TRABALHO febre amarela

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UNIVERSIDADE PAULISTA
 INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
 CURSO DE BIOMEDICINA
ATIVIDADE PRÁTICA SUPERVISIONADA
 DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
SOROCABA- SP
2018
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
ATIVIDADE PRÀTICA SUPERVISIONADA
 Orientação Prof. Yvonne klimesh
SOROCABA- SP
2018
INTRODUÇÃO 
Diagnósticos Laboratoriais são fundamentais para uma alta qualidade de resultados para pessoas que são suspeitas de conter a infecção pelo Vírus da febre Amarela. Este vírus da febre amarela é pertencente a um gênero Flavivírus e pode ser relacionado a outros vírus do mesmo gênero como Dengue, Zika e etc. Junto com as medidas de prevenções que seria a vacinação, temos os testes virológicos ou sorológicos que irão auxiliar a uma cadeia de preparação para combater o crescimento e deslocamento do vírus na população.
ARTIGO 6: Diagnóstico laboratorial de infecção pelo vírus da Febre Amarela
RESUMO 
Tipo de amostra e procedimentos laboratoriais
O diagnóstico da febre amarela é realizado por diversos métodos virológicos com a detecção do vírus ou do material genético em soro ou tecido. Os métodos são feitos por isolamento viral, reação em cadeia pela polimerase (PCR) ou por meio de provas sorológicas para a detecção de anticorpos. 
Considerações de biossegurança 
Todas as amostras biológicas como sangue total, soro ou tecido fresco são consideradas potencialmente infecciosas, todos os funcionários do laboratório que entram em contato com qualquer tipo de amostra deveram estar vacinados contra a febre amarela, o uso de equipamentos de proteção não se deve deixar de lado, sempre tomando cuidado com o manuseio para evitar acidentes por punção. É recomendada a realização de qualquer procedimento dentro de cabines de segurança biológica classe II certificadas. Para a manipulação de amostras não-humanas, uma avaliação de risco estrita deve ser realizada de acordo com os manuais de biossegurança de cada laboratório. O uso de cabines de segurança biológica classe III deve ser considerada nesses casos. 
Diagnóstico virológico 
Diagnóstico molecular: Na fase virêmica, cinco dias após o início dos sintomas é possível realizar a detecção do RNA viral em soro mediante técnicas moleculares, exemplo, a Transcrição Reversa seguida de Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR) convencional ou em tempo real.
Há casos onde o RNA viral pode ser detectado até sete dias desde o início dos sintomas, por isso se recomenda realizar tanto PCR como ELISA Igm para as amostras coletadas entre os días cinco a sete após o início dos sintomas.
Um resultado positivo confirma o diagnóstico, com tanto que o controle de qualidade dos testes estejam adequados.
Isolamento viral: O isolamento viral pode ser realizado por inoculação intracerebral em camundongos ou em cultura celular, devido a sua complexidade é pouco utilizado como metodologia para diagnóstico. Recomendado principalmente para estudos de pesquisa complementares à vigilância em saúde pública.
Diagnóstico post-mortem (depois da morte): O exame histopatológico com imunohistoquímica em cortes de fígado constitui um “método ouro” para o diagnóstico de febre amarela em casos fatais. Adicionalmente, os métodos moleculares a partir de amostras de tecido fresco ou conservados em parafina podem também ser utilizados para a confirmação dos casos.
Diagnóstico sorológico 
A detecção de anticorpos específicos é realizada a partir do quinto dia do início dos sintomas, na fase pós-virêmica da doença. 
 Um resultado Igm positivo por meio da técnica de ELISA: captura de Igm (MAC-ELISA), ou outro tipo de imunoensaio (imunofluorescencia indireta) em uma mostra coletada a partir do quinto dia do início dos sintomas, é provavél infecção recente pelo vírus da febre amarela. Nos dias de hoje (Dados de Fevereiro de 2017) não existem kits comerciais para detecção por ELISA. As metodologias dos laboratórios utilizando antígeno completo purificado podem ser padronizadas.
A confirmação de um caso de febre amarela mediante ELISA Igm dependerá da situação epidemiológica e do resultado do diagnóstico diferencial laboratorial. Em áreas com circulação de outros flavivírus (principalmente dengue e Zika), a probabilidade de reação cruzada é maior.
Outras técnicas sorológicas incluem: Detecção de Igg mediante ELISA, útil com amostras ‘’pareadas’’ coletadas com pelo menos uma semana de diferença.
E a técnica de neutralização pela redução de placas em anticorpos neutralizantes (PRNT), pode ser útil noventa por cento com amostras pareadas ou com uma só amostra pós-virêmica e quando o ensaio incluir multiplos flavivírus. 
Uma soroconversão onde o resultado é negativo com a primeira amostra e positivo com a segunda tem um aumento de mais de quatro vezes dos títulos de anticorpos em amostras pareadas, ou títulos detectáveis de anticorpos contra a febre amarela em uma amostra pós-virêmica (PRNT 90%) é provavél infecção por febre amarela. 
A confirmação de um caso de febre amarela mediante estas técnicas dependerá da situação epidemiológica e do resultado diferencial laboratorial, já que em áreas de circulação com outros flavivírus a posibilidade de reação cruzada é maior. Em áreas onde se realizam campanhas de vacinação ativa, pode ocorrer à detecção de anticorpos pós-vacinais, por isso o diagnóstico deve ser cuidadosamente interpretado.
 Artigo 6: Diagnóstico laboratorial de infecção pelo vírus da Febre Amarela
INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS POR SOROLOGIA E DIAGNOSTICO DIFERENCIAL
As cruzadas das técnicas sorológica podemos observar infecções secundarias por Flavivírus deve ser considerada em áreas onde a grade casos de febre amarela com outras doenças que pode ser transmitida via sanguínea como (dengue, encefalite de ST Louis, Zika, e outros do complexo encefalite japonesa). A vacina foi dada em toda população contra a febre amarela, essa vacina foi racionada, cada pessoa recebeu uma dose. A IGM da vacina pode constar por meses ou anos nos organismos das pessoas.
Por esse motivo devemos realizar em paralelo a detecção de anticorpos para outros Flavivírus e interpretar cuidadosamente os resultados levando em conta o histórico da vacinação, e verificar a epidemiologia disponível.
A técnica de neutralização pela redução de placas (PRNT, por sua sigla em inglês). Oferece uma maior especificidade que a detecção de IMG. Essa técnica de cruzada também é usada na técnica de neutralização que também é recomendada a realização dessas técnicas empregando antígenos para vários Flavivírus.
O diagnóstico da febre amarela tem um diferencial que devemos incluir outras síndromes, como febris e febris ictéricas como a dengue, leptospirose, malária, hepatites virais, entre outros. Depende do perfil epidemiológico do país ou aréa afetada. 
RESPOSTA IMUNE PÓS-VACINAL A vacina ela induz viremia que é relativamente baixa e diminui após três a quatro dias, e assim desenvolve uma resposta imune do tipo IgM e ela não pode ser diferenciada da resposta IgM por infecção natural. E assim essa resposta IgM vacinal pode ser detectada em torno de cinco dias em diante, e os níveis desse anticorpo tendem a diminuir. A resposta IgM pode ser detectada por até um mês depois da vacina, e em alguns pacientes pode passar por até três a quatro anos em casos de pacientes viajantes. E com todos esses conhecimentos podemos dizer que os resultados sorológicos nos pacientes vacinados se tornam complexo, e em pacientes vacinados recentementes, eles devem ser analisados com mais cautela e ter mais cuidados.
Conservação das Amostras:
-Devemos manter o sangue total sempre coletados em tubos EDTA ou o soro em tubo seco refrigerados sempre em 2 a 8ºC e será processado dentro de48 horas.
-Manter o soro sempre congelado a -10 a -20 °C e será processado depois de 48 horas ou em 7 dias.
-Manter o soro sempre congelado a -70°C e processar ele depois de uma semana. A amostra deve ser conservada adequadamente a -70°C em períodos prolongados.
-Evitar sempre múltiplos congelamentos ou descongelamentos.
-As amostras de tecidos frescos de 1 cm³ poderão ser utilizadas para diagnósticos moleculares, e deve congelar a -70° e ser enviadas para o laboratório em gelo seco. E se caso não for possível deve conservar o tecido fresco em solução salina estéril ou PBS refrigerados a 2 a 8°C e ser enviados com os gelos recicláveis.
-Os exames histopatológicos e por imunohistoquimica, a amostra de tecido de aproximadamente 1 cm³ deve ser conservada em formol tamponado e enviado ao laboratório de patologia em temperatura ambiente, e a amostra de tecido hepático é o melhor para exames de histopatológico e por imunohistoquimica. O baço e o rim podem ser uteis também.
Envio de Amostra por via aérea ao laboratório de referencia:
-Garanta a cadeia de frio com gelo seco (na medida do possível) ou com gelo reciclável e utilize sempre as embalagens triplas.
-Enviar, sempre se possível durante as 48 horas.
-Todas as amostras devem ser originais e embaladas, marcadas e com etiquetas, e documentadas como categoria B.
-Enviar junto à ficha clinica e epidemiológica completa.
 
 CONCLUSÃO
Começando pelo princípio, todos nós sabemos que quando se manipula amostras biológicas como sangue total, soro ou tecidos frescos são consideradas possivelmente uma potência infecciosa, e para cada funcionário que irá manipular e entrar em contato, se deve ter a prevenção de uma vacina contra o agente e também se manter os usos de equipamentos de proteção, mantendo cuidado e atenção no manuseio para que não haja um acidente por punção. Ah segurança é o início de tudo para que tudo ocorra bem.
  Em Diagnósticos Laboratoriais para Febre Amarela nós temos um teste que seria os Diagnósticos virológicos, onde se tem técnicas dentro deste padrão (Diagnóstico Molecular, Isolamento viral, Diagnóstico Post-Morten) nesta etapa de diagnósticos, estes testes serão usados na etapa virêmica, onde é possível detectar o RNA do vírus em soro, podendo também ser usadas para estudos de pesquisas a vigilância em saúde pública e para confirmação de casos onde se retira um corte de tecido fresco e dando um exame histopatológico com imunohistoquimicas se constituindo um "método ouro" para diagnósticos para Febre Amarela.
  Diagnósticos Sorológicos, estes testes são realizados após o período viremico e irá indicar a fase Pós-viremica, assim com detecção de anticorpos específicos e assim se obtém os resultados.
Os pacientes acometidos pelo vírus da Febre Amarela apresentam uma sintomatologia que pode ser facilmente confundida com outras doenças como dengue, zika, leptospirose, malária, hepatites virais, entre outras, dependendo do perfil epidemiológico do país ou área afetada. Os vários casos descritos acima passaram por um diagnóstico laboratorial que confirmaram e, ao mesmo tempo, diferenciou de outras infecções. Descreva como é feito o diagnóstico sorológico desses pacientes suspeitos.
R: A detecção de anticorpos específicos é realizada a partir do quinto dia do início dos sintomas, na fase pós-virêmica da doença. Um resultado IgM positivo por meio da técnica de ELISA: captura de IgM (MAC-ELISA), ou outro tipo de imunoensaio (imunofluorescencia indireta) em uma mostra coletada a partir do quinto dia do início dos sintomas, é provável infecção recente pelo vírus da febre amarela.
 2) Como é a resposta vacinal?
 R: A vacina ela induz viremia que é relativamente baixa e diminui após três a quatro dias, e assim desenvolve uma resposta imune do tipo IgM. Imunoglobulina M (IgM) é um anticorpo. Perfaz aproximandamente 10% do conjunto de imunoglobulinas. Sua estrutura é pentamérica, sendo que as cadeias pesadas individuais têm um peso molecular de aprox. 65.000 daltons e a molécula completa tem peso de 970.000. As 5 cadeias são ligadas entre si por pontes dissulfeto e por uma cadeia polipeptídica inferior chamada de cadeia J. A IgM é encontrada principalmente no intravascular, sendo uma classe de anticorpos "precoces" (são produzidas agudamente nas fases agudas iniciais das doenças que desencadeiam resposta humoral). É uma proteína que não atravessa a placenta (por ser grande). É encontrada também na superfície dos linfócitos B de forma monomérica, realizando a função de receptor de antígenos e ela não pode ser diferenciada da resposta IgM por infecção natural. E assim essa resposta IgM vacinal pode ser detectada em torno de cinco dias em diante, e os níveis desse anticorpo tendem a diminuir. A resposta IgM pode ser detectada por até um mês depois da vacina, e em alguns pacientes pode passar por até três a quatro anos em casos de pacientes viajantes. E com todos esses conhecimentos podemos dizer que os resultados sorológicos nos pacientes vacinados se tornam complexo, e em pacientes vacinados recentementes, eles devem ser analisados com mais cautela e ter mais cuidados.