prática 9

Prévia do material em texto

Prática n° 9: Ação Enzimática – Influência da Temperatura 
A temperatura é um fator importante na atividade das enzimas. Dentro de certos limites, a velocidade de uma reação enzimática aumenta com o aumento da temperatura. Entretanto, a partir de uma determinada temperatura, a velocidade da reação diminui bruscamente.
O aumento de temperatura provoca maior agitação das moléculas e, portanto, maiores possibilidades de elas se chocarem para reagir. Porém, se for ultrapassada certa temperatura, a agitação das moléculas se torna tão intensa que as ligações que estabilizam a estrutura espacial da enzima se rompem e ela se desnatura.
Para cada tipo de enzima existe uma temperatura ótima, na qual a velocidade da reação é máxima, permitindo o maior número possível de colisões moleculares sem desnaturar a enzima. A maioria das enzimas humanas, têm sua temperatura ótima entre 35 e 40ºC, a faixa de temperatura normal do nosso corpo. Já bactéria que vivem em fontes de água quente têm enzimas cuja temperatura ótima fica ao redor de 70ºC.
1. OBJETIVO 
- Verificar a influência do fator temperatura na atividade da enzima. 
2. MATERIAL UTILIZADO 
- Vidraria: Becher, tubos de ensaio, pipetas, cubetas, tubos Folin-Wu . 
- Reagentes/soluções: Solução de sacarose 0,45 M em tampão de acetato 0,05 M, pH 4,7. 
Solução de enzima obtida por extração com NaCl de fermento biológico. 
Reagente do DNS (ácido 3,5 dinitro salicílico em meio alcalino). 
- Espectrofotômetro 
3. PROCEDIMENTOS 
Marcou-se 5 tubos Folin-Wu com as temperaturas a serem avaliadas (0°C, ambiente=25,5°C, 50°C e 100°C) e o branco. 
Em seguida adicionou-se e m cada tubo, exceto o branco, 0,5 mL do solução de sacarose 0,5 M e no branco 1,0 mL de água destilada. 
Em seguida, adicionou -se 0,5 mL da solução da enzima (exceto no branco) e, imediatamente, colocou-se os tubos nos respectivos banhos: 0°C – banho de gelo; Ambiente – 25°C; 50°C – banho térmico a 50°C; 100°C – água fervente por 10 minutos cada. 
Decorrente este período, retirou -se os tubos dos respectivos banhos, 
adicionou-se em cada tubo 1,0 mL do reagente d e DNS, inclusive no branco e aqueceu-se em banho-maria em ebulição por 5 minutos. 
Posteriormente, resfriou -se os tubos em água corrente, completou-se o volume para 12,5 mL com água destilada e homogeneizou-se. 
Em seguida, leu-se as absorbâncias das soluções em espectrofotômetro a 540 nm, tomando como referência o branco (0 mL da solução de sacarose 0,5M e 0 mL as solução de enzima). 
RESULTADOS
Curva padrão da glicose obtida na prática nº8.
Cálculo da concentração de produto formado e da velocidade da reação.
O modelo obtido para curva padrão de glicose, que é y = 1,1175x - 0,004
Para T = 0°C
ABS= 1,1175 Conc – 0,004
0,100 = 1,1175 Conc – 0,004
0,100 + 0,004 = 1,1175 Conc
Concentração = 0,09306 µmol/mL
v = 0,09306/ 10min = 0,009306µmol/mL.min
Para T = temperatura ambiente = 25 ºC
ABS= 1,1175 Conc – 0,004
0,732 = 1,1175 Conc – 0,004
0,732 + 0,004 = 1,1175 Conc
Concentração = 0,65861 µmol/mL
v = 0,65861 / 10min = 0,065861 µmol/mL.min
Para T = 50ºC
ABS= 16,095 Conc – 0,0042
0,950= 16,095 Conc – 0,0042
0,950 + 0,0042 = 16,095 Conc
Concentração = 0,85369µmol/mL
v = 0,85369/10 =0,085369µmol/mL.min
Para T = 100ºC
ABS= 16,095 Conc – 0,0042
0,150= 16,095 Conc – 0,0042
0,150 + 0,0042 = 16,095 Conc
Concentração =0,09754µmol/mL
v = 0,09754/10 = 0,009754µmol/Ml
Na tabela 1 encontra-se a temperatura avaliada e suas respectivas absorbâncias, produto formado e velocidade da reação. 
	Temperatuta °C
	Absorbância 
(540nm) 
	Produto formado (μmol/mL)
	Velocidade da Reação (μmol/mL.min)
	0
	0,1
	0,09306
	0,00931
	25
	0,732
	0,65861
	0,06586
	50
	0,95
	0,85369
	0,08537
	100
	0,105
	0,09754
	0,00975
Gráfico de velocidade de reação x Temperatura 
A partir dos resultados da tabela 1 tem-se o gráfico de velocidade de reação (μmol/mL.min) x Temperatura (°C) abaixo: 
Neste experimento, na temperatura de 0ºC a enzima sofre inativação pela baixa velocidade de reação conforme foi visto no gráfico. Em temperaturas acima de 50º C nota-se um decréscimo na velocidade. E isso ocorre pelo fato de que as enzimas estão sofrendo desnaturação térmica ocorrendo perda da atividade biológica das mesmas. Observa-se também que a temperatura ótima está entre 45 e 50ºC, é a temperatura na qual a enzima atinge sua atividade máxima, isto é, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade constante por um período de tempo. 
CONCLUSÕES 
Conclui-se que em relação á influência d a temperatura pode-se dizer que a velocidade d as reações enzimáticas aumenta com a temperatura. No entanto, isto só é verdade dentro de certos limites porque as enzimas, devido á sua natureza proteica, sofrem desnaturação a partir de uma determinada temperatura (elevada), sofrendo inativação a temperaturas baixas. No entanto a inativação em certos casos pode ser reversível, enquanto que a desnaturação como se baseia na quebra das ligações químicas entre os aminoácidos, já não é possível ser reversível.