Reação de PCR do Gene da Amelogenina e Eletroforese

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Reação de PCR do Gene da Amelogenina e Eletroforese
1. Introdução
1.2 - PCR – Polymerase Chain Reaction
Considerada uma técnica de biologia molecular revolucionária, a reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) permitiu o rápido desenvolvimento do estudo de sequências de ácidos nucléicos (MOLINA et tal, 2004). Desenvolvida por Kary Banks Mullis (prêmio Nobel de química de 1993 pelo desenvolvimento dessa técnica) em abril de 1983, essa técnica de biologia molecular consiste na síntese enzimática de cópias de ácidos nucléicos (COSTA, 2010).
A técnica de PCR promove, por meio de etapas de variação de temperatura, a duplicação de cadeias de DNA in vitro. A reação de amplificação de DNA por PCR envolve o emprego dos quatro nucleotídeos (dNTP’s) do DNA, sequências iniciadoras (primers) e uma DNA polimerase termoestável. Assim, é possível a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucléico, a partir de uma fita molde. O princípio da PCR envolve três etapas básicas de variação de temperatura por ciclo, ou seja: 
a) Desnaturação da fita molde de DNA - etapa com duração entre 30 s a 1 min a temperatura entre 92 ºC a 96 ºC;
b) Pareamento de dois iniciadores sintéticos de composições distintas, que funcionam como os iniciadores da reação de polimerização, ligando-se à região complementar da fita de DNA alvo que sofrerá a duplicação. Etapa com duração de 30 s a 1 min a temperatura entre 58 ºC e 65 ºC; 
c) Amplificação por meio da enzima Taq DNA polimerase, das novas fitas de DNA a partir de cada um dos iniciadores, utilizando os quatro dNTP’s como substrato da reação de polimerização. Etapa com duração entre 45 s e 1 min a 72 ºC (COSTA, 2009). 
Cada ciclo é repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificação da região alvo determinada conforme o anelamento dos iniciadores sintéticos de DNA. Ou seja, o iniciador reconhece, por complementaridade de bases, o local de início da região do DNA a ser amplificada e fornece uma extremidade 3’-OH livre para a síntese da nova cadeia pela DNA polimerase. O grande problema inicial foi a desnaturação seguida da catálise pela enzima DNA polimerase que, obtida de Escherichia coli, não suportava a temperatura para abertura das fitas de ácidos nucléicos, reduzindo a sua atividade a cada ciclo do processo. Assim, a cada ciclo, uma nova quantidade de enzima deveria ser adicionada (COSTA, 2010). 
Contudo, em 1988, Saiki e colaboradores substituíram a polimerase de E. coli pela já conhecida Taq DNA polimerase, uma enzima obtida da bactéria Thermus aquaticus, encontrada em águas quentes de gêiseres e vulcões submersos, e possui uma atividade ótima de crescimento entre 70 ºC a 75 ºC. Assim, essa substituição promoveu maior independência ao processo além de aumentar a confiabilidade por redução de riscos de contaminação (COSTA, 2010). 
1.3 – Eletroforese
A técnica da eletroforese em gel consiste na separação de moléculas (DNA, RNA e Proteínas) por intermédio da submissão deste material a um campo elétrico. O princípio é baseado no fato da Molécula de DNA possuir carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino. A agarose é formada por um polímero de galactose, quando solidificada forma uma “rede” que restringe a passagem das moléculas durante a migração.
A concentraçã de agarose no gel e o tamanho da molécula submetida ao campo elétrico influencia diretamente o gradiente. A preparação do gel é feita p ela fusão da mistura do pó de agarose com a solução-tampão (TBE -Tris-Borao-EDTA). Posteriormente a aplicação do material e a submissão a corrente elétrica o gel é introduzido numa solução de brometo de etídio e finalmente fotocumentado em transiluminador de luz ultravioleta e então pode ser analisado. 
Por possuir carga negativa, o DNA é sempre aplicado do lado do pólo negativo no gel. Isso possibilita a corrida para o pólo positivo. A migração da molécula de DNA depende de diversos fatores: 
1) tamanho da molécula – quanto maior a molécula, maior o coeficiente de atrito desta, sendo assim a sua migração no gel será mais lenta. 
 2) concentração da A garose – a concentração do gel (0,8% - 1,0%) deixará o gel mais ou menos viscoso, isso possibilitará que um mesmo fragmento de DNA tenha uma maior velocidade de migração (gel menos viscoso, possui um menor coeficiente de atrito) ou uma menor velocidade de migração (gel mais viscoso, possui um maior coeficiente de atrito e facilita a separação de fragmentos menores).
1.3 – Gene da Amelogenina
É uma proteina que compõe, juntamente com a enamelina, o esmalte dentário. O gene da Amelogenina localiza-se nos cromossomos sexuais X e Y, sendo extensivamente utilizado na rotina forense para determinação do sexo em amostras de origem desconhecida através da amplificação pela PCR. No cromossomo X, o gene AMELX origina um produto de amplificação de 106 pb e no cromossomo Y, o gene AMELY dá origem a um produto de 112 pb. O gene AMELX contém uma deleção de 6 pb no íntron1. Portanto, analisados após corrida eletroforética, amostras de origem masculina (XY) mostram duas bandas, uma para o fragmento de 106 pb e outra para o de 112 pb, enquanto que as amostras femininas (XX) demonstram somente uma banda de 106 pb. Desta forma, a análise do locus da Amelogenina determina o sexo genético da amostra estudada (SANTOS, 2012).
2 - Objetivo 
Compreender os resultados apresentados na realização da eletroforese em gel de agarose, do DNA extraído do gene da amelogenina, realizados no laboratório da FMU.
3 – Materiais e Métodos
PCR – Extração de DNA por salting OUT
Colocamos 100  μL de sangue total em um tubo cônico. Adicionamos 200  μL de Buffer A e homogeneizamos. Em seguida adicionamos 20  μL de SDS 10%; e 10 μL de Proteinase K, incubamos a 65° C por 20’.
Adicionamos 100 μL de NaCl a 5 /m e agitamos por 10’. Centrifugamos a 2500 g por 10’.
Logo após os 10’, transferimos 350 μL para um tubo cônico limpo e acrescentamos 1000 μL de Etanol Absoluto gelado, misturamos por inversão por 2’ até o aparecimento das fibrilas de DNA. E na sequência colocamos novamente na centrifuga a 10000 rpm por 10’. Assim que finalizou o tempo, descartamos o sobrenadante e colocamos na estufa para secar o pellet de DNA. Aguardamos em torno de 20’a secagem, e acrescentamos 100 μL de água Milliq homogeneizamos para resuspender o pellet de DNA. 
Eletroforese:
Elaboramos 2 géis de agarose a 0,8% em 50 ml de TBE 1x. 
Preparo do DNA genômico:
15 μL do DNA
3 μL de Sample Buffer 
Ligamos e equilibramos a balança. Com auxílio da barca pesamos a agarose. Com auxílio de uma proveta colocamos 100 mL de TBE 1X em um balão volumétrico, após, adicionamos a agarose pesada e homogeneizamos.
Levamos para aquecimento por aproximadamente 5 minutos ou até que a solução estivesse completamente translúcida (sem bolhas).
Despejamos em cada uma cuba o gel, e com auxílio da professora adicionamos 5 uL de brometo de etídeo no gel, colocamos o suporte contendo os pentes próprios que serviram como molde para produzir as cavidades (poços) no gel.
Aguardamos 10 minutos para polimerização da matriz da agarose. Retiramos os pentes com cuidado para não danificar a matriz do gel.
O gel de agarose foi colocado no interior da cuba de eletroforese e foi imerso em tampão TBE 1X.
4- Resultados e Discussão
Suporte com o gel de agarose, e ao lado a cuba com pente que formam os moldes (poços) para acomodar a amostra de DNA. 
Cuba e aparelho de Eletroforese 
Como resultado obtivemos um gel contendo as respectivas bandas separadas pelo processo de eletroforese. Cada banda deve ser comparada com o padrão de pesos moleculares. O padrão das amostras migraram de forma satisfatória ao longo do gel, evidenciando uma eletroforese bem-sucedida e sem degradação da amostra de DNA. 
Durante a fotografia do gel, a luz U.V. ressalta a coloraçãodo corante (brometo de etídio). 
O tampão utilizado na corrida tem como função proteger o DNA da degradação do campo elétrico, ao qual o gel é submetido durante a eletroforese. 
5- Conclusão
A funcionalidade do gel de agarose foi visualizada através da corrida eletroforética, na qual visualizamos as bandas de DNA amplificado.
6- Referências 
MOLINA, Adriana Lopes, TOBO, Patrícia Renovato. Uso das Técnicas de Biologia Molecular para Diagnóstico. Disponível em: http://www.einstein.br/biblioteca/artigos/Vol2Num2/Serie%20Biologia%20parte%202.pdf. Acessado em 03 de maio de 2018.
COSTA, Ronaldo de Jesus. Técnica de Biologia Molecular: PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). Disponível em: http://www.portaleducacao.com.br/farmacia/artigos/8577/tecnica-de-biologia-molecularpcr-reacao-em-cadeia-da-polimerase. Acessado em 03 de maio de 2018.
SANTOS, JULIANA MENDONÇA FERREIRA DOS. ANÁLISE DA AMELOGENINA PULPAR PARA DETERMINAÇÃO DO GÊNERO BIOLÓGICO http://repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/290752/1/Santos_JulianaMendoncaFerreirados_M.pdf . Acessado em 03 de maio de 2018