5a aula prática Bioq I Extração e caracterização de polissacarídeos

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CURSO: Licenciatura em Química 
DISCIPLINA: Bioquímica I- 1° semestre 
Profa. Dra. Maria de Lurdes Corradi C. da Silva 
 
4ª Aula prática 
 
 
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS 
 
Objetivos: 
 
•••• Demonstrar a extração e caracterização de polissacarídeos de materiais biológicos: 
amido de batata e glicogênio de fígado. 
•••• Identificar o amido e o glicogênio como carboidratos. 
•••• Evidenciar o amido e o glicogênio através de reações de coloração e precipitação. 
 
1 Extração e caracterização do amido 
 
O monossacarídeo glucose é a mais importante unidade de formação de polissacarídeos 
na natureza. Os polissacarídeos de reserva das plantas (amido), dos animais (glicogênio) e 
os polissacarídeos estruturais das plantas (celulose) são formados exclusivamente de 
glucose. 
O amido encontra-se largamente distribuído no reino vegetal, sendo encontrado em 
sementes, tubérculos, etc. Dentro das células encontra-se na forma de grânulos, sendo 
característica a aparência microscópica dos amidos de diferentes fontes. Os principais 
constituintes do grânulo de amido são: a amilose e a amilo-pectina, polissacarídeos que 
diferem na estrutura molecular (verificar nos textos de Bioquímica). Quando se aquece uma 
suspensão de amido em água os grânulos se desintegram e formam uma solução coloidal de 
amido. 
Quando se adiciona uma solução de iodo ao amido desenvolve-se uma coloração azul, 
que é devida a formação de um complexo de amido com o iodo. 
 
2 Extração e caracterização do amido da batata 
 
2.1 Extração e preparo de uma solução de amido 
 
a) Extração: Raspar um pedaço de batata com uma faca, transferir a raspa para um béquer 
de 250 mL. Adicionar 100 mL de água destilada e agitar bem com um bastão de vidro. 
Filtrar através de gaze, recolhendo o líquido em erlernmeyer de 125 mL. Espremer a gaze. 
Deixar o amido depositar no fundo do erlernmeyer durante 10 minutos e, a seguir, remover 
cuidadosamente o líquido sobrenadante, desprezando-o. Irá sobrar no erlernmeyer um 
depósito de amido. 
 
b) Preparo de uma solução de amido: Manter aproximadamente 150 mL de água 
fervendo em um béquer de 250 mL. Acrescentar aproximadamente 50 mL de água fria ao 
depósito de grãos de amido obtido anteriormente e adicionar esta suspensão de amido 
lentamente e com constante agitação, à água fervente. Continuar o aquecimento até que se 
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forme uma solução opalescente. Depois de frio, dividir metade desta solução com outro 
grupo e usá-la para as experiências subseqüentes. 
 
2.2 Reações de caracterização do amido 
 
Reativos: 
 
•••• Solução de amido recém - preparada. 
•••• Ácido sulfúrico concentrado. 
•••• Solução de Fenol 5% 
•••• Solução de lugol 
•••• Solução saturada de sulfato de amônio. 
•••• Álcool etílico absoluto. 
 
a) Reação de fenol ácido sulfúrico: Esta reação é utilizada para pesquisa de carboidratos 
em geral. O mecanismo da reação baseia-se na formação de furfural e hidroximetil-furfural 
pela ação de um ácido forte sobre uma pentose e hexose, respectivamente. Os compostos 
furfúricos reagem com o fenol formando um produto de condensação colorido. No caso do 
amido, inicialmente haverá hidrólise pela ação do ácido sulfúrico, com liberação de 
moléculas de glucose. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
H
C
C OH
C HHO
C OHH
C OHH
CH2OH
O
H
Glucose
H2SO4
3 H2O +
C
C
O
C
C
C
O
HHO-H 2C
+
α−naftol
PRODUTO COLORIDO
(hidroxi - metil - furfural)
H
H
fenol 
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Técnica: 
 
Em um tubo de ensaio pipetar 0,5 mL de solução de amido (DILUIDA 
PREVIAMENTE DE 1:10), juntar 0,5 mL de solução de fenol 5% e adicionar 2,5 mL de 
ácido sulfúrico concentrado, num único jato. Observar a cor laranja característica da reação. 
 
b) Reação com iodo: Este teste é utilizado para a pesquisa do amido, que forma um 
complexo colorido com o iodo; a amilose dá origem a uma coloração negro-azulada, 
enquanto que a amilopectina dá origem a uma coloração vermelho-violácea. Este complexo 
se dissocia por aquecimento e torna a se formar quando a solução é resfriada. A explicação 
para este fenômeno advém do fato das cadeias lineares de amilose apresentarem uma 
conformação helicoidal capaz de ocluir o iodo, resultando no desenvolvimento da coloração 
azul-intensa típica. Para cada 6 resíduos glicosil ligados por α-(1�4) da amilose 
estabelece-se um passo da hélice. O aquecimento da solução de amido deve então alterar 
esta conformação e como conseqüência abolir a coloração resultante da interação amilose-
iodo. A amilopectina apresenta uma reação semelhante, mas a formação da hélice fica em 
parte dificultada pelos pontos de ramificação da molécula (=ligações α-(1�6). Por esta 
razão a intensidade da cor I2-amilopectina é menor e seu matiz (máx. de absorção) é 
também diferente (violáceo-avinhado). No glicogênio, ainda mais ramificado que a 
amilopectina, este impedimento é maior e a cor resultante é acastanhada. 
 
Técnica: 
 
Em um tubo de ensaio pipetar 2 mL de solução de amido e adicionar 2 gotas de lugol. 
Notar o aparecimento de cor azul intensa. Aquecer. Observar. Resfriar o tubo em água 
corrente. Observar. 
 
c) Precipitação do amido 
1. A 5 mL de solução de amido adicionar 5 mL de solução saturada de sulfato de amônio. 
Agitar fortemente e deixar em repouso por 10 minutos. Filtrar. Pesquisar, 
separadamente, no filtrado e no precipitado, a presença de amido pelo teste de iodo, 
adicionando 2 gotas de lugol ao precipitado e também no sobrenadante. 
2. A 2 mL de solução de amido adicionar 5 mL de álcool etílico. Agitar. Filtrar e pesquisar 
amido como na experiência nº1, tanto no filtrado, como no precipitado. 
 
3 Extração e caracterização do glicogênio hepático 
 
O glicogênio, um homopolímero de D-glucose, é o polissacarídeo de reserva dos 
animais e também de algumas bactérias, algas, leveduras e fungos. Aparece em abundância 
no fígado (até 10% do peso efetivo) e também compõe significativamente o músculo 
esquelético (1 a 2%). Nos hepatócitos o glicogênio aparece como grandes agregados 
moleculares, os grânulos ou "rosetas", formados por grânulos menores, estes por sua vez 
compostos de moléculas isoladas, altamente ramificadas e com peso molecular acima de 
106 daltons. Os resíduos glicosil do glicogênio estão covalentemente unidos por ligações 
glicosídicas do tipo α-(1�4) e também, em percentual bem menor, por ligações α-(1�6) 
(= pontos de ramificação). Cada ramificação por ligação (1�6) ocorre isoladamente 
criando então uma estrutura "arborescente" para o glicogênio. 
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O glicogênio é metabolizável por dois tipos de enzimas: a fosforilase (produzindo 
glucose-1-fosfato) e as amilases (α, β, amiloglucosidase, isoamilase, etc), estas produzindo 
glucose, maltose ou oligômeros maiores. 
O glicogênio pode ser isolado dos tecidos por meio de digestão a quente, com solução 
concentrada de álcalis fortes ou a frio com solução de cloreto de mercúrio. Em ambos os 
métodos são preservadas as ligações glicosídicas não redutoras α-(1�4) e α-(1�6). 
 
a) Extração do glicogênio hepático com KOH a quente: 
 
Lavar bem o fígado fresco de boi, cortar em pequenos fragmentos, e pesar 5g colocando-
os em um tubo de ensaio grande contendo 15 mL de KOH 5 M. Aquecer em banho-maria 
fervente, agitando ocasionalmente até dissolução do tecido (cerca de 15 minutos). Em 
seguida, colocar cerca de 40 ml de etanol gelado em um erlernmeyer e despejar, devagar, o 
material contido no tubo de ensaio, que já deverá estar frio, sobre o etanol gelado. 
O precipitado, conseqüência da adição do álcool, se aglomera em flocos. Manter no 
banho de gelo por cerca de 5 minutos. 
Centrifugar por 5 minutos a 3000 r.p.m. e eliminar o líquido sobrenadante. Redissolver 
todo o precipitado formado utilizando apenas 3 mL de água destilada. Reprecipitar com 10 
mL de etanol gelado.Centrifugar como anteriormente e redissolver o precipitado em 10 mL 
de água destilada. A solução formada é opalescente e contém o glicogênio. Dividir metade 
desta solução com outro grupo e utilizá-la para os experimentos subseqüentes. 
 
Caracterização colorimétrica e hidrólise enzimática do glicogênio 
 
Fundamentos: Sendo um polímero D-glucose com predominância de ligações do tipo 
α-(1�4) e com menor percentual de ligações α-(1�6) que originam ramificações na 
molécula (estrutura arborescente), o glicogênio é susceptível à hidrólise enzimática pelas α 
amilases, como por exemplo, a salivar. 
A exemplo da amilose (poli-D-glucose, exclusivamente com ligações glicosídicas α-
(1�4) e da amilopectina mesma estrutura que o glicogênio, mas com menor número de 
ligações α-(1�6) ou ramificações), o glicogênio também se complexa com o iodo, embora 
o faça com menor intensidade que os dois componentes do amido antes citados. Como a 
reatividade com o iodo depende dos segmentos lineares com ligações α-(1�4) cada passo 
de hélice com 6 resíduos glucosil oclue um átomo de I2 e há formação de cor. 
A intensidade de reação com o iodo dá-se na seguinte ordem decrescente: 
AMILOSE>AMILOPECTINA>GLICOGÊNIO, e as cores formadas são respectivamente: 
AZUL INTENSO, VIOLÁCEO AVINHADO e CASTANHO. 
O tratamento destes polissacarídeos com α-amilases, específicas para a hidrólise das 
ligações glicosídicas α (1�4), suprime então esta reatividade frente ao iodo. 
 
Reativos: 
 
•••• Solução de glicogênio a 1 mg/mL. 
•••• Saliva (mistura de 2 ou 3 doadores) diluída 1:10 com solução de NaCl 5mM (fonte da 
α-amilase salivar). Preparar misturando 0,5 mL de saliva + 4,5 mL de NaCl 5 mM. 
•••• Reativo do iodo 
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•••• Técnica: 
 
Numerar 6 tubos e processar a incubação como especificado: 
 
Tubo 1 2 3 4 5 6 
Água destilada (mL) 0,4 0,3 0,3 0,1 0,2 -- 
Glicogênio 1mg/mL -- -- 0,1 0,3 0,1 0,3 
Saliva diluída 1:10 
com NaCl 5 mM 
-- 0,1 -- -- 0,1 0,1 
Coloração observada 
 
Incubar à temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos, agitando os tubos 
5 e 6 ocasionalmente. 
Adicionar a todos os tubos imediatamente após o tempo de incubação (começando pelos 
tubos 5 e 6) 1,6 mL do REATIVO DE IODO. Agitar bem. Proceder uma avaliação visual 
das cores. (No caso de determinação quantitativa, a leitura deve ser feita a 460 nm ou com 
filtro azul). 
Interpretar os resultados. 
 
Observações: 
 
1) A combinação das salivas de várias pessoas cobre o risco de alguma deficiência casual. 
A diluição da saliva apenas com cloreto de sódio, se justifica por ser o ânion Cl- um 
excelente ativador da amilase salivar. A presença de tampão é dispensável, pois a 
amilase salivar apresenta ampla faixa de pH ótimo (de 5 até 8) e a inclusão do habitual 
tampão fosfato pH 7,0 geraria uma incompatibilidade com a presença de cor (CaCl2). 
2) O tubo nº 2 atua com um segundo "branco" (controle da enzima), pois na coleta de 
saliva pós-prandial pode haver uma pequena contaminação de amido da dieta. 
3) As intensidades progressivamente crescentes de cor nos tubos 3 e 4 comprovam que 
esta técnica colorimétrica pode ser aplicada quantitativamente, isto é, há 
correspondência linear entre a concentração de glicogênio e a densidade ótica. A faixa 
de sensibilidade do método é da ordem de 60 a 750 microgramas de glicogênio/ensaio. 
4) Como a atividade amilásica é variável de indivíduo para indivíduo, com finalidade de se 
observar pelo menos no tubo nº 6, uma hidrólise PARCIAL do glicogênio (comparado 
com o tubo nº 4, hidrólise TOTAL), pode-se fazer uma variação de tempo de incubação 
(p.ex., desde 2 até 8 minutos). 
 
 
 
 
 
 
 
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