Apresentação 2

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7. SOBRE OS CUIDADOS IMPORTANTES NO EXAME DE 
WESTERN-BLOT, ESTÁ ERRADO:
• A)atentar para proteínas com alta massa molecular e hidrofobicidade pois 
tornam a transferência mais lenta.
• B)géis fixados podem ser transferidos, por isso se deve corar o gel antes da 
transferência;
• C)bolhas entre o gel e membrana causam problemas na transferência;
• D)manipular as membranas sempre com luva e pinça, já que as impressões 
digitais podem interferir na adsorção de proteínas
SOBRE O MÉTODO ELISA, ASSINALE O QUE FOR 
CORRETO:
• A) Possui apenas dois métodos de se fazer o ELISA.
• B)No método direto, possuímos um antígeno ligado a um anticorpo e um anticorpo com 
uma enzima que se liga ao primeiro anticorpo.
• C)A enzima mais comumente usada como cromóforo é a peroxidase.
• D)O método indireto baseia-se na detecção de antígenos.
SOBRE VANTAGENS DO ELISA, NÃO É VERDADE:
• A)Teste com alta sensibilidade, ou seja, tem habilidade de detectar quantidades mínimas 
do antígeno ou anticorpos pesquisados. (menos falsos negativos)
• B)Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em questão 
identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado) – menor risco de falsos-
positivos;
• C)Permite que poucas amostras sejam testadas ao mesmo tempo
• D)Realização relativamente simples e de custo baixo a médio (em comparação com 
outras técnicas de imunodiagnóstico).
ELISA E WESTERN 
BLOT
POR GUSTAVO H. AULER E WESLEY G.
ELISA - DO INGLÊS ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT ASSAY) OU ENSAIO DE 
IMUNOABSORÇÃO ENZIMÁTICA
• É um teste imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos específicos;
• Este teste é usado no diagnóstico de várias doenças que induzem a produção 
de imunoglobulinas;
• A adição de substrato ao complexo enzima-anticorpo-antígeno resulta num produto 
colorido, que é lido por um equipamento específico;
• ELISA baseia-se em reações antígeno-anticorpo detectáveis por meio de reações 
enzimáticas, sendo que a enzima mais comumente usada é a PEROXIDASE.
TIPOS DE TESTE:
• Direto: é considerado o tipo mais simples de ELISA. Nele o antígeno é 
fixado a uma placa de plástico, e então é adicionado um excesso de outra 
proteína (normalmente albumina) para bloquear todos os outros locais de 
ligação. Enquanto uma enzima está ligada a um anticorpo em uma reação 
separada, o complexo enzima-anticorpo é aplicado para fixar ao antígeno. 
Logo após, o excesso do complexo enzima-anticorpo é lavado e o 
anticorpo enzimático é deixado ligado ao antígeno. Ao se adicionar no 
substrato, a enzima é detectada ilustrando o sinal do antígeno.
DIRETO:
DI
INDIRETO:
• Indireto: é utilizado para detecção de anticorpos. O antígeno 
fica aderido aos poços da microplaca, e em seguida, é colocado 
ao soro um anticorpo marcado com uma enzima que reage 
com o substrato, fazendo com que o cromógeno mude de cor. 
A presença de cor nos poços indica a presença do anticorpo, 
enquanto que nos poços que não mudaram de cor, é indicada a 
ausência do anticorpo em questão.
INDIRETO:
ELISA
• Sanduíche ou de captura: é o método utilizado para detectar 
produtos secretados, como citocinas. Em vez de ligar o antígeno 
diretamente à placa, são ligados anticorpos específicos para o antígeno. 
Eles são capazes de ligar o antígeno com alta afinidade, e de concentrá-lo 
na superfície da placa, mesmo com antígenos que se encontram em baixas 
concentrações na mistura inicial. Um anticorpo distinto, marcado, que 
reconhece um epítopo diferente do anterior mobilizado na placa é 
utilizado para detectar o antígeno ligado.
• Competitivo: a presença e a quantidade de um antígeno em uma amostra desconhecida 
são determinadas pela sua habilidade de competir com um antígeno marcado pela ligação 
a um anticorpo fixado à placa. A curva-padrão é inicialmente construída pela adição de 
quantidades variáveis de uma preparação-padrão conhecida e não-marcada. O ensaio 
pode medir a quantidade de antígeno em amostras desconhecidas por comparação à 
curva-padrão. Este ensaio pode ser utilizado para medir anticorpos em uma amostra de 
composição desconhecida, através da fixação do antígeno apropriado ao poço e pela 
medição da habilidade da amostra em teste de inibir a ligação de um anticorpo específico 
marcado.
ONDE É USADO?
• ELISA pode ser utilizado para a realização de exames de bioquímica, 
imunologia, hormônios e microbiologia. Para análises clínicas, esse teste 
pode ser utilizado para a realização de diversos tipos de exames de rotina, 
como por exemplo HIV, HBsAg (hepatite B), PSA, ferritina, etc.
VANTAGENS:
• Teste com alta sensibilidade, ou seja, tem habilidade de detectar quantidades mínimas do 
antígeno ou anticorpos pesquisados (O ELISA detecta moléculas na ordem de nanogramas), o 
que resulta em menor risco de falsos-negativos;
• Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em questão identificará
somente o antígeno ou o anticorpo desejado) – menor risco de falsos-positivos;
• Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo;
• Realização relativamente simples e de custo baixo a médio (em comparação com outras
técnicas de imunodiagnóstico).
DESVANTAGENS:
• Necessidade de mão de obra especializada;
• Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com exposição à luz
do sol ou a elevadas temperaturas;
• Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito susceptível a
erros de pipetagem, variações nos tempos de incubação e lavagens, e
alterações nos reagentes.
• Referências Bibliográficas:
1. MURPHY, Kenneth. Imunobiologia de Janeway-8. Artmed Editora, 2014.
2. ICB/USP.
3. Portal Educação.
4. Biological Solution Specialist.
WESTERN-BLOT
UM GUIA PRÁTICO PARA SUA PROVA DE AMANHÃ(VAI CAIR)
WESTERN-BLOT
PROTOCOLO: 1.PREPARAÇAO DE AMOSTRA
• Para preparar as amostras para a execução de um gel de células e tecidos precisam ser 
lisadas para liberar as proteínas de interesse.
• Reagentes: CytoBuster ou PhosphoSafe para retirar proteínas de interesse do tecido alvo 
em questão. (Estes buffers extração contêm detergentes otimizado para extração 
eficiente de proteínas solúveis).
2. 2. SDS-PAGE
• O segundo passo é a separação Western blotting proteína. As proteínas são separadas 
com base no peso molecular.
3. TRANSFERÊNCIA DE PROTEÍNA
• Assim como proteínas com uma carga elétrica pode ser induzida a viajar por um gel em 
um campo elétrico, pode assim as proteínas ser transferidos em um campo elétrico a 
partir do gel para uma membrana, sendo ou PVDF ou de nitrocelulose.
4. ANTICORPOS E REAGENTES DE 
ACESSÓRIOS
• O primeiro passo para fazer a sondagem e do anticorpo ao antígeno é bloquear a 
membrana. Bloqueio da membrana impede ligação não específica de fundo.
• Uma vez que a membrana foi bloqueada, você está pronto para incubar com o anticorpo 
primário.
• Incubar o seu anticorpo secundário usando uma solução de 2 de SignalBoost. Incubar o 
anticorpo secundário em tampão de bloqueio por 1 hora. Lavar a membrana de novo 
várias vezes com TBST.
5. DETECÇÃO
• Para HRP conjugando anticorpos secundários, ECL é tradicionalmente utilizada. Um 
reagente ECL excelente que oferecemos é RapidStep. As vantagens de RapidStep são de 
que haja mistura de luminal ou enhancer é necessária. Basta pulverizar a membrana 
algumas vezes e desenvolver usando x-ray filme. RapidStep oferece uma sensibilidade 
pictograma baixo, bem como emitir luz por até 2 horas após a adição de substrato.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
• **Importante ler: http://cursobioquimica.iq.usp.br/kfile_arquivo.php?id=776
• https://www.jove.com/pdf/2359/jove-protocol-2359-western-blotting-sample-preparation-to-detection?language=Portuguese
CUIDADOS IMPORTANTES(CAI NA PROVA)
• Cuidados Importantes na Utilização da Técnica
- proteínas com alta massa molecular e hidrofobicidade tornam a 
transferência mais lenta;
- géis fixados não podem ser transferidos, por isso não se deve corar o gel 
antes da transferência;
- bolhas entre o gel e membrana causam problemas na transferência;
- manipular as membranas sempre com luva e pinça, já que as impressões 
digitais podem interferir na adsorção de proteínas;