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1 2 Exame Andrológico do Cão (23/09/2015) • Avaliação dos testículos logo nas primeiras vacinas para avaliar se é criorquídio. • Avaliação do pénis para ver se tem fimose (corrigido cirurgicamente) na primovacinação ou para ver se há persistência do frénulo prepucial (glande fica ligada ao prepúcio impossibilitando a exteriorização do pénis). • Sempre que se faz exame físico deve-se avaliar o pénis e o prepúcio e sempre que há corrimento ver se tem origem no pénis ou no prepúcio. • Outra coisa a avaliar quando se exterioriza o pénis e ver se a uretra abre na parte ventral da glande. • Hipospadia – abertura da uretra no sítio errado. • Exteriorizar o pénis até aos bulbos → Sarcoma de Sticker inicia-se a nível dos bulbos. • Testículo – dimensão, consistência, aderências, orientação, simetria, temperatura, dor à palpação. • Epidídimo – posição, tamanho em relação aos testículos (corpo geralmente não se palpa a não ser em casos de epididimite). Cauda do epidídimo mais afastada. • Próstata – avaliação da próstata a partir dos 5 anos de idade: tamanho (há medida que aumenta de tamanho vai “caindo” para a cavidade abdominal), posição, consistência, regularidade da superfície, dor e simetria dos lobos. • Cordão espermático – plexo pampiniforme e ducto deferente (mais caudal que plexo pampiniforme). • Túnicas que rodeiam os testículos de fora para dentro: → Escroto; → Dardos, → Vaginal folheto parietal → Vaginal folheto visceral → Albugínea – divide estroma testicular em septos e advém do peritoneu. • Cremaster → é músculo esquelético • Túnica de dartos e cremaster → contracção para regular a temperatura. • Colheita de fluido prostático: → Colheita sémen (3ª fracção) → PAAF ecoguiada → Biópsia ecoguiada → Algaliação + instila soro fisiológico e recolher + puxar algália para ficar caudalmente à próstata + massajar + voltar a instilar soro fisiológico. problema: massagem pode não ser eficaz e não se consegue fazer bem a todos os animais (mais difícil em cães muito grandes porque a distância do ânus ao bordo do púbis é muito grande e não chegamos lá com o dedo na massagem através do recto. • Gatos raramente têm problemas prostáticos (professora nunca viu). • No escroto observar se há aderências, ver espessura e coloração. • Para exteriorizar o pénis → mão a segurar após bulbos • No toque rectal a outra mão empurra a próstata para cima para ser mais fácil. • Ecografia: → Idealmente fazer tricotomia; → O óleo utilizado na eco pode levar a dermatite escrotal → usar álcool que é suficiente para obter uma boa imagem. 3 → Parte mais hipoecogénica da próstata corresponde à parte glandular e mais hiperecogénica corresponde à cápsula. → Linha mais hiperecogénica à periferia corresponde ao escroto, túnica dartos e folheto parietal da túnica vaginal. → Linha central hiperecogénica = mediastino → Cauda do epidídimo mais hipoecogénica que estroma testicular porque também tem fluido. → Cabeça do epidídimo tem ecogenicidade igual ao estroma testicular. → Doppler para ver plexo pampiniforme. → Frequência = 5 – 7,5 MHz → Quando se vê tumores testiculares na eco → ver se há mestastases nos linfonodos inguinais. 4 Exame Andrológico do Garanhão (30/09/2015) O exame andrológico é constituído por duas partes: ✓ Exame Físico ✓ Exame do Ejaculado Em teoria faz-se primeiro o exame físico e depois o exame do ejaculado, mas na prática faz-se primeiro o exame do ejaculado, porque no exame físico temos que exteriorizar o pénis. Existem 3 formas de exteriorizar o pénis: ✓ Esperar que o cavalo urine (não é prático) ✓ Colocar uma égua em cio ao pé do cavalo; ✓ Dar sedativos – Acepromazina, Demetomidina, Xilazina → induzem a exteriorização do pénis. O efeito extende-se durante 2 a 3 h e por isso se faz primeiro recolha do ejaculado. Antes de dar os sedativos verificar se o cavalo tem os testículos escrotais. Se não tiver testículos escrotais não faz sentido fazer exame andrológico, porque será azoospérmico. Na aula foi dado Demetomidina associada a Butorfanol. No caso da Acepromazina, pode causar paralisia do músculo retractor do pénis e pode ter que se intervir cirurgicamente se o pénis não recolher no tempo devido (2 a 3h após a administração do sedativo). O exame andrológico deve ser feito sempre que se compra um reprodutor e no início e no fim da época reprodutiva. Os proprietários são quem tem a responsabilidade de que o exame andrológico seja feito. Actualmente para os cavalos estarem escritos no livro dos reprodutores, têm que ter feito exame andrológico. Realização do exame: 1º - Exame do Estado Geral para evitar, por exemplo, deixar escapar afecções do foro visual ou olfactivo que não permitam a comunicação sexual ou lesões a nível músculo-esquelético que não permitam a monta. 2ª Exame físico ao Sistema Reprodutor: ✓ “Avisar o animal de que vamos fazer o exame ao aparelho reprodutor”: ▪ Percorrer com a mão o corpo do animal até chegar à prega da babilha e bragada – quando os animais estão reactivos a prega da babilha contrai e quando não há contracções já sabemos que o animal está calmo e podemos abordar o aparelho reprodutor. ✓ Avaliar o pénis – avaliação essencialmente visual: ▪ Lesões? Podem existir, por exemplo, lesões traumáticas, nódulos... Avaliar corpo do pénis para verificar mucosas – Esmegma é fisiológico! É o resultado das glândulas prepuciais e tem funções antimicrobianas e sexuais. ▪ Avaliar a presença de microrganismos potencialmente patogénicos que podem ser disseminados durante a cópula – a glande tem uretra e fossa uretral onde se podem acumular microrganismos patogénicos. Devemos fazer zaragatoa da fossa da uretra, meter no meio para análise (não precisa ser para anaeróbios) e fazer isolamento microbiológico. Também se deve fazer zaragatoa no ejaculado. Quando se manda para análise não esquecer de pedir para isolar Taylorella equigenitalis que normalmente não é feita em isolamentos microbiológicos normais: 5 → Provoca metrite contagiosa equina; → Machos assintomáticos e fêmeas inférteis; → Necessita de meio enriquecido; → É muito difícil de conseguir remover o microrganismo da exploração uma vez que ele esteja presente, por isso é muito importante fazer esta avaliação; → Existem países endémicos. Neste momento Portugal não é endémico; → Se não pedirmos o isolamento deste microrganismo, paga-se depois à parte. ✓ Testículos: ▪ Intra-escroto – palpação de testículo, epidídimo (cabeça do epidídimo para a cabeça do cavalo, corpo corre dorsolateral e cauda para a cada do cavalo) e cordão espermático. o Primeiro devemos avaliar se há aderências. As aderências afectam o mecanismo de termorregulação (o mecanismo de termorregulação funciona através do plexo pampiniforme através de um mecanismo contracorrente e pelo músculo cremáster e túnica de dartos, através da elevação do testículo). o Avaliar parênquima testicular através dos seguintes parâmetros: → Consistência – deve ser fibroelástica. Se houver alterações de consistência ver se é em todo o testículo ou se é só em algumas zonas; → Orientação: vê-se pelo epidídimo – a cabeça do epidídimo tem que estar para a cabeça do cavalo e é mais aderente ao parênquima testicular, o corpo do epidímimo corre dorsolateral e normalmente não é palpável e a cauda do epidídimo, queestá mais na linha média e não tanto dorsal e faz uma protuberância maior, parecendo um triangulozinho na parte de trás do testículo. Ver se a orientação está correcta – se a cauda estiver para a frente significa que houve torção; O plexo pampiniforme é maior que o ducto deferente. → Dimensões testiculares. o São avaliadas 2 dimensões testiculares: → Diâmetro intertesticular – alinhar os testículos e medir. → Comprimento testicular – avaliado desde o polo anterior ao polo posterior com um medidor. As dimensões normais são 8 a 14 cm para um cavalo lusitano. → O Comprimento testicular é o parâmetro directamente proporcional ao nº total de espermatozoides. Não pode ser concentração directamente proporcional às dimensões do testículo, porque a concentração também é dada pelo volume do ejaculado. Ter cuidado para não medir também a cauda do epidídimo! Comparar os comprimentos dos dois testículos. Exames complementares de diagnóstico: - Palpação rectal – palpar glândulas anexas; - Ecografia. Porque não se faz biopsia em tumores testiculares? Com a biopsia vamos quebrar a barreira hematotesticular e potenciar uma reacção imunológica contra os espermatozoides. 6 Recolha do ejaculado com vagina artificial: Notas: - A vagina artificial simula as condições anatómicas normais da vagina da égua para a colheita de sémen do garanhão. - Utiliza-se manequim natural (fêmea em cio) ou manequim artificial. Ambos têm vantagens e desvantagens. Para utilizar o manequim artificial o cavalo tem que estar treinado, porque senão não salta para o manequim artificial. - Manifestação de cio da fêmea: desvia a cauda mostrando a zona perineal, contracções rítmicas da vulva exibindo o clitóris, urinam frequentemente na presença do garalhão, afasta os membros posteriores. - Manifestação de cio no cavalo: pode ter um comportamento mais violento ou não. Cheiram a égua, fleiman, mordisca a égua (se ela reagir dando um coice não está receptiva). - A deposição do sémen do cavalo é intra-uterina. A glande acopla na zona do cérvix da égua. - O operador tem que estar o máximo afastado possível e só quando é que for para a recolha é que se aproxima. Quando estão em cópula o garanhão faz movimentos com a cauda. Procedimento: 1) Colocar manga de plástico no corpo da vagina (corpo mole da vagina artificial. Na aula usámos uma manga de plástico universal que cortámos à medida da vagina artificial). 2) Com a manga de plástico bem alinhada às extremidades do corpo da vagina, rebater a extremidade proximal da manga de plástico sobre o bordo proximal do corpo da vagina e fixar com elásticos ou fios à volta. A extremidade distal da manga de plástico fica livre para receber o copo de recolha, que é um copo de plástico. Os copos de recolha devem ser mantidos na estufa a 37oC até serem utilizados. 3) Introduzir um termómetro no interior do corpo da vagina de forma a confirmar a temperatura. A temperatura ideal não é a temperatura corporal da égua. Se a temperatura não estiver perfeita o cavalo não ejacula. A temperatura da água deve estar entre os 45 e 50 oC. Mas depende de cavalo para cavalo! Há cavalos que gostam de temperaturas mais altas e outras mais baixas! 7 4) Introduzir a água aquecida (45 oC- 50 oC) e depois o ar através de uma válvula existente no corpo da vagina. Atenção! A zona do copo de recolha não pode tocar em água, cuidado! Nota: São 3 válvulas inseridas umas nas outras. A válvula da água é a do meio. 5) Colocar as protecções da vagina artificial (primeiro coloca-se o que tem velcro porque a protecção menos rígida liga-se depois ao velcro. O velcro é aquela parte branca que vemos na terceira imagem. Na terceira imagem observa-se a ligação das duas protecções pelo velcro). 6) Colocar o copo de recolha na extremidade distal da manga de plástico, mas só quando tiver as protecções! Antes disso, os colos devem estar na estufa. Colocar primeiro a rosca e depois enroscamos o copo de recolha. 7) Depois de verificada a temperatura da vagina artificial, o interior deve ser lubrificado com lubrificante não espermicida. Esse gel lubrificante é colocado com uma manga de palpação rectal. Não se lubrifica toda a vagina artificial! É apenas o primeiro terço! O gel não pode chegar ao copo de recolha! 8) Deixo a manga de palpação rectal dentro da vagina artificial de forma a proteger o seu interior de contaminações externas. Notas: - O que está entre a vulva e a vagina? É o vestíbulo e também nas éguas virgens o anel himenal. 8 Exame ginecológico da cadela (07/10/2015) Que partes no exame ginecológico da cadela devem ser avaliadas? ▪ Vulva – avaliar a consistência, cor da mucosa vulvar, tamanho (ver se está edemaciada e túrgida), ver se há corrimento. Em que fases do ciclo a vulva está edemaciada? Pró-estro e estro. A diferença é que no estro está mole ao toque porque não está túrgida. Corrimento sanguinolento em pró-estro e estro. Que outros tipos de corrimento pode haver? - Em Anestro não há corrimento. Corrimento mucoso sem significado em Diestro. - Corrimento patológico: purulento associado a piómetra (cérvix aberto) e metrites, corrimento em endometrites (corrimentos vulvares), praganas (corrimentos sanguinopurulentos), … → obrigam a fazer uma avaliação mais a fundo. Qual a diferença entre ciclo reprodutivo e ciclo éstrico? ▪ Útero – se estiver normal não se consegue palpar na maioria das cadelas. Sente-se um cordão à palpação que é o corpo do útero ou cérvix. Consegue-se palpar se estiver gestante, se tiver uma piómetra, etc. A técnica de palpação consiste em palpar com o animal em estação, colocamo-nos atrás do animal com as mãos paralelas direccionadas ao púbis, com os dedos juntos e vou andando ventralmente e sinto o corpo do útero. A bexiga está mais à frente. Fazer colheita de amostra com zaragatoa e ajuda de um espéculo do fundo de saco vaginal. Há cadelas em que não se consegue por um espéculo e aí fazemos só com zaragatoa. A zaragatoa vai servir para ver tipo de células e agente envolvido na produção de corrimento. Após colheita com zaragatoa, se for para bacteriologia coloco a zaragatoa num meio de transporte. Se for só para citologia vaginal, rodo primeiro lateralmente e depois a topo sobre a lâmina. A coloração utilizada é o Giemsa ou Diff quick. Além de facilitar a colheita com zaragatoa, o vaginoscópio serve para verificar se há anomalias no canal vaginal , ver integridade da mucosa e avaliar o índice de crenulação da mucosa vaginal. Vulva: 2 lábios da vulva, comissura dorsal e comissura ventral. Septo ao nível do vestíbulo contém no bordo caudal o clitóris. O que está no meio do septo é o clitóris. Fossa do clitóris em baixo e canal vestibular em cima, onde é introduzido o espéculo junto à comissura dorsal. A introdução do vaginoscópio faz-se um ângulo de 800 porque a inclinação do vestíbulo com a vagina faz esta angulação. A técnica consiste em colocar o vaginoscópio sempre junto à comissura dorsal da vulva e junto ao tecto do vestíbulo, de forma a fugir da fossa do clitóris que é um fundo de saco. Introduzir o vaginoscópio sempre encostado ao tecto da vagina para fugir ao meato urinário (que está junto ao chão da vagina). Depois de fazer o exame físico em relação à parte vaginal fazer citologia para confirmar se está em pró- estro ou estro. Antes de fazer recolha com zaragatoa, passar água destilada ou soro fisiológico, porque as células aderem melhor a uma zaragatoa humedecida. Avaliar o índice de crenulação. 9Para saber se a cadela está no período óptimo para ser cruzada fazemos o doseamento de progesterona. Recapitulando: 1º: Citologia vaginal para saber se está em estro citológico ou não; 2º: Doseamento para determinar se o animal está a fazer a ovulação. Cruzar 48h após a ovulação. Gel que se coloca no vaginoscópio convém que não seja espermicida, porque a cadela vai ser inseminada! Introdução do espéculo → Com a mão colocamos o dedo do meio atrás da vulva, fechamos a vulva caudalmente e os dedos que sobram afastam os lábios da vulva. Ao fechar a vulva caudalmente estamos a bloquear a fossa do clitóris. Depois do espéculo introduzido verifica-se o índice de crenulação. Exames complementares na cadela? ▪ Vaginoscopia – sempre que há corrimento; ▪ Citologia e bacteriologia; ▪ Ecografia – quando suspeitamos problemas de ovários ou piómetra, para ver se está gestante… ▪ Raio X – para contar o nº de fetos no fim da gestação; diagnóstico de piómetras caso não se tem ecógrafo; ver se a cadela tem alguma malformação, por exemplo no canal obstétrico ou ureteres ectópicos a abrir na vagina; para tentar perceber o porquê do parto estar a ser distócico. ▪ Doseamento de progesterona e relaxina (sempre que a cadela esteja gestante). ▪ Prolactina – kits de humanos e por isso não serve de grande coisa. ▪ Indirectamente podemos saber os níveis de estrogénio através da citologia vaginal, pois os estrogénios vão fazer hipertrofia celular. No cão fazemos citologia na mucosa peniana ou prepucial para ver se o cão está sob acção dos estrogénios (Ex: em caso de Sertolinoma). Não se faz doseamento de estrogénios! Os kits que existem são para humanos. ▪ Também se pode medir os picos de LH com kits para medição de LH canino, mas não é viável, porque é pulsátil e temos que estar a medir de 30 em 30 minutos durante 6 horas, enquanto com doseamento de progesterona conseguimos perceber isso. Aula: 1- Exame físico da vulva; 2- Abertura dos lábios da vulva só com uma mão; 3- Palpação do corpo do útero; 4- Introdução do espéculo. 10 Exame Andrológico do Garanhão – Exame do Ejaculado (14/10/2015) A primeira coisa que se avalia é o volume com a fracção com gel, que surge a seguir da fracção rica em espermatozóides. O gel em ambiente natural de cópula serve para impedir que haja refluxo do sémen para o exterior, fazendo uma espécie de rolhão. Para avaliação do ejaculado não é desejável ter esta fracção com gel, pois é prejudicial para a avaliação das características microscópicas do ejaculado (perturba o movimento, etc…). Deste modo, quando se faz avaliação microscópica tanto para aprovação do garalhão como para processamento de doses seminais, nunca se utiliza esta fracção com gel, fazendo-se filtração de forma a remover o gel. Muitas vezes é feita uma filtração ainda na manga descartável, com o filtro que vem acopolado com os copos e aí nem sequer se verifica qual é a quantidade de gel. A quantidade de gel está relacionada com a quantidade de líbido e estimulação do cavalo (fora da época reprodutiva, por exemplo, há menor produção de gel). Quanto mais o cavalo for estimulado, mais as glândulas anexas vão ser estimuladas e maior vai ser a produção de gel e maior é o volume total do ejaculado. A avaliação da quantidade de gel é um parâmetro que não é muito importante que seja avaliado, a não ser que exista alguma afecção das glândulas anexas. Após a recolha do ejaculado, mesmo que a manga tenha um filtro, pelos motivos acima mencionados, faz- se uma filtração, não só para remover o gel como também para remover os agregados celulares macroscópicos e esmegma. Antes de adicionar o diluidor, com o auxílio de uma pipeta graduada, verifica-se qual é o volume total sem gel e avalia-se macroscopicamente o aspecto, nomeadamente verifica-se se há presença de pus, sangue ou urina, bem como se infere a concentração de espermatozoides no ejaculado através da observação da cor (quanto mais leitoso estiver, mais quantidade de espermatozoides tem e, pelo contrário, quanto mais translúcido estiver, menos espermatozoides tem). Ainda antes da adição do diluidor, devemos observar uma gota a fresco (se o animal for azospérmico não vou ter espermatozóides e não adianta adicionar diluidor, porque não tem espermatozoides. Evita-se, assim, gastar dinheiro com diluidor num animal que é azospérmico). Para além disso, previamente à adição do diluidor deve-se fazer um exame bacteriológico a partir de uma zaragatoa do ejaculado, para verificar se há bactérias transmitidas pelo sémen. A maioria dos diluidores têm antibióticos e, por isso, o exame bacteriológico tem que ser feito antes de adicionar o diluidor. Adição de diluidor – faz-se uma diluição de 1:1 a partir de uma alíquota do ejaculado, ou seja, não se utiliza o ejaculado todo para um exame biológico pois, por exemplo, se o animal produz 50 ml de ejaculado vou ter que utilizar 50 ml de diluidor, o que é um gasto desnecessário. Assim, faz-se uma diluição de 1:1 a partir de uma alíquota do ejaculado (na aula utilizou-se 5 ml de diluidor e 5 ml de ejaculado). Com excepção do processamento para doses seminais, em que se utiliza o ejaculado todo e se dilui tudo de uma vez. Propriedades do diluidor: ✓ Não podem ser espermicidas; ✓ É um meio nutritivo com açúcares (com diluidor os espermatozoides andam mais rápido); ✓ Tem um tampão para manter o pH e a isotonicidade; ✓ Gema de ovo e leite para proteger as membranas plasmáticas dos espermatozoides; ✓ Antibióticos 11 Se não adicionarmos o diluidor rapidamente o ejaculado perde as características inicias. Se não fizermos a avaliação em 5 minutos os parâmetros obtidos já não vão ser os reais. A adição de diluidor permite-nos manter as características do ejaculado durante mais tempo. Mobilidade em massa só nos bovinos! Nos equinos só se consegue avaliar a mobilidade individual, porque a concentração do sémen dos equinos não é tão elevada como nos bovinos. A mobilidade individual é avaliada colocando uma gota entre lâmina e lamela. Estas têm que estar aquecidas e temos que utilizar uma platina térmica para que a temperatura não afecte a nossa avaliação e se tenha menos movimentos que os reais. Os movimentos mais importantes são os rectilíneos e progressivos (são os que andam em frente). Esta avaliação é subjectiva e é feita por estimativa à observação. Os observadores menos treinados devem fixar-se num campo e contar quais os espermatozoides que estão a andar em linha recta (devem ser os primeiros a ser contados, porque vão desaparecer do campo), quais os que andam em círculo e a oscilar e quais os que estão imóveis. Depois de contar estas 3 proporções, obtém-se a percentagem de espermatozoides com movimentos rectilíneos e progressivos (são os que estão a andar em linha recta para a frente). Faz-se o mesmo em mais 4 campos e obtêm-se uma média dos 5 campos observados. Observadores muito treinados não necessitam de fazer esta observação de 5 campos e em centros de reprodução muitos avançados existe um computador com um sistema que se chama CASA (Computer Assisted Sperm Analysis System) que faz a avaliação da gota de ejaculado (movimento, tipo de movimentos, rapidez de movimentos, concentração...). Como são sistemas com um custo muito elevado, só se justifica se existir um grande movimento de animais e se for um centro em que os animais se desloquem ao centro, pois este sistema desregula-se com os movimentos, tendo que ficar sempre estático numa bancada para não desregular). A segunda prova a ser realizada no exame do ejaculado é a prova da vitalidade e morfologia.A vitalidade e morfologia são dois parâmetros que servem para aprovar e rejeitar determinado garalhão, mas são dois parâmetros que não entram para a determinação do número de espermatozoides viáveis. Parâmetros utilizados para avaliação da capacidade reprodutiva do garalhão: 1) Morfologia – determina-se se a percentagem de espermatozoides anómalos é superior a 30%. Se tiver mais do que 30% de espermatozoides anormais, é mais um parâmetro utilizado para rejeitar o garalhão. 2) Vitalidade - nunca pode haver menos vivos do que espermatozoides móveis. Portanto, a vitalidade apesar de não entrar para as contas, serve de controlo! 3) MRP (Movimentos rectilíneos e progressivos) – Mobilidade individual – deve ser > 50% de espermatozóides com MRP, mas o ideal é 60%. 12 4) Concentração – 30 a 300 spz/ml 5) Volume – deve ser entre 30 a 200 ml Pela avaliação destes parâmetros percebemos se o cavalo está apto ou não para reprodução consoante se insere dentro da normalidade em cada um destes parâmetros. A morfologia e vitalidade dos espermatozóides são avaliados num único teste em que é feito um esfregaço com o corante eosina-nigrosina (corante supra-vital). O corante serve para ver quais eram os espermatozóides que estavam vivos e mortos e os que são normais e anormais. Nos mortos há permealidade da membrana e a eosina vai entrar e corar o espermatozóide. A nigrosina serve para corar o fundo do esfregaço de rosa, fazendo o contraste. Coloca-se uma ou duas gotas de corante numa gota de ejaculado, mas não é uma concentração certa, ou seja, é conforme a concentração do ejaculado. Como a concentração do ejaculado avaliado na aula era baixa, colocou-se apenas uma gota de corante numa gota de ejaculado. No esfregaço com corante eosina-nigrosina contam-se, em 200 espermatozóides, o nº de espermatozoides vivos e o nº de espermatozóides mortos e, dentro dos vivos e mortos, conta-se o nº de espermatozoides normais e nº de espermatozoides anormais. As anomalias dos espermatozoides podem ser divididas em anomalias primárias (directamente relacionadas com a espermatogénese, ou seja, a nível testicular), secundárias (relacionadas com a maturação dos espermatozoides, ou seja, relacionadas com o epidídimo) e terciárias (relacionadas com a boa ou má prática do operador). Por norma, as anomalias de cabeça e peça intermédia são maioritariamente primárias e as anomalias de cauda são maioritariamente secundárias e, eventualmente, terciárias. Durante a preparação do esfregaço, tudo tem que estar à temperatura de 37oC (corante, lâmina, diluidor…). A partir do momento em que se faz a avaliação da mobilidade individual e o esfregaço já não é necessário estar à temperatura de 37oC. Eddie (cavalo do qual se fez a avaliação do ejaculado na aula prática) – degenerescência testicular mole, que afecta os túbulos seminíferos e portanto, há problemas na espermatogénese. Espera-se que este cavalo tenha muitas anomalias primárias nos espermatozoides e MRP muito baixos. Baixos MRP também podem ocorrer por problemas a nível do plasma seminal. Neste caso, a morfologia da maioria dos espermatozoides está normal e ao adicionar o diluidor parte do problema é resolvido e temos melhoria dos parâmetros com a adição do diluidor, sendo por isso importante fazer sempre a observação do ejaculado a fresco e, posteriormente, diluído. 13 Célula epitelial (não deve ser contada, assim como células inflamatórios): Se observarmos muitos neutrófilos é sinal de que existe uma inflamação activa. Cabeças destacadas - hipóteses: ✓ Operador fez um esfregaço de forma muito brusca; ✓ Há uma fragilidade intrínseca de ligação entre cabeça e peça intermédia e com o processamento as cabeças destacam-se das caudas (anomalias primárias). Por isso, nunca se contam caudas isoladas, só cabeças. Caso contrário, não sabemos a que espermatozoide pertence a cauda que estamos a contar. Nota – só se conta como vivo os que estão totalmente brancos. Os que estão parcialmente corados, significa que já há permeabilidade da membrana e contam-se como mortos. Gotas citoplasmáticas que são um remanescente das células de Sertoli (anomalia secundária). A gota vai migrando, ao longo da maturação, da cabeça para a cauda do espermatozoide até ser eliminada. Os espermatozoides imaturos ainda têm a gota citoplasmática. Se a maioria das anomalias encontradas forem gotas citoplasmáticas distias, isso não significa que o garalhão tenha problemas, mas significa que estamos a fazer uma sobre-utilização do garalhão, ou seja, estamos a fazer um mau maneio. Muitas caudas enroladas – operador induziu choque térmico aos espermatozóides (anomalia terciária). Espermatozóide vivo anómalo com duas cabeças (anomalia primária) e espermatozoide morto com anomalia na inserção da peça intermédia. Nota: Não confundir o diluidor com a solução fixadora que tem formol (serve para fazer o cálculo da concentração e por isso é que tem formol para os espermatozoides não andarem de um lado para o outro na câmara de neubauer. A solução fixador serve para imobilizar os espermatozoides)! O diluidor é um fluido branco ou amarelo, porque ou tem leite desnatado ou gema de ovo. A solução fixadora encontra-se à temperatura ambiente. A terceira etapa é a determinação da concentração: ✓ Realiza-se numa câmara de neubauer. Faz-se a contagem nos quadrados laterais (os mesmos onde se contam os leucócitos) e não na câmara central. ✓ Faz-se diluição 1:100 (solução fixadora:ejaculado com diluidor – a gota a fresco é só para ver se o animal é azospérmico e exame bacteriológico. Tudo o resto é feito com a totalidade do ejaculado com diluidor). ✓ Para todas as provas é importante homogeneizar sempre a amostra, porque os espermatozoides mortos depositam-se no fundo do tubo. A homogeneização não deve ser feita de forma brusca. 14 ✓ Depois de fazer a diluição, retira-se 10 μl e coloca-se na câmara de neubauer, com a ponta encostada à lamela, junto à câmara. O fluído entra por capilaridade na câmara. Concentração = nº de espermatozoides contados em 16 quadrados x 2 (porque diluição 1:1, se fosse fresco não se multiplicava por 2) x 106 spz/ml 106 → 104 (0,1 mm de altura x 1 mm de largura → volume = 0,1 mm x 1 mm2 de área = 0,1 mm3 = 0,0001 cm3 = 0,0001 ml = 10-4 ml) + 102 (diluição 1:1 – 10 μl de ejaculado + 990 ml de solução fixadora → multiplicar por 100 para fazer o acerto) Antes de contar, devemos esperar 5 min para que os espermatozoides sedimentem e não fiquem em diferentes planos. Determinação do nº de espermatozoides viáveis = nº total de espermatozoides (concentração x volume) x % espermatozóides com MRP (na aula deu 10%, portanto multiplicou-se por 0,1) → numa monta natural determinou-se que uma dose inseminante são 500 milhões de espermatozóides. O espermatozoides do cavalo que analisámos era oligospérmico (baixo nº de espermatozoides totais) e subfértil (porque não tinha um nº de espermatozoides acima dos 500 milhões, ou seja, tinha baixo nº de espermatozoides viáveis). O cavalo nestas condições pode ser utilizado, mas não em monta natural, mas por inseminação artificial, mas com algumas técnicas e não por inseminação artificial normal. Este cavalo não deve ser utilizado, caso se trate de uma situação congénita, porque pode ser passado à descendência. No entanto, caso se trate de Barras laterais – coloca-se saliva nas duas bandas adjacentes à câmara de forma a que a lamela adira e fique por cima das câmaras com uma altura fixa das câmaras que é 0,1 ml. Deve-se utilizar preferencialmente um dedo diferente dodedo que que utilizamos para colocar a lamela, pois, caso contrário, ficamos com a lamela conspurcada com as nossas células epiteliais. A lamela tem que estar bem fixa. 1 2 1 e 2 – câmaras (são as zonas espelhadas) 15 um problema adquirido, por exemplo, numa situação de orquite, podemos utilizar na mesma o cavalo, pois isso não passa à descendência. Nota: Se no exame disser a concentração é de X, é a concentração do ejaculado! Não temos que multiplicar por nada, porque não tem diluidor!!! Se obtivermos um nº de espermatozoides muito alto, é normal se tiver um grande diâmetro testicular e intertesticular, pois a um grande parênquima testicular, está associado um elevado nº de espermatozoides. Técnicas a utilizar num garalhão subfértil: ✓ Recolher mais do que um ejaculado, junta-los e fazer a inseminação (método mais económico); ✓ Fazer deposição do sémen no corno do útero (quanto mais à frente depositamos o sémen, menos quantidade é necessária); ✓ Estereoscopia – com um endoscópio vamos até à papila do oviducto e deposita-se aí o sémen (neste técnica são necessários apenas 25 milhões de espermatozoides) → técnica muito dispendiosa e de eleição para cavalos muito valiosos e subférteis. Só é feito por especialistas na área. Cada dose inseminante tem que ter 500 milhões de espermatozoides. 16 Exame Andrológico do cão – Exame do Ejaculado (21/10/2015) Características macroscópicas do sémen de um canídeo: ✓ Cor ✓ Viscosidade ✓ Volume ✓ Não tem gel e por isso não é necessário fazer filtração como se tem que fazer com o sémen do cavalo. ✓ Tem 3 fracções, avaliadas separadamente: → 1ª Fracção – não nos interessa avaliar, porque serve para limpeza da uretra. Vem de próstata. É translúcida. → 2ª Fracção – é a que nos interessa avaliar. É a fracção epidendimária. Quanto mais concentrada for, mais esbranquiçada é. Características que se avaliam: ▪ Viscosidade; ▪ Cor; ▪ Volume; ▪ Concentração; ▪ Mobilidade; ▪ Morfologia; ▪ Vitalidade. → 3ª Fracção – é a fracção prostática, tem um aspecto mais translúcido. Avalia-se a cor e o pH. É importante ser avaliar o pH, porque o pH que não esteja entre 6,3 e 6,7 vai provocar alteração dos movimentos progressivos e rectilíneos dos espermatozoides. Muitas vezes basta ter alteração da fracção prostática para que o cão não consiga deixar a cadela gestante. O pH baixo diminui a mobilidade dos espermatozoides. Esta situação pode ser ultrapassada recolhendo a segunda fracção separada da terceira fracção e em vez de juntar a terceira fracção para aumentar o volume da segunda fracção, junta-se diluidor que tem que ter no mínimo tampão. O pH da fracção prostática é avaliado com tiras de medição de pH ou através da observação da mobilidade dos espermatozoides na segunda fracção isoladamente e, de seguida, juntamos uma gota de segunda fracção com uma gota de terceira fracção e observamos se houve alteração na mobilidade dos espermatozoides. Em relação à cor da fracção prostática, esta pode ter uma cor rosada devido a uma hiperplasia benigna da próstata (também pode ser devido a uma orquite, tumor prostático,…). O volume da 3ª fracção não é importante ser avaliado, porque há cães que não ejaculam a terceira fracção pois estão num ambiente estranho. O que é mais importante são as características do ejaculado. Parâmetros microscópicos Parâmetros macroscópicos 17 Análise da 2ª fracção: 1) Avaliação da mobilidade individual dos espermatozoides – é avaliado pela análise de uma gota de sémen a fresco. Avaliam-se os movimentos rectilíneos, circulares, retrógrados, imóveis e movimentos pendulares (cabeça fixa e cauda anda como um pêndulo). Diluição do ejaculado numa concentração de 1:1 prévia à análise da mobilidade: ✓ É difícil avaliar a mobilidade individual dos espermatozoides se estiverem todos muito juntos; ✓ Serve para a nutrição dos espermatoides; ✓ Muitos espermatozoides em pouco volume tornam o meio ácido, porque os espermatozoides em movimento libertam ácido láctico. O ácido láctico vai diminuir a mobilidade dos espermatozoides. É por isso também que o diluidor tem um tampão. ✓ Usa-se diluidor quando a fracção prostática é de má qualidade e não posso juntar a fracção prostática à fracção epidendimária, bem como se usa quando preciso de fazer sémen refrigerado ou congelado. Neste caso tenho que centrifugar o sémen, de forma a retirar o sobrenadante e a juntar ao pellet dos espermatozoides o diluidor. ✓ Constituintes do diluidor: gema de ovo ou leite (serve para proteger as membranas do frio); tampão; frutose ou glicose e antibióticos. Se utilizarmos sémen congelado, para além destes constituintes tem glicerol (ao contrário do leite, o glicerol entra dentro do citoplasma da célula, substituindo a água, impedindo, assim, a formação de cristais). Movimentos progressivos rectilíneos → Devem ser superiores a 70 %. No cavalo é normal ter 30 a 40%, enquanto essa percentagem no cão é muito má. Este parâmetro é muito subjectivo e depende muito da temperatura, por isso tem que ser avaliado logo após a colheita. 2) Vitalidade e morfologia: Coloca-se corante eosina-nigrosina e faz-se esfregaço. A eosina cora os espermatozoides mortos, devido à alteração da permeabilidade da membrana. A nigrosina serve para fazer o contraste de fundo. Vitalidade → conta-se em 100 espermatozóides quais os que estão mortos e os que estão vivos. Morfologia → Defeitos morfológicos podem ser primários, secundários e terciários. Avaliam-se em 100 vivos quais os normais e anormais e nos anormais caracteriza-se o defeito (macrocefalia, gota citoplasmática,…). Defeitos primários – ocorrem na espermatogénese. Ex: macrocefalia, dupla cabeça, microcefalia, dupla cauda. Defeitos secundários – ocorrem no epidídimo, associados à maturação. Ex: gota citoplasmática que pode ser proximal ou distal. Quanto mais proximal for, mais imaturo é o espermatozoide. Defeitos terciários – Ex: cabeças destacadas (num máximo de 5%, se for superior não será um defeito terciário, podendo ser por exemplo devido a uma orquite, pois o aumento da temperatura fragiliza o citoesqueleto), caudas enroladas na extremidade por choque térmico (para evitar isto, tudo o que está em contacto com o ejaculado deve ser aquecido e a avaliação deve ser feita em 18 platina aquecida), cão que passa da primeira fração para a segunda fracção e não temos espermatozoides nenhuns (medição da fosfatase alcalina para distinguir se é a 2ª fracção ou 3ª fracção. Se o valor de fosfatase alcalina for superior a 5000 e se a fracção for translúcida, significa que o cão é azospérmico), tubo com gotas de água ou contaminação com urina (“sémen todo morto”). O sémen do cão é muito mais resistente à temperatura do que o do cavalo, por isso até se pode utilizar um saco de plástico para fazer a recolha do sémen. Esfregaço → atenção à espessura do esfregaço! Coloca-se uma gota do corante com o ejaculado na ponta de uma lâmina. Molha-se uma das extremidades de outra lâmina na gota e à frente da gota realiza-se o esfregaço. Legenda: 1 – Morfologia normal. Espera-se que tenha movimento rectilíneo. 2 – Morfologia normal, apesar de a cauda estar dobrada (a cauda não ficou esticada quando se fez o esfregaço). Espera-se que tenha movimento rectilíneo. 3 – Este espermatozoide tem movimento retrógado, porque tem uma gota citoplasmática que vai empurrara cauda para trás. 4 – “Coiled tail” – defeito primário. Espermatozóide é imóvel, tendo a cauda completamente enrolada na porção intermédia. 5 – Defeito terciário provocado por choque térmico. Cauda enrolada na extremidade. 6 – Tem movimento retrógado. Tem a cauda partida. 3) Concentração Diluição de 1:100 do ejaculado com formol citrato a 1% ou água para matar os espermatozoides. Caso contrário, os espermatozoides andam em movimento pela câmara de Neubauer e não se conseguem contar. [SPZ] total = nº de espermatozoides contabilizados x 102 (diluição) x 104 (volume da câmara de Neubauer) Câmara de Neubauer → Contam-se os 4 quadrados na diagonal de cada um dos quatro quadrantes laterais das duas câmaras. 19 Nº total de espermatozoides para inseminar a cadela = nº de espermatozoides (contam-se todas as cabeças de espermatozoides que vemos) x 106 x % vivos e normais ou % mpr (escolhe-se sempre o valor mais baixo) x 2 (volume = 2ml) → o ideal é ter no mínimo 600 milhões de spz normais com mpr Inseminação artificial: ✓ Inseminação normal é feita no fundo de saco vaginal com espéculo e uma pipeta de inseminação (há quem use uma algália). Indroduz-se a pipeta de inseminação acoplada a uma seringa com sémen no fundo de saco vaginal. Após inseminação, levanta-se as patas traseiras da cadela durante um tempo. ✓ Inseminação intra-uterina → com sémen congelado ou no caso de macho subfértil tem que se fazer obrigatoriamente uma inseminação intra-uterina. Pode-se fazer por: ▪ Laparotomia – eticamente reprovável ▪ Endoscopia – utilizando endoscópio vaginal que custa 10.000€ ▪ Com cateter norueguês – exige que se tenha muita técnica. É o mais económico. Risco de perfurar a vagina porque exige o alinhamento do cérvix com a vagina por palpação transabdominal. A cadela tem que ser magra e não pode estar a fazer prensa abdominal, caso contrário pode-se perfurar a vagina. Este cateter foi desenhado inicialmente para inseminação em raposas. Uma colheita de sémen dá para uma cadela e a dose inseminante mínima é de cerca de 200 a 300 milhões se a deposição for vaginal e 100 milhões caso a deposição seja intrauterina. Num volume de 2 ml, quanto de fracção prostática ou de diluidor se junta aos 2 ml da 2ª fracção para fazer uma inseminação no fundo de saco vaginal? → 2 ml de fracção espermática + 6 ml de fracção prostática num cão de grande porte e 500 μl de fracção espermática + 2 ml de fracção prostática num cão de pequeno porte (por exemplo, um Pincher). O volume na inseminação vaginal vai depender muito do tamanho do cão. 20 Exame Ginecológico da Égua (28/10/2015) Condições de segurança no campo: ✓ Ter um tronco ou fardos de palha por trás para absorver o impacto de um possível coice. No Outono-Inverno é comum as éguas desenvolverem folículos anovulatórios hemorrágicos que muitas vezes se transformam em hematomas hemorrágicos que dão dor à palpação. Às vezes estamos a palpar uma égua calma, mas ao palpar um folículo anovulatório hemorrágico a égua sente dor e dá um coice para se defender! Quer quando estamos a fazer uma palpação rectal, inseminação artificial ou citologia uterina temos que ter uma distância de segurança desde o ânus até à porta que nos permita retirar o braço, pois as éguas sentam-se e podem partir-nos o braço. Essa distância deve ser no mínimo um palmo. Ciclos reprodutivos da égua: As éguas em termos reprodutivos classificam-se como poliéstricas sazonais, ou seja, numa parte do ano estão a ciclar e na outra parte do ano não. A égua inicia a sua ciclicidade na primavera. Durante o inverno está em anestro, quando chega a primavera vai haver crescimento folicular e entra na fase de transição do anestro para a época reprodutiva, ou seja, durante a fase de transição há folículos de crescimento → atrésia → folículos em crescimento → atrésia, etc… até que por fim há ovulação e a égua entra na época reprodutiva em que começa a ter ciclos éstricos que se classificam em duas fases: Estro e Diestro. A égua não tem metaestro nem proestro. Se a égua estiver sob acção de estrogénios, temos crescimento folicular e comportamento de cio associado significa que está em estro. Se a égua tem corpo hemorrágico ou corpo lúteo, temos progesterona em circulação e está em diestro. A não ser que fique gestante, a égua durante a época reprodutiva vai andar sempre em Estro Diestro. Se não ficar gestante, na fase de Outono (Outubro – Novembro), a égua entra em fase de transição para anestro que pode ser novamente crescimento folicular atrésia ou crescimento folicular lento e depois falhas na ovulação e é onde se formam muitas vezes os folículos anovulatórios hemorrágicos (o folículo cresce, como não há nenhum estímulo de ovulação, não há colapso das paredes e ovulação e o folículo é preenchido por sangue e pelo hematoma e vê-se à eco uma estrutura muito grande e desorganizada. Estas estruturas diferenciam-se na mesma em tecido lúteo e acabam por regredir e a égua entra em anestro). No caso da égua como o tempo de gestação é de 11 meses, a altura ideal para que a égua comece a ciclar é na Primavera, para que na primavera seguinte, quando parir, haja alimento para o potro. No caso das ovelhas e cabras, como o tempo de gestação são 5 meses, faz sentido que comecem a ciclar no Outono para que quando fiquem gestantes possam parir na Primavera. A época reprodutiva oficial inicia-se antes da época reprodutiva ideal. Concretamente, inicia-se em Fevereiro, pois apesar da maior parte das éguas ainda não estarem a ciclar, há éguas que são poliéstricas 21 contínuas que podem logo ser inseminadas nessa altura ou então aproveita-se o cio do poldro para fazer inseminações logo nessa altura. Ciclo reprodutivo varia entre fase de anestro, fases de transição e época reprodutiva. Quando está na época reprodutiva, a égua tem ciclos éstricos. O ideal é engravidar em Abril e parir em Março. Fases do ciclo reprodutivo (4 estadios): Anestro (Outubro-Fevereiro) → Fase de transição de anestro para época reprodutiva (Fevereiro – Abril) → Época Reprodutiva ou Fase Reprodutiva (Abril-Outubro. Vários ciclos éstricos, cada um com estro-diestro) → Fase de transição de época reprodutiva para anestro. Estas 4 fases do ciclo reprodutivo reproduzem-se todos os anos a não ser que a égua fique gestante e passa ao estado gestante, depois tem o cio do poldro, a seguir entra em anestro de lactação e depois volta a passar pelos 4 estadios do ciclo reprodutivo normalmente. Durante a fase reprodutiva, em cada 21 dias temos um ciclo éstrico, sendo que 7 dias são de estro e 14 dias são de diestro. Antes de se efectuar a avaliação do aparelho reprodutor e zona perineal, é importante verificar se a glândula mamária está em condições ou não, pois caso não esteja, depois o potro morre porque não bebeu o colostro. Devemos fazer palpação das glândulas mamárias da égua, vendo se não têm nódulos ou estão fibrosadas, ver se estão muito achatadas, pequenas e em forma de triângulo (as glândulas mamárias aumentam só no momento antes do parto. Uma hipertrofia subida pode significar início de aborto) e concluir se a fêmea tem capacidade aleitante ou não. Para além da palpação da glândula mamária, devemos ordenhar os tetos para ver se há secreção. Se houver secreção purulenta é sinal de inflamação. Exame Ginecológico da égua: 1. Fazer ligadura da cauda com vetrap ou manga descartável (mais económico). O problema da luva é que se for uma égua muito nervosa, pode assustar-se.2. Lavar com água e sabão para tirar o que está conspurcado, limpar e depois desinfectar com desinfectante pouco agressivo para mucosas (iodopovidona ou clorexidina). Atenção: Os desinfectantes estimulam a defecação! 3. Avaliação da conformação perineal: ✓ A vulva deve estar alinhada na vertical com o ânus. ✓ Se a égua não tiver uma boa condição corporal e estiver magra, os lábios da vulva sobem e a vulva torna-se oblíqua → contaminação com fezes. ✓ Lábios vulvares mal coaptados → entra ar na abertura vaginal e a égua passa a ter pneumovagina constantemente. ✓ Canal vaginal fica oblíquo e urina e fezes vão para o fundo de saco vaginal → urovagina. ✓ O cérvix abre no estro e encerra no diestro. Quando o cérvix abre no estro há contaminação ascendente → endometrites. ✓ Existe uma forma objectiva de avaliar: → Medir ângulo que os lábios formam com a vertical (ângulo zero → lábios estão na vertical): 5o (no caso da égua avaliada na aula); 22 → Medir distância entre comissura dorsal e comissura ventral = 10 cm (égua avaliada na aula prática); → Medir distância entre púbis e comissura comissura dorsal (deve ser 20% da distância entre comissura dorsal e comissura ventral). Usa-se compasso sem bicos para fazer a medição. → Índice de Caslick = 5o x 2 cm = 10 → Índice de Caslick: < 50 – conformação normal 50 – 150 – vigiar metrites, maneio médico e sem maneio cirúrgico > 150 – maneio cirúrgico → Sutura de Caslick – sutura da comissura dorsal da vulva para não entrar ar nem fezes. As éguas não podem ter monta natural e antes do parto tem que se desfazer a sutura. ✓ Uma égua normal pode parir durante uns 20 anos! ✓ Endometrite: → As éguas quando têm endometrites não têm sinais sistémicos, ou seja, não engravidam, não têm febre, não têm corrimentos exuberantes, etc… → Só endométrio afectado. → O dono chama o MV porque a égua está sempre a fazer cio. → Quando há endometrite (inflamação) há produção de PGF2α, há luteólise precoce (o corpo lúteo dura menos) e as éguas têm cios recorrentes, porque o diestro em vez de durar 14 dias, que é o normal, dura apenas 7 dias. → As éguas não têm quistos ováricos. Isso ocorre nas cadelas e vacas. → Uma endometrite não tratada tem como consequência endometriose. → Tratamento das endometrites: ▪ Não se faz tratamento sistémico. ▪ Quando detectamos endometrite queremos que a égua esteja em estro, para o cérvix abrir e expulsar o conteúdo contaminado (pode-se fazer administração de prostaglandinas exógenas para estimular estro). Durante o estro a imunidade local também aumenta. ▪ O tratamento consiste na lavagem uterina no estro até remover fonte de infecção. Faz-se lavagem com lactato de ringer (ou soro fisiológico – confirmar com prof!). Muitas vezes associa-se ocitocina na última lavagem para o útero contrair e expulsar tudo o que há de material fonte de contaminação. ▪ Os agentes que causam endometrite são microrganismos comensais do pêlo que depois vão para o útero. O agente mais comum de endometrites é o Streptococcus equi zooepidemicus, mas também a E. Coli, Pseudomonas e Klebsiella podem ser agentes de endometrites. ▪ Se o tratamento não resultar, faz-se antibioterapia digirida, posteriormente a citologia para TSA. ▪ Taylorella equigenitalis é outra coisa! → Causa a metrite contagiosa e é de declaração obrigatória (lista B). É venérea! Não se aceita animais vindos de locais onde houve declaração de Taylorella equigenitalis e é necessário fazer excisão cirúrgica da fossa clitoral, portanto mais vale prevenir fazendo o despiste, que apesar de custar cerca de 36€ temos garantia que no futuro não teremos consequências económicas mais graves. Devido aos meios de enriquecimento que 23 têm que ser feitos, os resultados para diagnóstico de Taylorella equigenitalis não são imediatos. ▪ O tipo de placenta faz com que muitos partos sejam benéficos, porque o endométrio vai renovando. 4. Vaginoscopia: ✓ Objectivo: ver se há corrimentos, ver se há edema das pregas uterinas (ao contrário da cadela em que temos edema das pregas vaginais), ver se cérvix está relaxado (o cérvix é comparado a uma flor: quando a égua está em estro, o cérvix está relaxado e vai estar sobre o chão vaginal e parece uma flor murcha; quando a égua está em diestro, uma vez que a progesterona vai conferir tonicidade ao útero, consequentemente o cérvix vai estar também tonificado e ao vaginoscópio observamos o cérvix subido e fechado como uma flor. A observação do cérvix ao vaginoscópio permite ter uma ideia da fase do ciclo éstrico em que a fêmea está. Contudo, há éguas que não fazem relaxamento do cérvix mesmo estando em estro e não se tem por isso a imagem típica de estro. Não esquecer que todas as éguas que estão em anestro ou em fase de transição há relaxamento do cérvix também). A vaginoscopia também é importante para ver se lacerações vaginais no pós-parto e para fazer punção aspirativa eco-guiada (PAAF) a uma massa vaginal. ✓ Observação do cérvix ao vaginoscópio + palpação rectal para ter uma ideia da fase do ciclo reprodutivo em que a égua está: Diestro – ↑ Progesterona. Cérvix firme e fechado à observação com vaginoscópio e à palpação rectal sentimos útero supertónico e muito firme, ovários pequenos e sem estruturas foliculares grandes. No Diestro há sempre corpo lúteo presente. Estro – ↑ Estrogénios. Cérvix relaxado à observação com vaginoscópio e útero quando se faz palpação tipo gelatina (edema) e estruturas foliculares grandes no ovário. No estro vamos ter um folículo dominante. Fase de transição - ↑ estrogénios → cérvix murcho mas pode ter folículos grandes. A fase de transição nem é estro nem anestro. Há produção de estrogénios, os folículos vão crescendo, mas depois não há ovulação e o folículo regride ou faz folículo hemorrágico anovulatório e, por isso é que temos que acompanhar. Anestro – sem hormonas → relaxamento cérvix ✓ A vaginoscopia + palpação rectal permite apenas ter uma ideia, ou seja, não são 100% fidedignas. O melhor é fazer Eco e observar as estruturas. Só a ecografia nos permite saber ao certo em que fase do ciclo a égua está e, por isso, hoje em dia é a ecografia que é realizada. ✓ Normalmente usam-se vaginoscópios de acrílico, mas existem outros de metal. Contudo, os de acrílico são melhores porque têm uma ranhura (canal de trabalho) que permite fazer, por exemplo, uma PAAF. ✓ Cuidados a ter na palpação rectal: → Boa lubrificação; → Unhas rentes; → Cavalos são sensíveis a nível da mucosa rectal e fazem facilmente lacerações; → Retirar as fezes e mão entra em cunha; → Nunca contrariar os movimentos peristálticos. Deixar que a égua faça as contracções e só quando estiver relaxada é que avançamos. 24 1º Ligadura da cauda com manga descartável 2º Lavar com água e sabão 3º Secar com papel 4º Desinfectar com iodopovidona ou clorexidina 5º Medição do índice de Caslick 25 6º visualização da fossa clitoral e com zaragatoa retira-se material da fossa clitoral para avaliação da microbiota. 7º Vaginoscopia 5. Ecografia: Para que serve a ecografia? ✓ Para determinar a fase do ciclo éstrico; ✓ Corpo lúteo da égua não é palpável porque cresce para o interior da mucosa, por isso tem de se fazer ecografia; ✓ Quando estamos a seguir um ciclo éstrico porque queremos fazer inseminação para saber se a égua está perto da ovulação ou não (vamos medindo o folículo e vendo se se encaminha para a fossa de ovulação, se altera a sua forma, etc.) ✓ Diagnóstico precoce de gestação (a partir dos 10 dias pode-se ver o embrião);✓ Para ver endometrites; ✓ Quando queremos ver quistos uterinos. Os quistos uterinos são quistos linfáticos que, se forem muitos e estiverem num local importante podem comprometer a viabilidade da gestação. Os quistos uterinos não têm nada a ver e têm etiologia diferente dos quistos ováricos nas cadelas e vacas. Como é feita a ecografia rectal? ✓ Normalmente usa-se uma sonda linear, pois têm os cristais alinhados e ocupa menor volume, do que por exemplo, uma sonda sectorial. ✓ Ao contrário das cadelas que têm útero em “V” (corpo uterino pequeno e cornos uterinos grandes), a égua tem útero em forma de “T” (corpo uterino grande e cornos uterinos pequenos). ✓ Primeiro faz-se a avaliação do corpo uterino e depois faz-se a avaliação dos cornos uterinos e ovários. ✓ O ponto de referência é a bexiga. 26 ✓ Corpo uterino – em corte longitudinal a o corpo uterino tem a forma de um rectângulo com linha hiperecogénica. Coloca-se a sonda por cima da sínfise púbica. ✓ Cornos uterinos – em cortes transversais sucessivos, em cima do corno uterino, a imagem que se obtém é de um círculo para as referidas estruturas. ✓ O oviducto não é visível ecograficamente. ✓ Diestro – útero vai ter ecogenicidade homogénea, porque não há edema das pregas e por isso vai estar todo igual em termos ecogénicos. Á ecografia vê-se o útero e depois uma linha hiperecogénica, que, como não temos conteúdo uterino, é a zona do lúmen com as duas mucosas a sobrepor-se e, por isso é que se vê uma linha hiperecogénica. Nos ovários, nesta fase do ciclo éstrico, à ecografia encontra-se um corpo hemorrágico (significa que a ovulação ocorreu há pouco tempo e ainda não há tecido lúteo. Estrutura em forma de pêra com uma cavidade central e muito hiperecogénica porque está preenchida por sangue) ou corpo lúteo (pode ser cavitário ou não, caso a cavidade ainda não tenha sido preenchida por tecido lúteo. Continua a ter cerca de 3 cm de tamanho, mas tem uma ecogenicidade que já não é tão branca como no corpo hemorrágico, tendo uma tonalidade cinzenta, característica de corpo lúteo. O corpo lúteo quando entra em regressão, há contracção do tecido lúteo e substituição do tecido lúteo por tecido fibroso, ficando mais pequeno, mais denso e mais ecogénico). ✓ Estro – existem vários folículos a crescer, sendo que se um deles já tiver atingindo a dominância, significa que é esse que vai ovular. O folículo dominante atinge o tamanho pré-ovulatório aos 35 mm. Isso significa que a partir dos 35 mm podemos contar com a iminência da ovulação do folículo dominante e este já responde à indução da ovulação com fármacos indutores de ovulação, nomeadamente o HCG. Se administrarmos HCG dentro de 24h a 48h depois vamos induzir a ovulação. Na prática, faz-se a indução da ovulação e solicita-se ao colega que envie o sémen para inseminação dentro de 24 a 48h. Só se pode induzir a ovulação se tivermos um folículo dominante com tamanho superior a 35 mm! Ver se há um folículo dominante em cada ovário → não é viável e desejável uma situação de gémeos! Numa situação de vários folículos dominantes, podemos dizer ao proprietário para não usar esse ciclo e usar antes o próximo ciclo éstrico ou elimina-se selectivamente uma das vesículas embrionárias (por esmagamento pré ou pós-fixação). Se as ovulações forem assíncronas e fizermos o esmagamento antes de dia 16 podemos ver só um embrião e estão lá dois. Neste caso é aconselhável fazer o esmagamento 10 dias depois da ovulação do segundo folículo. Se os embriões se fixarem no mesmo corno, não há tecido suficiente para a implantação dos dois embriões e um acaba por morrer. Se cada um dos embriões se fixar num corno diferente, esmaga-se um dos embriões num dos cornos. Sonda com doppler – pode-se perceber pela irrigação se os embriões vão implantar bem ou não. Se percebermos pelo dopper que aquela gestação não vai avante, não precisamos fazer o esmagamento. Sonda com doppler é muito mais cara. O corno uterino com edema típico no estro à ecografia aparece com a forma de uma laranja cortada ao meio com os gomos ou a roda de uma bicicleta com os raios. Nunca se consegue visualizar o ovário todo à ecografia e temos que fazer vários cortes transversais. A égua observada em aula tinha um folículo com 5 cm e ainda não tinha ovulado. Dado já estar em cio há muito tempo, provavelmente está a entrar em fase de transição e o folículo não vai chegar a ovular e vai regredir. Atenção que há éguas ovulam com folículos dominantes com 3,5 cm e outras só com folículos dominantes com 6 cm, por isso tempos que ir vigiando! Um sinal de que a ovulação está perto é o aumento do edema das pregas uterinas. 27 Após a ovulação há 6 horas para inseminar (o óvulo aguenta 6h)! O sémen refrigerado ou fresco tem validade de 48 a 72h e congelado tem validade de 12h. Em suma… Estro – observo folículos em crescimento. Se o cérvix já estiver muito relaxado e edemaciado, possivelmente já se observa um folículo com tamanho pré-ovulatório (folículo com tamanho acima 35 mm). Diestro – espera-se encontrar um corpo lúteo. Útero – pontinhos brancos é ar. Ao fazer o exame podemos provocar uma infecção iatrogénica se não tivermos cuidado nem medidas de higiene, porque entra ar e o ar não é estéril. 28 Citologia Vaginal da Cadela e Doseamento de Progesterona (04/11/2015) O facto de o dono referir que a cadela começou com corrimento num determinado dia muitas vezes não é compatível com o início citológico e endócrino do pró-estro. O pró-estro pode já ter começado mais cedo, mas a cadela só apresentou corrimento sanguíneo mais tarde. É importante ter esta noção para quantificar correctamente os dias em pró-estro. A existência de corrimento sanguíneo inicialmente e depois edema e turgidez da vulva são características de uma cadela em pró-estro, assim como a mucosa vaginal edemaciada. Isto acontece devido à acção estrogénica. Estro – a turgidez desaparece e mantêm-se o edema. Se fizermos festas na zona do períneo a cauda da cadela anda de um lado para o outro. Por vaginoscopia, na fase de estro, avalia-se o índice de crenulação a nível da mucosa vaginal. Quanto mais próximo da ovulação se está, maior o índice de crenulação. Diestro – as pregas da mucosa já não estão crenuladas. Colheita da citologia vaginal é sempre feita, preferencialmente, do fundo de saco vaginal, para evitar que a zaragatoa venha contaminada com células da fossa do clitóris e zona vestibular. Citologia Vaginal: Na citologia vaginal avaliam-se 3 tipos de células: células basais, céluas intermédias e células superficiais queratinizadas. Células basais – são as mais viáveis, com capacidade de se multiplicar e próximas do suprimento sanguíneo. É uma célula relativamente pequena, com um núcleo grande, citoplasma pequeno, pequena relação citoplasma/núcleo e bordos arredondados. Existem também, num estadio a seguir, as células parabasais, que são um pouco maiores que as células basais. Como a distinção entre célula basal e parabasal é difícil, considera-se tudo células basais as células que estão mais próximas do suprimento sanguíneo. Sob acção de estrogénio, as células basais sofrem hiperplasia (aumento do nº de células) e hipertrofia (aumento do tamanho), ou seja, as células basais começam a multiplicar-se e o número de camadas que compõe o epitélio vaginal vai aumentando durante o proestro, começando a aparecer as células intermédias. Células intermédias – são célulasque já não são tão viáveis como as células basais, no núcleo já há sinais de cariólise e cariorréxis (apresenta já alguns vacúolos ao nível do núcleo), citoplasma aumentou (daí o aumento do tamanho da célula), mas os bordos da célula continuam arredondados. Estas células intermédias compõem a camada intermédia. Há medida que se avança no proestro, como o número de camadas de células vai aumentando, chega a um ponto em que as células intermédias deixam de ter suporte sanguíneo, não chegando assim nutrientes e oxigénio, o que leva à morte dessas células, que passam a ser células superficiais queratinizadas. 29 Células superficiais queratinizadas – são células mortas que queratinizaram. Os bordos deixam de estar arredondados e passam a estar angulosos e o núcleo passa a ser um núcleo picnótico. Muitas destas células com o tempo perdem o núcleo e passam a ser escamas. Para além destes 3 tipos de células, numa citologia vaginal avalia-se também a presença de eritrócitos e neutrófilos. 30 Outras células que também são avaliadas numa citologia vaginal: Células em forma de charuto – são células queratinizadas da fossa do clitóris e do vestíbulo. Quanto maior o número obtido destas células numa citologia vaginal significa que a colheita foi mal feita e eu bati com a zaragatoa no vestíbulo. Não é patológico. Ocorre com maior frequência nas raças pequenas em que não conseguimos meter o vaginoscópio, abri-lo e ainda por uma zaragatoa, porque a estrutura é muito pequena. Células escamosas – células intermédias com vacúolos no seu interior. São mais típicas da primeira metade do diestro, embora também possam existir na primeira metade do proestro. O seu significado é desconhecido. Células de metaestro – são células intermédias com capacidade fagocitária e, portanto, são células que têm neutrófilos no seu interior. São características da primeira metade do diestro. 31 Bactérias aderentes às células epiteliais. Existe sempre uma flora a nível da mucosa vaginal que durante o pró-estro e estro “ganham vida”, porque têm sangue e células descamadas que constituem um meio propício à sua multiplicação. Vê-se principalmente nas células superficiais queratinizadas muitas bactérias aderentes. Com o processo de descamação, com o facto de estarem aderentes às células epiteliais, vai fazer com que haja eliminação da contaminação (“mecanismo de limpeza”). Só há infecção se observar neutrófilos! Caso contrário, tenho contaminação, mas não tenho infecção! Cimoncélias – colónias de milhões de bactérias. A cimonciélia é uma bactéria da flora bucal que a cadela ao lamber-se passa para o epitélio vaginal. Não é muito comum observar isto na citologia vaginal, mas se aparecer não é patológico. Células uterinas – células com núcleo excêntrico (descentralizado), pouco citoplasma, rectangulares. São iguais em todas as células. Encontram-se no esfregaço vaginal no início de pro-estro (epitélio do endométrio começou a proliferar) e início do anestro (nesta fase há regeneração do epitélio endometrial. O anestro convém ser o mais longo possível para que o útero sofra um processo de involução). Numa lâmina de Anestro espera-se encontrar poucas células e células basais. Contudo, uma lâmina de primeiro mês e de último mês de anestro é totalmente diferente de uma lâmina de segundo ou terceiro mês de anestro, em que o anestro é profundo. Sendo assim, vamos encontrar muito poucas células basais em anestro profundo e mais células basais no princípio e fim do anestro. Primeira metade do proestro – encontramos células intermédias, células basais, eritrócitos e neutrófilos. Como ainda temos células basais, significa que o número de camadas do epitélio ainda não é muito grande e, por isso, ao passar a zaragatoa apanho quer células da camada intermédia quer da camada basal, o que significa que estamos na primeira metade do proestro pois, em princípio, na segunda metade do proestro não teremos células basais. Os eritrócitos vêm do corrimento sanguíneo do útero (o corrimento sanguíneo do pró-estro e estro vem do útero). Os neutrófilos vêm dos vasos da vagina que estão por baixo da camada basal. Os neutrófilos por diapedese saem dos vasos e como o número de camadas ainda é relativamente pequeno, os neutrófilos ainda conseguem chegar ao lúmen vaginal e são apanhados na citologia. Atenção! O facto de não existir eritrócitos numa lâmina de proestro não significa que a fêmea não esteja em proestro. Não devemos excluir que está em proestro só porque não vemos eritrócitos na lâmina! Ao fazermos as lavagens e coloração da lâmina, se o pH da água destilada estiver alterado, ocorre a lise dos eritrócitos. Pode ser também um cio seco! 32 Segunda metade do proestro – encontramos células intermédias, alguns neutrófilos, eritrócitos. Como já não encontramos células basais estamos na segunda metade do proestro. No último terço do proestro já se observam células com bordos mais angulosos, contudo ainda não se observa mais de 80% de células superficiais queratinizadas. Só se pode falar em estro citológico quando temos mais de 80% de células superficiais queratinizadas. Na prática, apenas existe um número muito reduzido de cadelas que não têm 100% de células epiteliais queratinizadas em estro citológico. Se houver 100% de queratinização isso não varia ao longo do estro. O que varia no estro é o grau de descamação das células epiteliais queratinizadas, que se vê pelo número de células que existem na lâmina e pelo agrupamento celular. Com um índice de queratinização de 100%, se as células estão muito afastadas umas das outras significa que o índice de descamação não é muito intenso e estamos na primeira metade do estro citológico. Segunda metade do estro (cio citológico) – índice de queratinização de 100%. Já não se consegue identificar uma célula individualmente, estão umas em cima das outras, isto é, estão todas justapostas, porque as células começam a descamar em camadas (há mais descamação mais intensa que na primeira fase do estro). Além da coloração Giemsa, para a realização do esfregaço, pode-se utilizar uma coloração multicrómica como a coloração Papa Nicolau. Contudo, esta não faz muito sentido e não traz mais-valias em pequenos animais pois o que nos interessa observar não é o grau de queratinização da célula mas, uma vez que o animal está em cio citológico, o que interessa fazer é o doseamento da progesterona. A coloração Papa Nicolau também é mais cara e mais demorada. Há medida que se caminha no estro o fundo do esfregaço começa a ser mais límpido. O fundo do esfregaço no início do estro é mais sujo do que no fim do estro. Corrimento purulento vulvar em estro – Pode ser vaginite ou endometrite. O dignóstico diferencial entre as duas afecções é feito → Fazer ecografia – se o útero estiver aumentado e tiver conteúdo não pode ser uma vaginite. Primeira semana de Diestro → Células superficias queratinizadas (já não temos os 100% de céls. superficiais queratinizadas. Num dia temos 100% de células epiteliais queratinizadas e no outro dia já não temos), células intermédias e neutrófilos. Observamos células superficiais queratinizadas só na primeira semana de diestro! A partir daí, deixamos de observar células superficias queratinzadas! Primeira metade do diestro – já não observamos células superficiais queratinizadas, temos células intermédias (“cachos ainda são grandes”), células basais todas muito juntas umas às outras, neutrófilos, células espumosas, células de metaestro e descamação ainda muito intensa.Segunda metade do diestro – células intermédias, agrupamentos celulares começam a ter menos células (menor descamação – “cachos mais pequenos”), neutrófilos. Células intermédias com corpos de 33 degenerescência (não tem nada a ver com as células espumosas! Não são vacúolos, mas corpos de degenescência). Segunda metade do diestro → Células basais, células intermédias, muitos neutrófilos → ver proporção de neutrófilos em relação às células. O sinal clínico que o animal apresenta é corrimento purulento. Sinal de piómetra aberta. Cérvix fechado → diestro normal → citologia normal Fim do Diestro e princípio de anestro – Células intermédias, basais, núcleos de células cujo citoplasma degenerou, ou seja, núcleos sem citoplasma (as células estão há quase 2 meses no epitélio vaginal). Anestro profundo – a lâmina praticamente não tem células, células disformes, células intermédias pequenas ou basais “feias”. Espermatozoides – se o cruzamento foi há poucas horas, consegue-se perceber se o cruzamento ocorreu. Num cão sem nenhuma patologia, por aposição de uma lâmina à mucosa peniana obtenho uma lâmina semelhante a um epitélio vaginal em diestro. O macho tem sempre corrimento prepucial associado com uma balanopostite, daí se observar neutrófilos e isso não é nenhuma infecção! Caso o cão esteja sob acção estrogénica, como acontece num caso de Sertolinoma, para além das células espumosas, neutrófilos, células basais, células intermédias e células de metaestro que fazem parte do epitélio normal, encontro também células queratinizadas (os estrogénios induzem multiplicação das células basais e aumento da camada de células que reveste a mucosa peniana. As células começam a ficar longe do suprimento sanguíneo, morrem e sofrem um processo de queratinização). Não se faz doseamento de estrogénios nos cães! 34 Sarcoma de Sticker: diagnóstico por aposição de lâmina à massa. São células com citoplasma vacuolizado, núcleo de grandes dimensões e intensamente corados, pouco citoplasma que é irregular (vacuolizado). Se o citoplasma não fosse vacuolizado, seriam células basais. É um tumor muito friável e por isso por aposição obtenho uma lâmina com muita quantidade de células. As zonas que observamos acastanhadas é sangue, pois é um tumor extremamente hemorrágico. 35 Corrimento hemorrágico crónico e persistente após o parto, estando na 6ª-7ª semana pós-parto, sem nenhum outro sintoma clínico e a única alteração no hemograma é anemia → pode ser laceração vaginal ou subinvolução placentária (comum em cadelas jovens). Doseamento de Progesterona: Faz-se quando temos a cadela em cio citológico e queremos cruzar o animal, pois a citologia já não serve para nada para saber se estamos ou não perto da ovulação, se está na primeira ou segunda semana, etc… Para fazer o doseamento de progesterona podemos utilizar: ▪ Kits semi-quantitativos como o Ovulation Test – indicam valores de progesterona entre intervalos. Vêm com uns copos e uma palete de cores com a qual comparamos a cor desenvolvida pela nossa amostra. O problema destes kits está no facto de serem kits enzimáticos e, por isso, a velocidade da reacção depende muito da temperatura ambiente e são kits em que os tempos têm que ser cumpridos escrupulosamente, porque caso se ultrapasse os tempos a cor desvanece. Outra situação é o facto de serem testes semi-quantitaivos, logo não servem para quando necessitamos de valores exactos. Contudo, quando pretendemos fazer inseminação com sémen fresco estes kits são suficientes. A cor desenvolvida nestes kits é inversamente proporcional à concentração de progesterona que doseio, porque os copos têm uma membrana revestida com anticorpos anti- progesterona. Quanto mais progesterona da amostra tenho ligada aos epítotos dos anticorpos anti- progesterona, menos progesterona marcada com enzimas se vai ligar aos anticorpos anti- progesterona, logo menos substrato é degradado e menos forte é a cor. C 1 – corresponde à progesterona basal C 2 – corresponde ao pico de LH C 3 – corresponde à ovulação C 4 – após a ovulação 36 ▪ Enviar para laboratório de Medicina Humana ou Medicina Veterinária – normalmente faz-se testes de quimioluminescência. Se pretendemos concentrações exactas temos que fazer um teste quantitativo. 37 Conservação do sémen e IA em equinos (11/11/2015) O processamento e conservação do sémen só se faz em centros de recolha de ejaculados para refrigeração ou congelação. Procedimento: 1º Recolha do ejaculado 2º Processamento do ejaculado Para a recolha do ejaculado usa-se um manequim natural (égua em cio), no qual se limpa e desinfecta a zona perineal, de forma a evitar contaminações do pénis do garalhão, pois o garalhão ao montar a égua, acaba sempre por tocar na zona perineal desta, antes de se fazer o desvio para a vagina artificial. Quais são os comportamentos típicos de cio numa égua e num cavalo em época de reprodução? ✓ Cavalo – Cavalo aproxima-se da égua, cheira-a, mordica os flancos e a cauda e quando vê que a égua está com os reflexos de imobilização, monta-a. Para além disso, também exibe o flehmen (“mostra os dentes”) depois da cópula. ✓ Égua em cio – apresenta reflexos de imobilização (égua imóvel), quando o cavalo monta a égua dá um jeitinho para se posicionar alinhada com o cavalo, baixa os curvilhões e emite urina (cavalo exibe flehmen também aqui) e faz contracções rítmicas da vulva de forma a expor o clitóris. Durante a recolha do sémen a égua está peada para evitar que a égua dê coices e magoe quem está a fazer a colheita do ejaculado. Também porque há éguas que são muito dominantes, dão coices e não se deixam montar mesmo quando estão em cio. Movimento de báscula da cauda do garanhão – sinal típico de ejaculação. Avaliar a pressão da vagina artificial antes de tirar o copo com o ejaculado → Vai fazer com que escorra mais ejaculado para o copo de recolha. Análise macroscópica e microscópica do ejaculado: 1º Filtrar o ejaculado para uma proveta para tirar o gel. Não esquecer de registar previamente o volume do ejaculado com gel (na aula o volume do ejaculado com gel obtido foi 45 ml). O volume do ejaculado está mais relacionado com a estimulação das glândulas anexas, do que com a espermatogénese. Machos Subférteis – quando tem menos espermatozoides viáveis do que a dose inseminante. Machos Oligoespérmicos – quando tem menos espermatozoides totais do que o normal para a espécie. 2º Observar as características macroscópicas do ejaculado 3º Observar gota a fresco para ter a certeza que vale a pena adicionar o diluidor → Retira-se com uma micropipeta 10 μl e observa-se ao microscópio que tem uma platina térmica portátil de forma a manter a temperatura. 38 4º Preparar doses inseminantes → adionar diluidor na mesma proporção do ejaculado (proporção de 1:1). O diluidor está quente (por volta da nossa temperatura corporal) e verte-se “a escorrer pelas paredes” o diluidor. 5º Observação e avaliação microscópica do ejaculado diluído (10 μl): ✓ Mobilidade individual – interessa os que têm movimentos rectilíneos e progressivos (contar 5 campos e em cada um dos 5 campos olhar para uma zona e ver primeiro se há mais parados ou a mexer, depois dentro dos que se estão a mexer ver qual é a percentagem dos que estão a andar em frente); ✓ Vitalidade e morfologia – feito através de esfregaço corado.
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