de poliestireno utilizadas como suporte na adsorção. 
Empregado na pesquisa de Ag ou Ac, sendo a aplicação mais comum é na detecção de fator reumatoide.
- FATOR REUMATÓIDE: Detecção de anticorpo IgM (pentamérico) dirigido contra a Fc do anticorpo IgG (mas também pode ser IgA, IgM e IgE). IgG adsorvida ao látex, haverá exposição dos determinantes que reagem contra o FR, resultando em aglutinação. Se não houver aglutinação, resultado negativo.
O fator reumatoide é um exame de diagnóstico que avalia a quantidade de proteínas, presentes em uma amostra de sangue, que podem atacar tecidos saudáveis como a cartilagem das articulações, por exemplo.
Assim, níveis elevados de fator reumatoide normalmente indicam a presença de uma doença autoimune, como artrite reumatoide, lúpus ou síndrome de Sjogren, embora algumas pessoas saudáveis também possam ter um aumento neste tipo de proteínas
O exame de fator reumatoide é positivo quando seus valores estão acima de 1:80, que sugere artrite reumatoide, ou entre 1:20 e 1:80, que pode significar a presença de outras doenças, como:
 Lúpus eritematoso;
 Síndrome de Sjogren;
 Vasculite;
 Escleroderma;
 Tuberculose;
 Mononucleose;
 Sífilis;
 Malária;
 Problemas no fígado;
 Infecção no coração;
 Leucemia.
No entanto, como o fator reumatoide também pode estar alterado em pessoas saudáveis, o médico pode pedir outros exames para confirmar a presença de alguma das doenças que aumentam o fator. Devido o resultado deste exame ser bastante complexo de interpretar, seu resultado deve ser sempre avaliado por um reumatologista.
Artrite Reumatoide (AR):
A artrite reumatoide (AR) é uma doença sistêmica crônica. Por ser sistêmica, significa que ela pode afetar diversas partes do organismo (embora atinja principalmente as articulações); por ser crônica, não se consegue obter a sua cura (e sim o seu controle). A causa ainda é desconhecida, mas sabe-se que é autoimune, ou seja, os tecidos são atacados pelo próprio sistema imunológico do corpo.
A doença afeta entre 0,5% e 1% da população mundial adulta e cerca de três vezes mais mulheres do que homens. Um estudo de 2004 mostrou que a incidência da AR no Brasil é de 0,46%. Além disso, pessoas com histórico familiar de artrite reumatoide têm mais risco de desenvolvê-la, devido a uma maior predisposição genética.
Os principais sintomas da Artrite Reumatoide (AR):
– Dor, inchaço, rigidez e inflamação nas membranas sinoviais e nas estruturas articulares. Com a progressão da doença – e se esta não for tratada adequadamente –, os pacientes podem desenvolver incapacidade para a realização de suas atividades cotidianas.
O que é Artrite Reumatoide?
Na artrite reumatoide, o sistema imunológico, responsável por proteger o nosso organismo de vírus e bactérias, também ataca os tecidos do próprio corpo –especificamente a membrana sinovial, uma película fina que reveste as articulações.
O resultado desse ataque é a inflamação das articulações e consequente dor, inchaço e vermelhidão, principalmente nas mãos e nos pés. É importante lembrar que, por ser sistêmica, ela pode ocorrer em outras articulações, tais como joelhos, tornozelos, ombros e cotovelos, além de outras partes do organismo (pulmão, olhos, coluna cervical). Em outras palavras, embora a principal característica da artrite reumatoide seja a inflamação das articulações, várias regiões do corpo também podem ser comprometidas.
Se não for tratada adequadamente, a inflamação persistente das articulações pode levar ao comprometimento das juntas, provocando deformidades e limitações nas atividades do dia a dia.
Apesar dos avanços nas pesquisas, a causa da artrite reumatoide ainda é desconhecida. Porém, a maioria dos cientistas concorda que a combinação de fatores genéticos e ambientais é a principal responsável.
Foram identificados marcadores genéticos que provocam uma probabilidade dez vezes maior de manifestar a doença. Entretanto, há quem possua esses genes e não desenvolva a AR, assim como nem todas as pessoas com a doença têm esses genes.
Pesquisas sugerem que agentes infecciosos, como vírus ou bactérias, podem provocar a doença em quem tem propensão genética para desenvolvê-la. Além da resposta do organismo a eventos estressantes, como trauma físico ou emocional, outra possibilidade são os hormônios femininos, uma vez que a incidência é maior nas mulheres.
Fumar também pode ser um causador, pois há um alto risco de pessoas com um gene específico desenvolverem artrite reumatoide, além de ser um vício que pode aumentar a gravidade da doença e reduzir a eficácia do tratamento.
- VDRL: Emprega cristais de colesterol que são sensibilizados com lecitina e cardiolipina, para pesquisa de anticorpos na sífilis. Detecta Ac antilipídios que formam no hospedeiro como resposta ao material de natureza lipídica, liberado pelas células lesadas no início da infecção e ao material lipídico do próprio treponema. Leitura, após agitação, será positiva se ocorrer a formação de flóculos.
O teste imunocromatográfico ou imunocromatografia é um teste bem simples, a única coisa difícil mesmo é o nome. 
Os testes dispensam o uso de reagente adicional ou equipamentos. São testes de triagem, portanto de elevada sensibilidade, e consequentemente elevado custo. Alguns deles, como a determinação da glicemia (glicosímetros), usam métodos enzimáticos químicos, e outros são imunológicos como para o teste de gravidez.
O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de nitrocelulose ou de náilon coberta poracetato transparente para facilitar a visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA).
Para detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura e como conjugado um segundo anticorpo conjugado ao corante. Um dos métodos imunológicos desses testes emprega corante insolúvel, como ouro coloidal (róseo) ou prata coloidal (azul marinho) como revelador da interação antígeno-anticorpo.
A amostra aplicada se liga ao conjugado colorido e após a migração por cromatografia a formação do imunocomplexo é revelada pelo depósito do corante coloidal na linha de captura.
Para assegurar a qualidade dos reagentes e a realização adequada do procedimento, esses testes rápidos utilizam controles internos, como nos testes imunoenzimáticos.
POSITIVO: Duas linhas são visíveis, sendo uma linha na região controle (C) e outra na região teste (T). A intensidade de cor da linha teste (T) poderá variar de acordo com a concentração presente na amostra. Todavia, qualquer intensidade de cor na linha teste indica resultado positivo.
NEGATIVO: Apenas uma linha é visível na região controle (C), não sendo observada linha na região teste.
INVÁLIDO: Não é evidenciada a linha controle (C). As razões mais comuns de falha são o volume insuficiente de amostra ou falha no procedimento técnico. Neste caso, reler a técnica e repetir o teste com uma nova tira.
Diagnóstico por imunocromatografia
Com objetivo de atingir independência tecnológica na área de diagnóstico laboratorial, melhorando o desenvolvimento e a disponibilidade de kits dignósticos para doenças consideradas prioritárias pelo Ministério da Saúde, um grupo de pesquisadores decidiu apostar no desenvolvimento de produtos para o diagnóstico in vitro rápido baseado na tecnologia da imunocromatografia (Lateral Flow Test). A idéia é acelerar o processo de descoberta de doenças como: dengue, malária, rubéola e tuberculose, além da adaptação de produtos para o diagnóstico in vitro rápido de leishmaniose tegumentar e visceral e leptospirose.
O coordenador da pesquisa do ICB-UFMG (Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais), Alfredo Góes, explica que os testes diagnósticos rápidos são particularmente úteis na triagem inicial de uma determinada infecção ou doença em populações específicas como, por exemplo, em programas preventivos de transmissão vertical de infecções em gestantes (doença de chagas, hepatite B ou HIV), candidatos a doação de sangue ou inquéritos populacionais. Portanto, a OMS (Organização Mundial de Saúde) reconhece o desenvolvimento de diagnósticos rápidos, práticos, sensíveis, específicos e de baixo custo como estratégia essencial no processo de otimização dos sistemas de saúde pública e no controle de epidemias.
Nesse contexto, a imunocromatografia significa uma alternativa aos métodos tradicionais, pois trata-se de uma tecnologia inovadora que concentra a reação antígeno-anticorpo em uma única fase sólida, sendo esta mantida e utilizada a temperatura ambiente pelo agente de saúde. Além de possuir sensibilidade e especificidade elevadas, a imunocromatografia possui baixo custo, pois não exige equipamento ou treinamento específico para realizar o teste ou interpretar o resultado. Isto significa que tal tecnologia possibilita o diagnóstico de pacientes pelos próprios agentes de saúde, dispensando a coleta e o envio de material biológico para centros de saúde especializados ou para laboratórios de análises clínicas. "Além disso, ao contrário de outros métodos de diagnóstico, que geralmente levam horas, a imunocromatografia gera um resultado em aproximadamente 10 minutos, possibilitando uma intervenção clínica imediata", acrescenta.
Segundo o pesquisador, os benefícios com a utilização de novo método seriam percebidos, primeiramente, na regiões mais carentes do País, em que é quase impossível manter centros de saúde especializados ou laboratórios de análises clínicas. "A região amazônica, onde a infeção por malária é muito comum, além de outras regiões do país carentes de infra-estrutura sentiriam com mais rapidez e eficácia os benefícios da nova metodologia", diz.
Hoje, o custo para obtenção dos kits de diagnóstico in vitro é muito alto, já que a tecnologia adotada no País é fruto de importação. Assim, desenvolver um concorrente nacional que implique no fim do pagamento de royalties e gere divisas para o Brasil é uma medida estratégica para nossa economia. "Os produtos da BTI seriam os primeiros baseados em imunocromatografia a serem desenvolvidos e produzidos no Brasil, e os primeiros da América Latina. Não há dúvida de que o desenvolvimento de tecnologia genuinamente nacional patenteada em uma área estratégica traria inúmeros benefícios", acredita. Entre eles, o pesquisador cita o menor impacto causado pela flutuação do câmbio de moedas estrangeiras, o que reduziria as interferências sobre os custos diretos de produção; independência das aduanas, cujas paralizações constantes ocasionam o desabastecimento do mercado nacional, elevando custos de produção e impactando o preço final do produto; redução dos custos de produção, tornando os produtos extremamente competitivos no mercado nacional e internacional.
Além do pesquisador Alfredo Miranda de Góes, participarão do consórcio a professora titular do Departamento de Imunologia, Microbiologia e Parasitologia, do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG, Mariane Martins de Araújo Stefani, a professora titular do Departamento de Saúde Coletiva da UFG Celina Maria Turchi Martelli. O projeto também contará com a participação da pesquisadora do Instituto Real dos Trópicos de Amsterdam (KIT BR), Samira Bührer-Sékula, que possui um extenso conhecimento no desenvolvimento e implementação de imunodiagnósticos rápidos e simples (point of care tests) para doenças infecciosas tropicais.