Resumo bloco 1 Biotecnologia

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Aula 1 Biotecnologia 
Biologia, Engenharia e Química
Para entender a função de uma molécula biológica, temos que entender a estrutura dela. Assim como conhecer a sequência e entender o que ela quer dizer pra gente.
Ligação fosfodiester = fosfato na porção 5’ com hidroxila na posição 3’ formam as cadeias de nucleotídeos.
Por que DNA guarda nossas informações genéticas?
Estabilidade é a principal característica que fez ser o DNA e não o RNA porque o último é degradado em meio alcalino, Capacidade de conservação (mecanismo de reparo e etc),
Por que então pontes de hidrogênio?
Porque se fossem mais resistentes, não seriam desfeitas para soltar as fitas. E são facilmente refeitas. 
A fita da direita é diferente da esquerda, carregando informações diferentes. Porém, uma consegue ser molde pra outro. A vantagem disso é que armazenamos mais informações em menor espaço.
Replicação de DNA: A cópia gerada deve ser exatamente igual a cópia anterior, por isso, a fita nova a ser formada é sempre feita em relação ao molde preexistente. Por que? Pois, se não houvesse um molde a chance de erro seria muito maior. Cada nucleotídeo novo será sempre incorporado na porção 3’ da fita, por isso a síntese de DNA sempre irá acontecer de 5’ a 3’ em relação a fita nova que está sendo formada. Isto porque a síntese sempre começa pela hidroxila livre da fita molde (na região 3’). A DNA polimerase interpreta e seleciona qual o próximo nucleotídeo a ser inserido na nova fita. Para isso, é necessário desfazer as ligações de hidrogênio e tornar acessível o código de bases da fita de DNA que está sendo copiada e isso é feito pela DNA helicase. 
A região fita simples do DNA pode acontecer autopareamento e se isso acontecer, a polimerase irá interromper a síntese ao perceber este erro ou ela pode contiuar a síntese perdendo essa região que estava autopareada.
A RNA primase colocará uma sequência de RNA no inicio da fita com a função da polimerase reconhecer a hidroxila livre e iniciar a síntese.
Conforme a helicase vai abrindo, percebemos uma tensão de torção sendo formada e por isso, temos a DNA topoisomerase que conforme a tensão começa a ficar crítica, ela desfaz as regiões torcidas. Para isso, ela acompanha a helicase ao longo da fita. Desse modo, ela impede que a fita quebre e inutilize o DNA.
Céllas que tem alta taxa de replicação dependem muito desse processo. Essas são ferramentas que garantem a fidelidade da célula. Além dessas proteínas, temos maquinaria de reparo de erros na replicação de DNA, os quais são diversos.
Uma vez replicado, nosso DNA será associado à proteínas (as histonas) em estado de enovelamento, sendo estabilizado. O DNA enovelado não está com a informação acessível
Segundo nível:
Produção de RNA a partir do molde de DNA é a transcrição. Produzimos o RNA msg, mantemos ele estável e quando se torna necessário a produção da proteína, ele é traduzido. A RNA polimerase age exatamente igual a polimerase de DNA, também inicia a síntese da ponta 3’. Os vários tipos de RNA que a gente produz são produzidos por diferentes RNAs polimerases.
Como ela sabe da onde ela tem que começar a sintetizar a RNA mensageiro? 
Quem vai recrutar a RNA polimerase é um fator sigma que reconhece a região e recruta. Em procariotos, o fator sigma é uma região “acoplada” a polimerase. Já nos eucariotos, esses são os fatores de transcrição e são independentes à polimerase. Cada espécie de bactéria tem seu conjunto de fator sigma. Existe uma aplicação tecnológica por trás disso.
Os fatores transcrição são especializados em reconhecer as regiões promotoras dos genes (sempre a upstream dos genes). A região promotora são regiões de regulação proximal do gene, mas também temos uma região reguladora distal, que mesmo distantes podem estar próximos devido ao enovelamento. Eles podem ser pró transcrição ou não.
Uma vez que temos o RNAm produzido, queremos transforma-lo em proteína. Em procariotos, podemos ter RNAm policistrônicos e em eucariotos, temos os monocistrônicos. Em eucariotos, nós temos as modificações pós-transcricionais (como a cauda poli A) até pra marcar aqueles que podem sair do núcleo. As sequências de reconhecimento interno dos ribossomos é que define onde deverá estar o RNAm.
Os genes de eucariotos são organizados em éxons e íntrons. Sendo os éxons são regiões que codificam proteínas e os íntrons as que não codificam, porém isso não é bem assim... Pois tais regiões não são sempre assim. Aquilo que chamamos de éxons em uma célula, não é éxon para outra.
RNAm = Aquele que já tá livre de íntrons. Para isso, necessitamos do complexo de splicing.Em tecidos diferentes, teremos conjunto de fatores de splicing diferentes. Isso é importante porque basta ter uma mutação em um desses genes para termos isoformas anti-splicing diferentes. 
O gene é igual – O pré-RNAm é igual – O RNAm maduro é diferente – A proteína é diferente
O que faz isso acontecer? O silenciamento epigenético de genes e cada tipo e célula tem um padrão epigenético diferente.
O RNA tem que passar por todo processamento, além de ter que sair do núcleo e para isso depende dos ribossomos. Todo RNAm que chega no citoplasma é passível de ser traduzido.
Quem faz reconhecimento dos códons é o RNA t que tem o sítio de reconhecimento dos códons que é o anti-códon. Todo aminócido tem ponta carboxiterminal e ... 
Ribossomo tem duas subunidades, a que reconhece o RNAm a ser traduzido e uma onde se liga o RNA t. A leitura é feita sempre de três em três (códons) até que o ribossomo encontre a sequência de parada e então, o fator de liberação de proteína irá se associar. Assim, ocorrerá a liberação da proteína e o ribossomo se soltará do RNA. 
E agora? A proteína será funcional? 
A conformação secundária, terciária e quartenária dela também deverá estar correta. Não basta a estrutura primária estar. Para isso, temos as chaperonas que irão auxiliar nisso. Isso é importante porque muitas vezes pegaremos informações de uma proteína de uma espécie para outra, pois por ex. uma bactéria é capaz de traduzir uma proteína humana, mas não necessariamente fará as conformações secundárias/terciárias necessárias. 
Se isso ocorrer, como posso garantir que esta proteína terá função biológica?
Isso depende das modificações pós-traducionais
Controle de expressão genica:
Os controles são feitos pelo reconhecimento das regiões promotoras. Dois elementos como acessibilidade e modificações.
O padrão de modificação epigenética não é passado entre as gerações das células germinativas, apenas às células somáticas. Pois essas modificações dependem da exposição ambiental a determinados fatores. As modificações epigenéticas são um alvo da biotecnologia.
Aula 2
Tecnicas de análise e manipulação de ácidos nucléicos
Temos que olhar as técnicas básicas que dão suporte a técnica de clonagem que é o PCR e o sequenciamento. O PCR para fins de biotecnologia tem algumas peculiaridades que temos que aprender, assim como o sequenciamento. PCR é uma técnica enzimática regida por uma equação, o produto é regido pela quantidade de substrato multiplicado pelo fator de eficiência elevado pela quantidade de vezes que a reação vai se repetir. Nada mais é que a replicação de DNA. É uma reação de amplificação tão boa porque cada vez que eu formo esse produto, a cada ciclo tenho um crescimento catalítico dos DNA a serem formados em crescimento logaritimico, na verdade. 
O que eu tenho que ter no meio pra sintetizar DNA:
- Desoxiribonucleotideos
- Primers (Precisamos de uma hidroxila livre no nucleotídeo a ser anelado para iniciar a síntese. Por que temos que ter dois primers? Porque as duas fitas tem sentidos opostos e queremos amplificar as duas)
- Enzima
- Template inicial
- Tampão reacional (em geral tem a presença de Mg, a fim de favorecer a reação da polimerase com a fita de DNA – não pode colocar muito para não se ligar inespecificamente e nem pouco para não ligar)
O grande poder dessa técnica: é uma amplificadora de massa de DNA, ou seja partindo de uma massa muito pequenaencontro uma massa muito maior. Permitindo que análises sejam mais eficientes, facilitando a manipulação desse DNA.
Dividida em 3 fases: exponencial – máxima de eficencia acontecendo, linear – onde ainda está com alguma eficiência, mas aos poucos chegam a fase de platô – ponto mais alto quando estagna a quantidade de massa gerada no máximo de massa possível.
PCRrt é uma técnica de quantificação, diferente da PCR. Essa técnica não tem grande aplicação pra P&D, mas em diagnóstico sim. Na indústria, pode ser usada para fins regulatórios a fim de identificar a transgênese e assegurar se estão de fato vendendo o que dizem.
Enzima tem duas características: fidelidade e processividade, sendo a fidelidade a mais importante para assegurar que a cópia será igual ao molde. Por isso, utilizaremos enzimas de alta fidelidade. Por que a natureza não se preocupa muito com a fidelidade? Porque tem outros mecanismos de detecção de erro e reparo de erro, porém nós não temos isso quando fazemos nossa reação de PCR. Como tornar a enzima mais fiel? Alterando a estrutura da mesma.
Primeiramente, o molde tem que ser separado pela DNA helicase. No PCR usamos o calor para tal e por isso a enzima que utilizamos é termoresistente. Temos o molde (senso) e a fita a ser gerada (antisenso).
Lá na máquina o que acontece é que a gente tem a variação de temperatura entre as etapas da reação. Então, a 90-98 graus nenhuma ponte de hidrogênio permanece mas também nenhuma ligação de primer faz isso. Destacando que quanto menor a sequência de DNA, mais lábil o é no ponto de vista da temperatura. Além de que se o primer for rico em C e G, será mais resistente a temperatura. É necessário uma temperatura adequada para a ligação dos primers e não autopareamento entre as fitas de DNA.
Então, cada ciclo da minha reação de PCR é composto por essas três etapas aqui: Desnaturação do DNA, anelamento do primer e extensão do primer
O PCR é amplificação de DNA. Onde eu posso achar informação codificante de proteína de um procarioto? O RNAm é exatamente igual ao DNA. Em eucariotos, teria que ser o RNAm maduro (pós-processado) é a única fonte possível dessa informação. Porém, não posso usa-lo como molde para uma reação de PCR. Por isso, utilizamos transcriptase reversa para converter o RNAm em cDNA para usa-lo. A transcriptase é como uma polimerase, por isso ela também precisará de um primer. Mas qual tipo de primer? Se eu uso primer específico, eu vou converter apenas RNAm específicos. Porém, há um problema disso para nossa reação porque precisaríamos de muito. Podemos também utilizar primers randômicos, porém ele iria sintetizar em qualquer parte da nossa sequencia de interesse.
Qual a melhor opção? Para apenas clonar o RNAm maduro devemos usar primer oligo dT, o qual se liga a cauda poliA (modificação feita no RNAm maduro para faze-lo sair do núcleo). Assim, a sua transcriptase reversa só vai produzir DNAs referentes a RNAm maduros.
Como avaliar se a reação funcionou ou não? Gel de agarose para eletroforese . Dependendo da concentração de agarose utilizada, posso ter uma malha mais estreita ou menos estreita. Assim, varia o tamanho que pode atravessar a malha. Assim, você utilizando um padrão de peso molecular identifica o peso de interesse em uma banda única. Dependendo de quão bem a sua reação de PCR esteja funcionando, o seu primer pode anelar onde você não deseja e formar outros fragmentos. Então, eu seleciono a banda de interesse, mas como saber se ela foi replicada corretamente? Sequenciamento.
Sequenciamento pelo método de Sanger:
A gente vai usar a característica estrutural de que pra produzir DNA temos que ter um nucleotídeo anelado com uma hidroxila livre. Os dideoxinucleotideos podem ser incorporados à fita, porém a fita para ali de extender. Sabendo disso, pegando 4 tubos (1 pra cada nucleotídeo) e em cada um deles adiciono um dideoxinucleotideo diferente juntamente com tudo que preciso para seguir a reação. Assim, toda vez que eu tiver que incorporar um “A” a enzima poderá pegar um nucleotídeo “normal” ou pegar um dideoxinucleotideo de “A” quase com 50% de chance para cada. No fim, terei um número X de fragmentos igual a quantidade de A eu tenho na minha sequência. Fazendo isso, para cada um dos nucleotídeos e então, correndo um gel verei um perfil onde a menor banda é referente ao primeiro ponto de parada na fita e assim consequentemente. Dessa forma, através do gel desses fragmentos determino a sequência final. 
Se eu tenho um nucleotídeo que não tem a hidroxila, ele vai ser incorporado na síntese mas não permitirá a adição do próximo nucleotídeo.
Eu preciso de um primer conhecido para isso? Não. 
Hoje em dia, utilizamos o método de sequenciamento automático de Sanger. Cada dideoxinucleotideo é marcado com uma fluorescência diferente e a reação então poderá acontecer no mesmo tubo. Assim, cada fragmento gerado terá uma cor associada a ele. O aparelho vai correr esses fragmentos em uma eletroforese capilar e com um laser, vai identificar cada cor do meu fragmento e em um gráfico de picos, poderemos observar a fluorescência que o aparelho identificou e chegamos a nossa sequência final. A grande vantagem é que o tamanho da sequência que o método de sanger pode sequenciar é bem maior quando comparada aos métodos mais modernos.
Clonagem molecular: 
Esse processo é a base para a expressão de proteína recombinante, ela permite a inserção de fragmentos de DNA em moléculas de vetores (utilizamos plasmídeos – DNA circular extra cromossomial em geral encontrado em bactéria). Assim, a gente pode por ex. propagar essa informação ao colocar esse vetor dentro de uma bactéria e ela começará a replicar esse plasmídeo replicando também a tua informação de interesse. A chance de termos um erro na replicação dentro de uma bactéria é menor porque a mesma tem mecanismos de reparo. 
Qual a ideia de produzir proteína recombinante? Você pega uma proteína de interesse de uma célula e colocamos em outra célula a informação necessária para que ela produza a sua proteína de interesse. O vetor funciona como armazenamento.
A gente utiizará gene de resistência a antibiótico (ampicilina ou canabicina) para identificar qual célula teve o plasmídeo inserido e qual não. Podemos também fazer seleção metabólica, como colocar em um meio sem determinado aminoácido que sua levedura não pode produzir sozinha e só passará a produzir e sobreviver uma vez que o plasmídeo esteja inserido nela.
Temos que ter uma região chamada de ORI (origem de replicação) que será reconhecida pela célula para ser replicada; gene que permite selecionar as células com plasmídeo e sem plasmídeo (resistência a antibiótico ou seleção metabólica); região múltipla de clonagem ou poliLinker que é composta por várias sequências de DNA que são alvo da ação de enzimas de restrição (cortamos nosso vetor com uma ou mais de uma enzima de restrição de forma a abrir nosso vetor e teremos pontas que reconhecem o meu inserto, gerando a minha molécula híbrida de DNA, a qual é parte vetor, parte inserto). Cada enzima tem um sitio de reconhecimento, as pontas geradas por ela são exatamente iguais. Se a gente cortar o vetor com a mesma enzima, teremos pontas iguais e as mesmas podem interagir por anelamento e uma vez que elas interajam, elas podem fazer pontes de hidrogênio. O inserto se liga inicialmente nessa ponta por pontes de hidrogênio que são ligações fracas e a DNA ligase irá fazer a ligação mais forte. Existem tipos de pontas diferentes formados pelas enzimas de restrição: Em geral, utilizaremos as que formam pontas coesivas e não pontas cegas. Cada enzima é derivada de uma espécie de bactéria. Por que o DNA da bactéria não é cortado pela enzima e para que elas existem? Mecanismo de defesa das bactérias contra vírus. E todos os sítios de EcoRI no DNA da Ecoli é metilado e por isso, a enzima não corta o DNA da bactéria.
A clonagem é direcional, pois as não direcionais são um problema pra gente, pois não podemos lidar com as variações causadas por isso. Assim, precisamos fazer clonagemdirecional e por isso, devemos usar mais de uma enzima, o que elimina o problema de autoligaçao do vetor e da direcionalidade. De qualquer forma, há uma estratégia: Como fazemos pra impedir a ligação fosfodiester entre as pontas quando cortados por uma enzima só? Tratamos eles com fosfatase porque precisamos de uma hidroxila e um fosfato para ocorrer.
A questão é: Como que eu faço para promover essa direcionalidade? Necessariamente tenho que usar duas enzimas diferentes que vão orientar essas ligações para ocorrer com o vetor.
Como coloco os sítios de restrição nas pontas do meu produto de PCR? Não posso usar nenhum sitio de restrição natural da sequência porque se não esta será cortada e perderá parte da informação. Para isso, os primers de clonagem são sempre compostos por duas regiões diferentes: uma é a que anela especificamente no alvo que desejo produzir o inserto clonar e deve conter na sua região 5’ o sítio da enzima de restrição SEMPRE a cinco linha da sequencia específica porque preciso da 3’ livre para o anelamento (senso) e no primer anti-senso temos o outro sítio de restrição.
O primer anela a sua parte específica e o sítio da enzima e sobra uma perninha com o sítio da enzima.
Como eu escolho qual sítio vou utilizar? Não pode estar contido no meio da minha sequencia e os vetores tem seu conjunto de sítios de restrição então tem que ser uma enzima que corta o vetor e não corta sua sequencia. 
Faço o PCR – Gerei o Inserto – Digiro com as enzimas – Insiro no plasmídeo
Qual o grande problema? Como é a superfície da membrana da bactéria? Tem fosfolipideo e a cabeça deles é negativa e a superfície é negativa. Como formar a bactéria passiva de receber DNA exógeno? Neutralizar a carga da superfície da bacteria com ion divalentee utilizar ela em um estágio que não tenha a superfície completamente formada – parede imatura - (fase que isso acontece: log – proliferando loucamente). Após fazer isso, chamamos essas bactérias de competentes que estão passivas de receber o DNA exógeno. Para fazer entrar, posso induzir a formação de microporos transientes com por exemplo choque térmico, se por acaso tiver uma molécula de DNA no momento da formação do poro, ele vai acabar entrando. O que me interessa é que a bactéria receba o plasmídeo e então, a gente pode expandir essa bactéria. Horas depois teremos colônias de bactérias transformadas, porém nem todas terão sofrido o processo corretamente. Poderá ocorrer a formação de duplex de plasmídeo ou a enzima só cortar um lado.
Cada uma das colônias a gente vai pegar, crescer em meio líquido e extrair DNA plasmídeo. Para identificação, posso digerir ele com as mesmas enzimas e correr gel fazendo análise de migração ou por digestão, fazer uma PCR e ver se vai amplificar. Através da análise do gel, perceberemos que o resultado pode ser bem sugestivo. Ou se for rico, poderá fazer sequenciamento de todos os plasmídeos. Em programas como BLAST, você ao entrar a sequencia que você obteve e compara para ver se a sequência está correta. 
Após isso,uma vez que eu identifiquei que o plasmídeo correto, tenho que transformar uma cepa de bactérias produtoras (a de clonagem normalmente não é boa produtora) que tem como característica de serem “humanizadas”. É mais fácil transformar bactérias gram negativas.
PCR de mutagênese sítio dirigida:
Se eu sei que trocar uma serina por uma cisteína melhora muito minha proteína e para isso, preciso trocar um “A” por um “T”. Temos que ter primers mutantes que flanqueiam a região da mutagênese e tem nucleotídeo de mutação bem no meio do primer. Esse nucleotídeo não irá anelar no outro, mas todo o restante ligará. Então, quando a polimerase vier, ela vai polimerizar e formar a mutação desejada. No fim do PCR, teremos uma grande população mutada e uma pequena população não mutada do molde inicial.
Extensão de fragmentos sobrepostos: Duas reações de PCR, na primeira farei com o senso selvagem e o anti-senso mutante. A outra será o senso mutante com o anti-senso selvagem. Se eu pegar os dois tubos e desnaturar, uma fita anelará com a outra e produto final será a fita mutada desejada resultado da sobreposição das fitas mutadas.
Aula 3
Cultivo de células animais e produção de biofármacos:
É uma plataforma de produção, tal como microrganismos. A produção de biomassa por microrganismo é mais rápida porque nenhuma célula animal consegue se comparar à capacidade produtora de um microrganismo. Os microrganismos são mais baratos e a maioria das bactérias não faz modificação pós-transcricional como eucariotos, como glicosilação (algumas até fazem, mas são muito produtivos). Se a tua proteína depende de glicosilação para atividade biológica, não dá pra fazer em bactéria. E os fungos? Eles fazem algumas modificações pós-transcricionais, mas não como o padrão dos eucariotos. Qual a vantagem de produzir algo em animais ou plantas transgênicos? Quanto mais complexo o organismo, mais parecido com o padrão humano. Os padrões de glicosilação são mais semelhantes com o humano. Qual o know-how necessário para manter animais/plantas transgênicas? A mao de obra e estrutura física para manter os animais e plantas transgênicas no geral não é caro e não necessita de mão de obra especializada para cuidar disso, como em cultura de células. A grande desvantagem disso é que o custo de processo de desenvolvimento dessas plataformas é mais alto, o nível de conhecimento e a qualificação das pessoas que desenvolvem isso é mais alto. Nesse caso, eles fazem as modificações pós-transcricionais. 
A cultura de célula é um meio termo entre microrganismos e transgênicos. Apesar do custo em relação aos microrganismos ser diferente, o processo é muito parecido e as tecnologias utilizadas (ex. biorreator) são semelhantes, o que simplifica o processo. Diferentes tipos de proteínas podem ser produzidos nessa plataforma. Independente do tipo de proteína produzido, existe a predominância de uma célula como a CHO. Se a a gente pode usar o mesmo tipo celular para produzir diferentes proteínas recombinantes, eu não preciso de um conhecimento muito específico para cada tipo de proteína. A tendência do mercado é olhar CCA como uma plataforma eficiente de produção. A parte mais cara do processo de desenvolvimento pode ser aproveitada várias vezes (é a mesma célula e a engenharia por trás é semelhante) e o processo de produção é mais simples, dentro disso a parte que seria mais cara seria a purificação. As duas plataformas de produção de vacinas por ex. é a célula vero e o ovo embrionado e ainda após a purificação, há pessoas que sofrem reações alérgicas em vacinas produzidas por ovo. Mas em CCA com proteínas recombinantes, isso não é visto.
Aplicações de CCA:
- Produção de biofármacos
- Ferramentas de pesquisa e desenvolvimento (comprovar a farmacodinâmica e toxicologia – diminuindo a quantidade de animais utilizados em testes clínicos)
- Terapia celular (não apenas como unidade produtora e sim como produto desejado)
Bioprinting de rim e de bexiga já é possível. Podemos fazer o molde já com a célula certa no lugar certo.
O que preciso prover para minha célula para mantê-la ex-vivo: Nutrição adequada, controle de características físico-químicas (pH, temperatura, concentração de gases – CO2 é o mais predominante nos nossos tecidos), necessidade de superfície de adesão (dependerá se sua célula é de um órgão sólido ou não, se sim é necessário ter uma superfície).
Serão sempre cultivos submersos com meios de cultura mais complexos que de microrganismos, pH, temperatura e gases controlados. Esses controles são mais fáceis em pequena escala, no entanto, em um biorreator isso é mais complexo. Pois, é necessário algo totalmente homogêneo sem microambientes no interior do biorreator. Todos esses parâmetros e refinamentos são necessário ser atentar, porém é costume 37° a 5% de CO2. Quanto aos meios de cultura, os macronutrientes são praticamente iguais (glicose, aminoácidos essenciais pra célula, vitaminas as quais são fatores para vias enzimáticas, sistema de sais que tamponae provê micronutrientes minerais e etc), o que muda é principalmente os micronutrientes. Em escala laboratorial, há outros componentes que utilizamos como: indicador de pH e antibiótico (penicilina estreptomicina), SFB (possui fatores de crescimento importantes para a célula, o que torna o meio de composição indefinida e por isso, não pode usar industrialmente porque em escala industrial é necessário um meio definido). Já que não vai usar SFB, temos que fornecer os fatores de crescimento necessários para a célula especificamente, os quais são proteínas recombinantes também. Outro problema do SFB é a necessidade de sacrificar muitos animais e justamente pelos animais serem diferentes, cada lote há uma variabilidade devido a isto há risco de diminuição da produtividade a cada lote e os mesmos são passíveis a contaminação priônica por exemplo. Além disso, como o SFB é rico em proteínas, os processos de purificação tornam-se mais custosos e há toda a questão ética relacionada a manipulação de animais. O soro de origem fetal supre necessidade de células de diferentes folhetos embrionárias, mas ao mesmo tempo possui produtos de excreção do metabolismo do animal, contaminação de insumos utilizados na mãe (fatores de estimulação e antibióticos). Vale destacar que o soro é inativado justamente para remover as moléculas com potenciais imunogênicos. Antibióticos também não são utilizados industrialmente, pois no ponto de vista biológico, pode-se ocorrer aumento da resistência a eles (a purificação retira, mas pode-se contaminar o meio ambiente). Além de que pode ocorrer processos alérgicos em pessoas alérgicas, ainda que haja a purificação quase 100%. Porém, isso pode prejudicar a empresa. 
Devemos manipular esses materiais em ambientes preferencialmente estéreis, porém no mínimo assépticos (baixo nível de contaminantes). Dependendo do tipo de manipulação que vá se fazer, os níveis são diferentes de proteção em câmaras de fluxo laminar, sendo a classe III para manipulação de nível de segurança 4 (patógenos fatais para humanos). O fluxo laminar promove a assepsia necessária e os utensílios utilizados são no geral esterilizados por calor úmido no lab. e na indústria é tudo descartável e esterilizado por luz ionizante. No entanto, o biorreator não pode ser “descartável” e isso é um problema para a esterilização. Como esteriliza fatores de crescimento, os quais são termosensíveis? Deve-se filtrar por membrana. Um problema sério é que poros >0.22 permitem a passagem de vírus e micoplasmas. Na realidade, tecnicamente, essa esterilização não é esterilização. Na indústria, você compra o meio já previamente esterilizado (radiação e filtração) e ao adicionar ao biorreator, filtramos novamente. 
Obtenção das células animais que vamos utilizar ex-vivo: Tecido animal dessecado que passa por digestão enzimática, produção de explants e migração da célula e também tem-se a cultura de órgão em um sistema que mimetize as condições normais dentro do animal. Este tipo de cultura pode ser importante para controle de qualidade e ensaios toxicológicos que excluem o uso do animal. Hoje em dia, temos o cultivo organotípico, o qual se trata de co-culturas de células diferentes mimetizando o órgão original.
Utilizamos células que são linhagens contínuas, pois não possuem um perfil de senescência e morrem. Temos as culturas transformadas que são células que derivam de células tumorais, as células estabelecidas que tem um perfil semelhante à célula normal, porém após o momento de crise elas retomam com o surgimento de células imortais e continuam como células contínuas. É preferível o uso de células estabelecidas em relação à células normais ou transformadas porque com o tempo uma linhagem tumoral ter mais em mais mutações e ao longo do tempo ela pode acabar perdendo a informação nela inserida devido a isso, além disso, há uma maior instabilidade genômica em células tumorais. Duas características importantes para considerar em escala industrial: a adesão (células em suspensão são mais fáceis de serem mantidas e em células estabelecidas é possível adapta-las para tal). A manutenção das células em suspensão é mais fácil, trata-se basicamente de uma diluição e isso permite uma automatização bem mais fácil. Como usar célula aderente em sistema de suspensão? Podemos usar micropartículas em suspensão que servirão como área para adesão das células. As células que proliferam muito rapidamente preferem o metabolismo anaeróbico fazendo mais glicólise. Elas tem duas fontes de energia disponíveis: glutamato e glicose. Teremos processo de produção ou de batelada alimentada ou contínuo, devido a necessidade de troca do meio por causa da presença de metabólitos. 
Quanto as células aderentes, se ficarem em alta densidade por muito tempo, ela pode ser modificada e a identidade pode ser perdida. Por isso, em escala industrial, há salas de inoculação onde o inóculo é mantido garantindo a permanência da identidade da sua célula com a geração adequada. Quanto mais tempo em cultura, mais mutações ela tem e menos ela se parece com a sua característica inicial. Uma estratégia para preservar isso, utilizamos técnicas de criopreservação (manutenção em baixas temperaturas). Deve-se utilizar reagentes crioprotetores, os quais diminuem o estresse osmótico e geram cristais amorfos (DMSO – tóxico, rápida difusão pela membrana ~entre 5 e 10%, glicerol –difusão lenta pelas membranas, baixa toxicidade e estabilizante de proteínas) impedindo a morte celular pela formação de cristais no interior. Ideal é congelamento lento. A temperatura deve ser abaixo de -40°C para ter a nucleação completa da água. A estratégia na indústria é manter lotes sementes de onde derivam os lotes de trabalho, realizado pelo controle de inóculo. O mesmo lote de trabalho pode ser usado por anos a fio e a característica e identidade da célula é mantida. Pode ser realizado a criopreservação em freezer – 80° ou tanque de N2 liquido.
Como fazer o escalonamento do processo produtivo no cultivo de células? Devo aumentar gradualmente os recipientes onde as células são mantidas desde um frasco estacionário até o biorreator de produção. Fatores a serem pensados: A célula depende de meios complexos estéreis, células são sensíveis à tensão de cisalhamento e especialmente, a dificuldade de manter a homogeneidade de temperatura, pH e gases.
Tipos de biorreatores a serem utilizados: Tanque agitado, air-lift – homogeneação por borbulha de gás-, ondas (homogêneos) e leito empacotado, fluidizado e de fibras ocas – células aderidas na parte externa (heterogêneos). Utiliza-se mais biorreatores homogêneos. Em escala de bancada, temos aquele modelo de uma bolsa sob uma gangorra agitadora (biorreator de ondas), é bem prático não tendo tempo morto de limpeza entre as trocas.
Quanto aos modos de operação, temos:
Predominantemente, o modo de perfusão, onde a entrada e saída de meio é a mesma faixa. Em processos mais antigos, temos a batelada alimentada, onde a entrada ocorre e em outro momento a saída, como em partes.
A perfusão é um método bem mais efetivo, pois a concentração de célula é consideravelmente maior pois o meio não é esgotado como a batelada. Quanto ao volume de operação, os biorreatores de bateladas suportam volumes maiores, mas a produtividade volumétrica do contínuo (perfusão) é bem maior mesmo em menor volume. 
Podemos produzir um monte de proteínas diferentes com o mesmo tipo de célula recombinante (pois tema informação da proteína). As células mais utilizadas são as mais estáveis. As que fazem expressão estável é o ideal porque mantem a informação estável por mais tempo em relação à expressão transiente. A BHK e CHO possuem os dois tipos de expressão, sendo passíveis a serem feitas os dois tipos de modificações .
O processo de produção de biofármacos pode ser dividido em quatro grande estágios:
- Desenvolvimento da linhagem celular, o qual inclui a clonagem e expressão do gene de interesse, tal como a seleção do clone mais adequado. 
- Cultivo celular, ou seja, formulação do meio decultivo e determinação do biorreator e o modo de operação (predominantemente engenheiros de bioprocessos)
- Purificação, o qual é a determinação das técnicas a serem empregadas e a rotina, número de etapas e maximização do rendimento e grau de pureza.
- Formulação e envase, a qual se determina os adjuvantes e as formas de administração, pois cada vez mais estamos tentando utilizar outras rotas de administração dos produtos biológicos
- Burocracia, permeia todas as fases e consiste no registro dos dados e controle de matérias primas e produtos. Trata-se mais dos assuntos regulatórios
ETAPA 1:
No que tange a esta etapa, temos a etapa de clonagem. Temos que identificar com a célula produz a proteína de interesse, extrair o RNA dessa célula, produzir o cDNA (não tem mais processamento depois) e fazer a etapa de clonagem para permitir a expressão da proteína de interesse. Essa informação tem que ser inserida em um vetor de expressão, o qual necessita de alguns fatores: a região promotora, o componente eucariótico, marcador de seleção eucariótico e o componente procariótico. Nos modelos de expressão transientes, pode usar as técnicas de transfecção do plasmídeo fazendo o delivery de um ácido nucleico utilizando reagentes micelares (micela lipofílica com o dna dentro) ou outras moléculas como agregados com o dna dentro também lipofílicas. Essa informação é transiente porque a célula animal não consegue replicar plasmídeo, não temos a maquinaria necessária. A medida que as gerações se avançam, você dilui a presença dessa sua informação até perde-la.
Por isso que em níveis industriais, optamos por métodos que estabilizam a informação gênica ao integrar essa informação no genoma da célula e assim, quando ela replicar ela replicará o genoma inteiro incluindo a tua informação. Utiliza-se vetores integrativos que fazemos o delivery deles em geral por vírus que são produzidos carregando o vetor no seu genoma viral modificado com a sua informação inserida e uma vez que ele entra dentro da usa célula, ele consegue integra-lo ao genoma da sua célula. Ao integrar, você consegue estabilizar a sua informação. (PROTOCOLO DE ESTABILIZAÇÃO – mantida ao longo das gerações). Isso não é perfeito, pois pode acontecer o silenciamento epigenético daquela informação para a expressão da sua proteína de interesse.
A expressão transiente é utilizada em escala de bancada, a qual dura no máximo 16h-96h devido a perda de expressão ao longo das gerações, necessita de grandes quantidades de plasmídeos e tem baixo nível de expressão. É mais em etapa de teste da sua proteína, pois os protocolos de estabilização não valeriam a pena. O desenvolvimento da linhagem estabilizada demora porque você tem que produzir, caracterizar e validar a sua linhagem (6-12 meses), porém possui alto nível de expressão e alto custo. Por isso, é interessante fazer isso uma vez só.
Classes de biofármacos produzidos: Proteínas de uso terapêutico.
- Interferon beta e y: Ambos possuem diversas glicosilações necessárias para a sua atividade biológica. Estes são produzidos em célula em CHOr em biorreatores com microcarreadores. O que interessa pra gente é que a atividade biológica seja mantida, não necessariamente precisa ser o perfil de glicosilação exatamente igual, mas sim que mantenha a atividade biológica. Cada tipo celular é passível a produzir padrões de glicosilação diferentes.
O controle de qualidade é complexo porque ele não pode ser puramente químico e sim deve se atentar as atividades biológicas, ou seja, CQ biológico. Pode ocorrer diferenças entre os fornecedores, mas não acontece tanta entre lotes.
- Eritropoetina é o mesmo. Dependem da glicosilação para sua atividade biológica.
- Fatores de coagulação sanguínea.
Aula 4:
Produção biotecnológica de anticorpos e vacinas
Duas classes muito importantes para a indústria de tecnologia farmacêutica, as quais são os anticorpos monoclonais e as vacinas recombinantes. Os anticorpos monoclonais dominam o mercado. As vacinas recombinantes tem baixa movimentação financeira porque estão incluídas em programas de política de financiamento do governo. No ponto de vista de abrangência e utilização, as vacinas recombinantes são muito mais abrangentes e importantes.
Como é a biologia do sistema imune e a produção de anticorpos in vivo?
A produção de anticorpo é gerada basicamente em 3 segmentos de gene (V,D e I). A estrutura de anticorpo pode ser dividida em duas porções: A fração constante e a variável (a que de fato faz contato com diferentes epítopos de cada antígeno) e também é composta de 4 cadeias de peptídeos: duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. 
Existe um processo que ocorre que é a mutação DTJ (hipermutação somática), conferindo uma maior variabilidade ainda. Assim, cada linfócito B tem um conjunto de informação que é único. Assim, mesmo que nunca tenhamos tido contato com determinado antígeno, é possível que tenhamos uma célula capaz de produzir anticorpo para o mesmo. A partir do momento que temos uma célula B encontrando o seu antígeno, temos a ativação dessa célula (3-4 dias) e isso é a expansão clonal da célula B formando vários clones, ou seja, com o mesmo padrão da original. E então, elas passam por um processo de diferenciação celular e formarão os plasmócitos que são de fato a célula responsável por produzir os anticorpos.
Qual o grande problema dos plasmócitos? Como é altamente diferenciado, ele não tem mais capacidade proliferativa mais. 
No ponto de vista biológico, não é interessante termos uma resposta assim, pois o processo é ao acaso. Então, pode ser que você gere o anticorpo que consiga reconhecer o antígeno, mas ele não é melhor. Por isso, se esquematizou a resposta policlonal, onde vários linfócitos são ativados por um mesmo antígeno e então, diferentes anticorpos serão gerados para diferentes epítopos do Ag. Uma resposta policlonal é melhor pra gente do que uma monoclonal (todos os anticorpos derivam de um mesmo linfócito B possuindo as mesmas características biológicas).
É melhor trabalhar com um anticorpo monoclonal ao invés de um policlonal, pois a regulamentação é mais simples, já que cada anticorpo da resposta policlonal é um fármaco diferente e quanto mais anticorpo tem, mais difícil o controle de reações adversas e outros parâmetros. Em uma situação é melhor usar uma mistura de anticorpos que é quando não sabemos qual antígeno está desafiando aquele organismo, como em antissoro contra veneno de animal. Um outro problema do ponto de vista farmacêutico que torna delicado o uso de anticorpos policlonais: Pode chegar um momento em que o indivíduo não responde mais ao mesmo. Duas eras na produção de anticorpos monoclonais: 1. Era da administração de soro 2. Anticorpos recombinantes. Atualmente na clínica não usamos mais anticorpos feitos por hibridoma
Tipos de mecanismo de ação mediados por anticorpo: opsonização, fração fc pode interagir com a membrana da célula do sistema imune (sistema complemento) e resposta citotóxica mediada por anticorpo
Do ponto de vista farmacêutico, podemos pensar em outras aplicações: anticorpos contra receptor de VEGL, anticorpos que se ligam a receptores de morte celular, sendo ferramenta de delivery para agir na sua célula alvo (anticorpo conjugado a uma toxina pode ser eficiente nesse sentido). 
Primeiro sistema de produção de anticorpos: hibridomas (importância não é clínica), no qual baseia-se no desafio de um camundongo com um antígeno e ele começará a montar uma resposta humoral de produção de anticorpos contra isto e se extrairmos o baço desse animal teremos um tecido de células de interesse as quais produzem nosso anticorpo, porém elas são mortais. No entanto, podemos utilizar uma linhagem de células que são imortais (mas não produzem anticorpos) e juntar às células produtoras de membrana, então, ao utilizar agente fluidificante de membrana formaremos células híbridas. Ainda assim, não é garantido que todas as células formaram híbridos como desejamos, desse modo, é necessário selecionar quais são as células híbridasque produzem os anticorpos e este é o grande desafio desse processo. Um detalhe é que as células de mieloma tem uma modificação em uma via super importante na produção de nucleotídeos, elas são TK- e não são capazes de produzir nucleotídeos pela via timidina quinase, ela apenas utiliza a via de salvação. Já as células de camundongos, elas possuem as duas vias. Assim, quando fundimos essas células temos um genótipo TK- pelo mieloma e com a via de salvação por parte dos camundongos. Nós podemos cultiva-las em meio HAT que tem aminopterina, o qual inibe a via de salvação e consequentemente só teremos depois de um determinado tempo apenas as células de hibridoma. Utilizaremos um método chamado suspensão limitante, onde faremos diversas diluições até termos uma célula por poço. Para identificar qual o poço tem a célula fundida corretamente, posso fazer um ELISA. O problema do hibridoma é que eles são por ex. murinos, então, pode desenvolver resposta imune ao anticorpo. É possível fazer um hibridoma de humano tecnicamente, mas eticamente não. Então, outra estratégia é a tecnologia de DNA recombinante: lembrando que um anticorpo é uma proteína, onde a informação que varia é a da porção Fab (o resto da sequência é muito semelhante para todos) e se a gente pegar essa informação de um camundongo, sequenciar e incluo na sequência do esqueleto do anticorpo. Então, eu tenho uma proteína quimérica que é 95% de informação humana e o resto de outro animal. Ainda assim não é perfeito, pois na verdade eu preciso de apenas regiões específicas da fração Fab (as regiões CDRs) e se eu tiver como identificar apenas a sequência codificante da região CDR e clonar ela no esqueleto do anticorpo humano, teremos então, um anticorpo humanizado com mais de 95% da sequencia de origem humana. Esse anticorpo adquire propriedades iguais aos anticorpos naturais, porém há um problema para resolver: Como encontraremos a sequência Fab ou a CDR? O sequenciamento prevê que estamos analisando uma sequência apenas. Questão foi resolvida com a técnica de varredura de fagos (isolamento de informação): Desafiamos um animal com antígeno, extraímos as células, extraímos o RNAm dessas células e fazemos a transcriptase reversa e geramos os cDNA que são representativos dessa população de linfócitos. Podemos utilizar para fazer PCR com primers que irão flanquear a região Fab e amplificaremos em PCR com o mesmo tamanho menos o meio da sequência, clonamos isso em um vetor de expressão + proteína do capsídeo de fagos e cada produto (fago) estará carregando uma porção Fab diferente e se eu transformar uma bactéria com essa informação Fab fusionada com a informação de uma proteína do capsídeo de um fago, então, a bactéria começará a produzir fagos e cada um deles irá carregar na sua superfície uma porção Fab diferente. E se então, eu pegar essa população de fago e infectar a bactéria com esses fagos em meio sólido e elas continuam produzindo mais fagos (cada colônia um fago diferente), resta selecionar a colônia que está produzindo a porção Fab que me interessa, então, eu posso imobilizar uma membrana com o antígeno que me interessa e coloco em contato com as placas com as bactérias e quando eu tirar a membrana eu irei ter interagindo coma membrana os fagos de interesse (que tem a porção Fab que se liga ao antígeno). Poderei então revelar a membrana e por coordenada identificar e captar a colônia, na qual extrairei o plasmídeo e mandarei sequenciar, uma vez que agora tenho essa informação basta clona-la em um vetor de expressão em célula animal. Posso usar técnicas mais modernas de seleção, fazendo uma captura do fago em solução com bind, extraindo a informação e em seguida faço um sequenciamento de nova geração. Quanto a escolha de anticorpos, seletividade é um parâmetro mais desejável que afinidade, devido a segurança. Phage display é o principal modo de produção de anticorpos ultimamente e tem que saber. Quanto ao tempo de meia-vida, o humanizado é de 14-21 dias e o murinho é 30-40h, enquanto que o quimérico é 200-250h. 
Produção industrial em si:
- Transcrição do gene do anticorpo eficientemente
- Tradução e montagem do anticorpo eficientemente (interações do tipo de sulfeto devem ser feitas corretamente)
- Altos níveis de células viáveis (preciso de um método que garanta isso)
Devemos considerar: a linhagem celular e o modelo de expressão, sistema de operação do processo, processo de purificação e métodos de controle de qualidade.
Principais células usadas: CHO e BHK que são aderentes, mas adaptáveis em suspensão.
Se você dá uma informação para uma célula, ela conseguirá expressar. Porém, isso é estressante e em algum tempo, ela silenciará epigeneticamente essa informação. Como, então, posso burlar esse sistema? Se eu conjugar a informação de interesse com uma informação que a célula precisa, como uma enzima necessária. Não é fusão de informações e sim um vetor contendo as duas informações. Deve-se colocar o gene de interesse antes do gene essencial para a célula e a expressão será forçada porque a célula precisa disso para sobreviver (pode ser a sequência da GS ou DHFR), então, ela produzirá o anticorpo o tempo todo.
Arranjo da planta de produção: diferentes tanques de produção ligados diretamente a linha de purificação (será composta em geral por duas ou três etapas de cromatografia, a primeira tem que ser por afinidade – contendo proteína A e G ou AG que capturam a porção Fc do anticorpo e possuem um alto grau de pureza, após isso, faço uma segunda etapa com uma cromatografia iônica mesmo. Hoje em dia, tenta-se reduzir a quantidade de cromatografias, normalmente com uma captura e uma modalidade alternativa de cromatografia)
Vacinas recombinantes:
Os vírus tem uma característica muito importante: são compostos por núcleo protegido por interface proteica, porém existem alguns que são envelopados e possuem o mesmo adicionalmente à estrutura normal. Mesmo que o envelope tenha como origem uma célula do hospedeiro, ele tem algumas proteínas virais. Então, independentemente do tipo de vírus a primeira interação será sempre com a proteína. E essas proteínas podem ser alvo farmacológico, tal como em estratégia vacinal.
Vacinas clássicas: inativação do vírus (desestruturado e sem função) e vírus atenuado (não tem seu mecanismo patogênico ativo). O que nos impede de fazer vacina para alguns vírus: a maior parte deles a gente nem consegue fazer infecção em escala laboratorial, quanto mais industrial. Essa é a grande limitação das vacinas clássicas, tal como a dificuldade de atenuar e inativa-los de forma efetiva.
De forma recombinante, eu só preciso do conhecimento para produzir a proteína de interesse e não o vírus inteiro. Como você não tem o patógeno, você não precisa de um nível de segurança tão alto como nas vacinas clássicas. Como no caso da hepatite B, eu precisarei apenas isolar o gene responsável pela proteína de superfície que realiza a ação antigênica, inserir em um plasmídeo de levedura por ex. e essas células modificadas produzirão a sua proteína e após purificadas, teremos a vacina. Vantagens: Livres de partículas infecciosas, facilitando a produção em larga escala e de forma mais rápida. Essa rapidez permite mais agilidade na apresentação de vacinas novas para aquelas modificações anuais – vírus que alteram suas proteínas de superfície-, como no caso do influenza. Bom, a grande questão é que boa parte da nossa resposta imune depende da apresentação de antígeno e isso depende de um processo proteolítico, então, nosso sistema imune é quase que totalmente proteíco. Assim, se o seu vírus evoluiu de forma a ter proteínas que são muito mal processadas, o seu sistema imune consegue reconhecer mas não consegue apresentar corretamente. A resposta aguda será mostrada, mas a crônica não. Precisamos burlar isso e o que podemos fazer é adicionar adjuvantes biológicos como inserir informações de proteínas do patógeno em questão em outro vírus de fácil manipulação, facilitando a apresentação do antígeno. O que se precisa fazer é sequenciar ogenoma do nosso vírus após o isolamento do mesmo, clonagem de genes virais responsáveis por proteínas do mesmo em vetor de expressão e então, realizar recombinação homóloga com a transfecção por um vetor em outro vírus. A etapa mais demorada depois disso são os testes clínicos e registro. Mas e se eu tenho um vírus que o nosso sistema imune precisa reconhecer a estrutura do vírus como um todo? O padrão não será dele, será de outro. Existe uma tecnologia chamada VLPs, partículas semelhantes a vírus, onde eu clono todas as proteínas do vírus no vetor de expressão (pode ser em um plasmídeo) e uma vez expressas (em cultura de leveduras, por ex.) essas proteínas vão se associar e gerar partículas exatamente igual a original, mas elas não tem nenhum genoma. Pode-se inclusive fazer isso de forma divalente ou mais, produzindo VLPs com proteínas de mais de um vírus. É necessário posteriormente purificar as suas VLPs
Vacina de DNA
Temos no geral respostas agudas apenas. O vírus vai lá infecta a célula e fica em estado de quiescência dele e ele tem sempre uma proteína na membrana da célula infectada, mas em quantidade muito baixa que não faz com que o sistema imune seja ativado (ele se aloja em células propícias para isso também –pouca circulação sanguínea). Nesse caso, precisamos de uma resposta citotóxica, então, podemos pegar a sequência dessa proteína que é o marcador de infecção e pegar células do paciente, modificar in vitro leucócitos do paciente com vetor de expressão aumentando a expressão dessa proteína. Retornamos essa célula pro paciente e o sistema imune irá encontrar essas células reservatórios e será ativado.
A estabilidade do ácido nucléico é bem maior que proteína, mas todo processo produtivo é diferente de como conhecemos, porém, ainda está sendo desenvolvido. Inclusive algumas pesquisas atuais indicam que talvez a vacina de DNA possa ter alguma espécie de memória.
Patógenos intracelulares que são alvo dessa tecnologia: Ebola, Hepatite C, HIV, Malária...
Aula 5
Sistemas eucarióticos alternativos para a produção de biofármacos
Objetivos: Manipular o metabolismo, alterar atividades enzimáticas, introduzir novos genes, alterar a disponibilidade de compostos, alterar a expressão de genes reguladores e super expressão de enzimas chave para a produção melhorada de compostos. 
Por que expressar proteínas industrialmente? É uma produção segura, controlada, barata, altamente produtiva. Além de ser fácil recuperar as proteínas expressas e não degrada-las.
Como já dito, as modificações pós-trasncricionais são uma limitação para o uso de procariotos a fim de sintetizar proteínas eucarióticas, como por ex. o fato de que as bactérias em sua maioria não fazem glicosilação e quando fazem, majoritariamente não são com padrões iguais às células eucarióticas. Aliás, o enovelamento de proteínas, a estabilidade, solubilidade e outros fatores são diferentes quando as mesmas são produzidas em eucariotos e procariotos.
Bom, os sistemas de expressão disponíveis são: Bactérias, leveduras, insetos, plantas transgênicas, cultura de células animais e animais transgênicos.
Leveduras:
Esse sistema tem como vantagem o fato de ser relativamente barato, fácil de manipular, permitir modificações pós transcricionais, ser possível a secreção de proteínas recombinantes e a mesma é alta em biorreatores (1g/L). No entanto, os níveis de secreção de proteínas endógenas é baixo, as modificações pós transcricionais nem sempre são as desejadas e há a possibilidade de imunogenicidade.
Insetos:
Injeção de vírus modificado com a informação da proteína recombinante de interesse em larva de inseto, extrai a proteína recombinante, purifica e utiliza. Esse sistema tem como vantagem permitir a expressão de mais de dois genes ao mesmo tempo, alto nível de proteínas expressas, facilidade de purificação, capaz de usar inserções maiores nos vetores e alta qualidade de produção. No entanto, a escala de tempo da produção é longa, é difícil a manipulação e requer um custo alto.
Plantas transgênicas:
Esse método possui um custo de produção reduzido e a manutenção do cultivo pode ser feita em estufas/áreas abertas. As modificações pós-traducionais são parecidas com os de células animais – slide 23