Relatório 2 de Micro A técnica de Gram ou coloração de Gram

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MICROBIOLOGIA
2º RELATÓRIO
FUNDAÇÃO CECIERJ – CONSÓRCIO CEDERJ
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO RIO DE JANEIRO – UERJ
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MARÇO 09/03/2018
INTRODUÇÃO
A técnica de Gram ou coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido em 1885, pelo patologista dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. Mesmo criada no século XIV, esta técnica é utilizada até hoje, um pouco mais aperfeiçoada, com o objetivo de diferenciar bactérias. Consiste em aplicar diferentes corantes, e a partir da coloração observada nos micróbios, no microscópio óptico, após a execução do método, classificar as bactérias em Gram positivas, com a parede celular rica em Mureína, (as que ficam com coloração violeta) ou Gram negativas (de coloração vermelha).
Esta atividade prática foi dividida em duas partes, onde a primeira parte limitou-se a demonstrar os mecanismos físico-químicos envolvidos na coloração de Gram, e a segunda, visando a aplicação da técnica para a visualização e diferenciação de bactérias ao microscópio óptico.
OBJETIVOS
Explicar por que bactérias com componentes estruturais diferentes podem ser diferenciadas quando coradas pelo método de Gram.
Descrever a seqüência dos procedimentos da coloração de Gram e os princípios físico-químicos que regem cada um desses procedimentos.
Apresentar provas da existência de micróbios intimamente associados aos tecidos de nosso corpo.
PARTE 1 - DEMONSTRAÇÃO DOS MECANISMOS FÍSICO-QUÍMICOS ENVOLVIDOS NO MÉTODO DE GRAM 
PARTE 2 – ESFREGAÇO – APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE GRAM PARA A VISUALIZAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS AO MICROSCÓPIO ÓPTICO.
MATERIAIS
Cotonetes;
Lâminas de vidro para microscopia;
1 tubo de ensaio;
Caneta para escrever em vidro;
Solução de cristal violeta constituída por 1g de cristal violeta, 10mL de álcool a 95º GL, 2g de fenol e 100mL de água destilada;
Solução de iodo, conhecida como solução de Lugol, constituída por 1g de iodo metálico, 2g de iodeto de potássio e 300mL de água destilada;
Alcool a 95º GL;
Solução de fucsina constituída por 30mg de fucsina básica, 10mL de álcool a 95º GL, 500mg de fenol e 90mL de água destilada;
Pia com torneira; 
Becker para recolher os resíduos de corante;
Frasco com água;
Lamparina a álcool;
Papel-higiênico;
Microscópio óptico com lente objetiva com capacidade de aumento de 100 vezes; 
Óleo para imersão.
PROCEDIMENTOS
1ª Parte - Esfregaço
1. Desengordurar, com álcool, a lâmina de vidro que será usada;
2. Coleta de material:
2.1. Coletar o material do sulco gengival, com a ponta de algodão de uma haste flexível;
2.2. Marcar a lâmina com o nome para identificar o lado que estará o esfregaço;
2.3. Fazer esfregaço, rolando o algodão em um local da lâmina, com o material coletado, no lado contrário ao marcado na lâmina de vidro previamente desengordurada;
3. Fixação de material:
3.1. Passar a lâmina, rapidamente, do lado contrário de onde está o esfregaço, na chama da lamparina a álcool, até que ela fique levemente aquecida, e tendo cuidado para não torrar os micróbios.
4. Coloração primária:
4.1. Coloque a lâmina, com o esfregaço voltado para cima, nivelada sobre o Becker para recolher o líquido despejado durante o processo;
4.2. Cobrir o esfregaço com cristal violeta (CV) (hidrofílico -> protoplasma) durante 1 minuto;
4.3. Lavar com água;
4.4. Cobrir o esfregaço com Lugol (hidrofílico -> protoplasma), durante 1 minuto. 
Cristal Violeta + Lugol -> Iodopararosanilina ou IPRA (hidrofóbico -> membranas lipídicas);
4.5. Lavar com água;
4.6. Lavar com álcool por 05 segundos; IPRA tem mais afinidade pelo álcool que pelos lipídios das membranas (coeficiente de partição maior no álcool que na gordura). Como as G- têm a parede pouco espessa e também uma membrana externa, o álcool tem acesso às membranas e o IPRA passa para o álcool , sendo retirado da célula, que fica descorada. Nas G+, cuja parede é espessa, o tempo de contato com o álcool não é suficiente para atravessar essa parede e o IPRA permanece na membrana mantendo a coloração roxa; 
4.7. Lave a lâmina com água.
5. Coloração secundária:
5.1. Gotejar fucsina básica sobre a lâmina nivelada e deixar reagir durante 30 segundos. Após esse tempo, escorra a solução para o Becker;
5.2. Lavar o esfregaço com água destilada e deixar secar ao ar. 
5.3. Colocar uma gota de óleo de imersão.
6. Observação dos resultados no microscópio:
6.1. Observar a amostra no microscópio com a objetiva de 40x, para melhor visualização para comparação entre os tamanhos das células da gengiva com as bactérias;
6.2. Observar a amostra no microscópio com a objetiva de 100x, sendo que deve ser colocado o óleo de imersão na troca da objetiva anterior por essa;
OBS: A água entra em todas as etapas.
2ª Parte - Demonstração dos mecanismos da coloração de Gram
1. Preparação dos tubos:
1.1. Colocar água até formar uma coluna de três centímetros no tubo de ensaio;
1.2. Adicionar óleo até formar uma camada de um centímetro sobre a camada de água;
1.3. Coloque duas gotas da solução de cristal violeta e observe até o corante atingir a fase aquosa;
1.4. Vede o tubo para impedir a saída dos líquidos, agite fortemente, segurando a tampa, e espere o processo de separação dos componentes água e óleo;
1.5. Anote em qual das fases ficou o corante;
1.6. Adicione duas gotas de lugol, feche o tubo e observe essas gotas de 
iodo até atingirem a fase aquosa;
1.7. Agite fortemente o tubo e espere o processo de separação dos componentes água e óleo;
1.8. Anote em qual das fases o complexo iodo-para-rosanilina ficou dissolvido;
RESULTADOS
Na primeira parte dos procedimentos, podemos observar no microscópio na objetiva de 100x, células da gengiva e bactérias coradas nos tons de violeta, sendo que pouquíssimas bactérias estavam coradas nos tons de rosa. 
Na segunda parte dos procedimentos observamos que na mistura de água, óleo e o cristal violeta, a parte da água ficou corada conforme a parte oleosa ia sendo gradualmente descorada. Quando foi colocado lugol, observou-se que a parte oleosa ficou corada à medida que a parte da água ia descorando.
DISCUSSÃO
Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário (cristal violeta) e o fixador (lugol), adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. A tonalidade de rosa ou violeta adquirida pelas bactérias na 1ª parte do procedimento se deve ao fato de que as Gram + possuem uma parede celular espessa formada por peptídeoglicano, que retém o cristal violeta-iodo no citoplasma e impede a descoloração feita com o álcool, dessa forma elas continuam coradas nos tons de violeta mesmo após a secunda coloração. Já as gram - não têm a parede celular tão espessa, e acabam sendo descoloridas quando são lavadas com álcool, mas após a etapa de descoloração são coradas novamente com a fucsina básina, e acabam fixando o tom rosado. 
Na segunda parte dos procedimentos, podemos observar o caráter hidrofílico do cristal violeta, quando este foi colocado em um tubo contendo água e óleo, deixando corada apenas a fase que continha água. Quando foi acrescentado o lugol, observamos um comportamento hidrofóbico no tubo, sendo corada apenas a fase que continha óleo. Esse último resultado se deve ao fato de que quando o lugol é misturado com o cristal violeta, resulta na formação de iodo-para-rosalina, que tem caráter o hidrofóbico. 
	Os resultados foram de acordo com o esperado, exceto a coloração das células da gengiva, que tiveram a fixação da cor violeta, enquanto que deveriam ter fixado o tom rosado devido à estrutura de sua membrana.
CONCLUSÃO
	Por meio desta aula prática, foi possível notar que o método de coloração de Gram diferencia células que apresentam parede mais ou menos rica em peptídeoglicano, sendo ela coberta ou não por uma membrana externa. As que possuem paredemais rica nesse composto são coradas de violeta e classificadas como bactérias Gram positivas, e as que não têm parede rica nesse composto são coradas de rosa e classificadas como bactérias Gram negativas. O procedimento desse método pode ser resumido em coloração com cristal violeta por um minuto, fixação com lugol por um minuto, lavagem rápida com álcool, lavagem com água, coloração com fucsina básica e, novamente, lavagem com água.
	O fato de ter sido encontrado células da gengiva no esfregaço, comprova a existência de micróbios intimamente associados aos tecidos do nosso corpo.
	
REFERÊNCIAS
- Liberto, Maria Isabel Madeira, et al. - Livro de Microbiologia. Fundação Cecierj/Consórcio Cederj, 2013. Volume 1, Módulo 1. 2ª Edição.
- Material de apoio para aula prática 2 
- http://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-de-gram/
- http://www.uff.br/bacteriologia/aulaspraticas/coloracaodegram.htm
- http://www.uff.br/bacteriologia/aulaspraticas/coloracaodegram.htm