4- SEQUENCIAMENTO, CLONAGEM E TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO

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DESCRIÇÃO
Introdução aos métodos de sequenciamento de material genético, tecnologia do DNA recombinante e técnicas de hibridização de ácidos
nucleicos.
PROPÓSITO
Compreender as metodologias de estudo e análise da sequência de DNA, uma ação importante para entender a sua manipulação para fins
de biotecnologia, bioinformática, diagnóstico e outras aplicações, como pesquisa.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Distinguir as características dos principais métodos de sequenciamento do DNA
MÓDULO 2
Reconhecer as principais técnicas de clonagem molecular, suas formas de uso e suas vantagens e desvantagens
MÓDULO 3
Identificar os métodos de hibridização de ácidos nucleicos, suas diferenças e aplicações na rotina do biologista molecular
INTRODUÇÃO
As características hereditárias são passadas de geração em geração através do material genético, codificado em nosso DNA. Existe um
grande interesse em conhecermos a fundo o nosso DNA, que tem sido alvo de estudos cada vez maiores e mais profundos desde sua
descoberta, na década de 1950.
O conhecimento do DNA humano e de outros organismos trouxe consigo múltiplas aplicações, que vão do conhecimento em si ao
entendimento de doenças genéticas, estudo comparativo entre espécies, ferramentas em biotecnologia e bioinformática e discussões éticas.
Tudo isso foi possível graças às técnicas em biologia molecular que precederam e inspiraram o desenvolvimento do sequenciamento, como
as técnicas de restrição enzimática, de clonagem molecular e de hibridização. Atualmente, elas são protagonistas e trabalham em conjunto
para o avanço da ciência, da biotecnologia e da saúde humana e animal.
MÓDULO 1
 Distinguir as características dos principais métodos de sequenciamento do DNA
PRINCÍPIOS DO SEQUENCIAMENTO
A quantidade de conhecimento que temos sobre o genoma humano e de outras espécies aumentou extraordinariamente a partir do
desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento do DNA. A maior iniciativa para sequenciamento de genomas foi o Projeto Genoma
Humano, que gerou uma quantidade de informação gigantesca. Atualmente, sabemos que o genoma humano tem mais de 3 bilhões de pares
de bases e que 99,9% da população humana compartilha o mesmo DNA. Ainda assim, não sabemos a função de aproximadamente metade
dos genes descobertos.
 
Fonte: Shutterstock.com
A informação genética está contida no DNA (ácido desoxirribonucleico), uma longa molécula que é formada por nucleotídeos. Para
entendermos como as técnicas a serem exploradas neste conteúdo funcionam, precisamos relembrar alguns conceitos-chave do DNA e da
biologia molecular.
DNA: construção complexa
O primeiro deles é a ideia de que o DNA é uma construção complexa, como uma casa luxuosa. Por mais luxuosas que sejam, as casas são
feitas de tijolos, que são as unidades mínimas na nossa metáfora. No DNA, as unidades básicas são os nucleotídeos. Cada nucleotídeo tem
três regiões principais:

1
Um açúcar chamado de desoxirribose (por não conter oxigênio no segundo carbono da ribose). No terceiro carbono da desoxirribose, temos
um álcool orgânico (grupamento hidroxila) importante para a replicação.
2
No quinto carbono da ribose, temos um grupamento fosfato.

3
No primeiro carbono da ribose, temos uma base nitrogenada (Adenina, Timina, Citosina, Guanina - A, T, C, G). (Figura 1).

 
Os nucleotídeos / Fonte: Shutterstock.com
 Figura 1. Os nucleotídeos.
As bases nitrogenadas são a principal diferença entre os nucleotídeos de DNA e são as responsáveis por codificar a informação genética.
Afinal, precisamos ter pelo menos algumas letras diferentes para codificarmos uma informação no texto complexo que é o nosso genoma. Em
uma fita dupla de DNA, as bases nitrogenadas estão livres e pareiam entre si − purinas (A e G) com pirimidinas (T e C) −, graças ao que
chamamos de complementariedade das fitas de DNA. Isso garante que a informação genética seja estável e permite a replicação (ou
duplicação) do DNA com o mínimo de erros possível.
Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e pareamento das bases por complementariedade. Note as pontes de hidrogênio duplas (seta
azul) entre Adenina e Timina, e triplas (seta preta) entre Citosina e Guanina.
 
Pareamento das bases nitrogenadas / Fonte: Shutterstock.com
 Figura 2. Pareamento das bases nitrogenadas.
Replicação do DNA
O segundo conceito que precisamos revisar é o da replicação do DNA. A DNA-polimerase é uma enzima capaz de sintetizar uma nova fita
de DNA a partir de um DNA molde. Suas principais funções são reconhecer o nucleotídeo lido na fita molde, pareá-lo com seu nucleotídeo
complementar e fazer a junção desse segundo nucleotídeo à fita que está sendo sintetizada.
 ATENÇÃO
Essa junção do nucleotídeo é feita a partir da energia presente no grupamento trifosfato no quinto carbono do nucleotídeo livre e a hidroxila
livre do terceiro carbono da desoxirribose do nucleotídeo que já faz parte da fita em síntese. Essa ligação é chamada de fosfodiéster e é uma
ligação covalente, ou seja, forte e difícil de ser quebrada.
Agora que sabemos esses aspectos do DNA e de sua replicação, podemos conhecer as técnicas para identificação dos nucleotídeos que os
formam.
SEQUENCIAMENTO SANGER ORIGINAL
Uma das primeiras técnicas de sequenciamento de DNA a ganhar grande espaço no mundo científico foi desenvolvida na década de 1970
pelo cientista Frederick Sanger e, até os dias atuais, o chamado Sequenciamento Sanger é uma das técnicas mais robustas e precisas em
uso.
Nesse método, Sanger e seus colegas usaram nucleotídeos especiais, com duas grandes diferenças dos nucleotídeos normais que
encontramos nas células: os nucleotídeos que Sanger usava eram marcados com radioisótopos, de forma que eles pudessem identificar
qual base nitrogenada foi adicionada; já as desoxirriboses foram modificadas pela retirada da hidroxila no terceiro carbono, o que impede a
adição de nucleotídeos novos pela polimerase. Por isso, o Sequenciamento Sanger leva o nome oficial de terminação de cadeia, ou dideoxy
(pela falta de duas (di-) hidroxilas, no segundo e terceiro carbonos da ribose – os ddNTP).
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Fonte: Shutterstock.com
RADIOISÓTOPOS
são átomos que emitem radioatividade detectável por aparelhos especializados.
 
Representação esquemática de um Didesoxinucleotideo (ddNTP) sem um OH no carbono 3 (cinza) e um desoxinucleotídeo (dNTP). / Fonte:
CNX OpenStax / http://cnx.org ©
 Figura 3. Representação esquemática de um Didesoxinucleotideo (ddNTP), sem um OH no carbono 3 (cinza) e um desoxinucleotídeo
(dNTP).
Em um Sequenciamento Sanger, precisamos amplificar o DNA-alvo a ser sequenciado. Normalmente, usamos um produto de PCR (Default
tooltip) como amostra, pois precisamos de grande quantidade de DNA-alvo. Mesmo assim, o Sequenciamento Sanger exige uma reação de
amplificação independente, e, por isso, é classificado como um sequenciamento por síntese – SpS.
A amplificação feita no Sequenciamento Sanger original contava com uma DNA-polimerase e seu tampão, iniciadores (oligonucleotídeos
curtos que se ligam especificamente ao DNA-alvo a ser amplificado), desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTPs) e ddNTPs.
Como a marcação radioativa era a mesma para cada nucleotídeo, a identificação de qual ddNTP havia sido adicionado se dava pela
separação física, em tubos diferentes, dos ddNTPs marcados. Assim, o Sanger original tinha quatro tubos diferentes, cada um contendo
polimerase, iniciadores, tampão, os 4 nucleotídeos (dNTPs) e um didesoxinucleotídeos (ddNTP), marcado com radioatividade.
 EXEMPLO
Por exemplo, em um dos quatro tubos, tínhamos dATP (desoxirribonucleotídeo trifosfato de adenina), dCTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato
de citosina), dTTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato de timina) e dGTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato de guanina) e um
didesoxirribonucleotideo trifosfatado de guanina (ddGTP) marcado com radioisótopo; nos outros, estavam presentes os mesmos dNTPS e em
cada um ddNTP diferentes(adenina, tirosina e citosina).
A cada ciclo de amplificação, os dNTPs são adicionados até que o ddNTP marcado com radioisótopo seja adicionado, o que faz com que a
adição de nucleotídeos à fita nova seja parada apenas para aquela fita. As outras fitas que estão sendo sintetizadas na mesma reação
continuam sendo sintetizadas até que o ddNTP seja adicionado. Dessa forma, temos sequências de DNA de diferentes tamanhos, todas
terminando em um ddNTP marcado com radioisótopo. Assim, sabemos qual ddNTP terminou a cadeia, pois eles estão em tubos separados!
Da mesma forma que revelamos o resultado de uma PCR convencional separando o produto amplificado em um gel de agarose através da
eletroforese e corando-o com um agente intercalante de DNA que seja fluorescente, a revelação do Sequenciamento Sanger também se
baseava na separação por eletroforese e revelação.
Quando o gel de agarose polimeriza, forma uma malha frouxa, que não é estreita o suficiente para separar sequências com diferenças de até
um único nucleotídeo (ou ddNTP, no caso do Sequenciamento Sanger) que precisamos detectar. Então, usamos outro tipo de gel, ou
polímero: a poliacrilamida, feita a partir da polimerização da acrilamida/bisacrilamida, que nos dará uma malha muito mais intricada (forma
poros regulares e de tamanho uniforme) e capaz de distinguir pequenas diferenças no tamanho do DNA.
Cada um dos quatro tubos de sequenciamento diferentes, contendo os ddNTPs marcados, usará um poço no gel de poliacrilamida para sua
resolução. Esperamos que, em cada tubo, os ddNTPs tenham sido usados mais de uma vez. Então, desejamos ver múltiplas bandas em
cada uma das linhas do gel correspondentes a cada ddNTP utilizado.
Além disso, como a intenção do gel é a separação dos produtos por tamanho quando submetidas a uma corrente elétrica, as moléculas de
DNA menores migram mais rapidamente pelo gel e, por isso, estão localizadas mais abaixo do que as moléculas maiores. Finalmente, a
revelação é feita através da emissão de radioatividade, que ficava impressa em um filme de raios X, e, em seguida, a sequência é montada a
partir dos tamanhos de DNA obtidos (Figura 4).
 
Qi-Liang Ding/Wikimedia Commons/ Licensed Attribution-Share Alike 3.0 Unported
 Figura 4. Sequenciamento Sanger manual e imagem real do sequenciamento.
A partir da Figura 4, vemos que cada ddNTP marcado com radioisótopos foi colocado em tubos separados e, após eletroforese em gel de
poliacrilamida, foram obtidos diferentes tamanhos de DNA. Após revelação (Figura 4, à direita), a sequência é montada de forma manual a
partir desses tamanhos.
Automação do Sequenciamento Sanger
A técnica original de sequenciamento Sanger era bastante trabalhosa e exigia um nível de complexidade muito grande. Além de serem quatro
tubos, os ddNTPs radioativos precisavam ser manipulados em ambiente controlado por oferecerem risco à saúde dos trabalhadores, e tudo
era feito manualmente, inclusive a interpretação do gel de poliacrilamida para determinação da sequência. Isso trazia imensas limitações ao
uso do sequenciamento. Por isso, os pesquisadores automatizaram o sequenciamento para reduzir custos, riscos e tempo de execução, além
de, claro, aumentar a precisão na determinação das bases em sequência.
Para que a automatização fosse bem-sucedida, entretanto, eles precisaram modificar algo crucial: o uso de radioisótopos. Por serem a maior
limitação da técnica, eles foram substituídos por fluoróforos. O uso destes na marcação dos ddNTPs concedeu outra grande vantagem:
além de serem mais seguros, podem ser utilizados vários fluoróforos que se excitam e emitem fluorescência em comprimentos de onda
diferentes ao mesmo tempo. Isso permite que vários fluoróforos sejam usados na mesma reação, abolindo o uso de quatro tubos.
Com cada ddNTP marcado com fluoróforo de cor diferente, o sequenciamento é mais seguro e mais barato, pois já não precisamos lidar com
a segurança extra contra a radioatividade e reduzimos a reação a um único tubo.
Com o uso de quatro fluoróforos, um para cada ddNTP e em um único tubo de amplificação, outra limitação ao uso do sequenciamento foi
superada: a forma de leitura.
FLUORÓFOROS
Fluoróforos são pequenas moléculas que, quando excitadas em determinado comprimento de onda, emitem fluorescência que pode ser
facilmente detectada.
 RELEMBRANDO
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Na técnica original
Os resultados eram lidos manualmente, combinando os fragmentos de tamanhos diferentes em ordem até que o quebra-cabeça fosse
montado. E, em muitos casos, não era trivial diferenciar qual era a próxima banda, especialmente quando a sequência era mais longa e ainda
demandava muito tempo para a leitura e a interpretação. Além disso, o gel de poliacrilamida várias vezes não era preciso na diferenciação
dos tamanhos de DNA e apresentava baixa resolução durante a leitura.
Na automação
A leitura dos fragmentos com terminação em ddNTPs marcados com fluoróforos passou a ser feita por eletroforese em capilar, ou seja, em
um tubo extremamente fino contendo um polímero semelhante à poliacrilamida pela qual cada fragmento passa, um de cada vez.
À medida que cada fragmento passa pelo capilar, um laser incide sobre a sequência, e os ddNTPs marcados emitem fluorescências em
comprimentos de onda diferentes que são detectadas por um aparelho. Os aparelhos mais modernos conseguem sequenciar cerca de 900
pares de base (pb) em uma cadeia, e possuem múltiplos capilares para a leitura de dezenas de amostras diferentes. O aparelho também
processa e filtra a fluorescência de ruído (ou background) de cada ddNTP lido e nos fornece uma representação gráfica da sequência e de
sua qualidade.
A representação gráfica é o resultado que iremos analisar, e seu nome oficial é eletroferograma. Este consiste em picos coloridos, em que a
altura do pico representa a qualidade da leitura – picos mais altos possuem melhor qualidade e são mais confiáveis (ou seja, a probabilidade
de a fluorescência da detecção estar errada é muito pequena), e cada cor representa uma base nitrogenada diferente detectada por
fluorescências distintas (Figura 5).
 
Esquema do Sequenciamento Sanger automatizado. / Fonte: Estevezj - Own work/ https://commons.wikimedia.org/ / CC BY-SA 3.0
 Figura 5. Esquema do Sequenciamento Sanger automatizado.
Sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing)
Enquanto a técnica de Sanger era aperfeiçoada e automatizada, outros esforços para sequenciamento de DNA apareceram. Durante essa
época, surgiu o pirosequenciamento, capaz de detectar a produção de um fosfato livre – ou pirofosfato –, decorrente da adição de um
nucleotídeo.
O pirofosfato é produzido quando o trifosfato da extremidade 5’ de um nucleotídeo é clivado e dá energia à ligação fosfodiéster catalisada
pela DNA polimerase. Assim, o pirosequenciamento também é um sequenciamento por síntese (SpS), como o Sanger. Porém, dispensa o
uso de ddNTPs marcados com radioisótopos ou fluoróforos, assim como eletroforese em capilar. O pirofosfato é detectado ao ser convertido
em ATP por uma enzima (ATP sulfurilase). O ATP é, então, usado pela luciferase, uma segunda enzima que oxida a luciferina, um substrato
em oxiluciferina, e, durante essa transformação, ocorre a formação de luz, que pode assim ser quantificada.
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No pirosequenciamento, cada dNTP é adicionado separadamente à reação, de forma que se saiba qual foi o nucleotídeo inserido que gerou
luz. Os nucleotídeos que não foram usados são degradados por uma terceira enzima, a apirase. O ciclo se repete com o próximo nucleotídeo
(Figura 6).
PIROSEQUENCIAMENTO
também conhecido pelo nome comercial Roche 454.
 
Esquema das etapas da reação de pirosequenciamento.
 Figura 6. Esquema das etapas da reação de pirosequenciamento.
A partir da Figura 6, observamos que o DNA genômico é clivado, ligado a adaptadores e imobilizado em microesferas (beads), nas quais
acontecerá a amplificação do DNA por PCR em emulsão (que vamos entender aseguir). No sequenciamento, vemos cada novo nucleotídeo
adicionado pela DNA polimerase e detectado pela emissão de luz decorrente da liberação de um pirofosfato.
Com a criação do pirosequenciamento, surgiu uma nova geração de sequenciamento (NGS – Next Generation Sequencing). Nessas
metodologias, usamos o conceito de formação de bibliotecas de DNA para o sequenciamento.
Vamos entender como:

1
As bibliotecas são formadas por meio da “quebra” do DNA extraído, seja por ele ter sido digerido em pequenos fragmentos usando enzimas,
seja por ter sido clivado usando métodos físicos, como a sonicação.
2
O DNA fragmentado é ligado a adaptadores, que são pequenas sequências sintéticas, conhecidas e exógenas, usadas na identificação das
amostras. Cada extremidade (5’ e 3’) do DNA fragmentado em uma biblioteca se liga a um adaptador distinto, com sequências de DNA
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diferentes.
O uso de adaptadores permitiu o sequenciamento de regiões do DNA que não tínhamos conhecimento suficiente para desenharmos
oligonucleotídeos iniciadores, e foi desenvolvido ainda na era Sanger.


3
Os adaptadores imobilizam o fragmento de DNA e auxiliam o início da síntese, pois se ligam por complementariedade a oligonucleotídeos
iniciadores aderidos a microesferas, de forma que cada microesfera tenha apenas um fragmento de DNA ligado a ela.
4
Cada microesfera será depositada em um micropoço (em um microchip), local onde ocorrerá uma PCR diferente, chamada de PCR em
emulsão (ou em gotícula de óleo-água).


5
Assim, cada microesfera terá várias cópias idênticas do mesmo DNA. Isso é importante para amplificação do sinal emitido pelo pirofosfato,
que precisa ser suficiente para que nossos métodos de detecção disponíveis consigam captar esse sinal.
6
Em seguida, as fitas duplas ligadas à microesfera são desnaturadas em fitas simples, e estarão prontas para iniciarmos a reação de
sequenciamento.
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

7
Na etapa de sequenciamento, um único dNTP é adicionado por vez à reação. Assim, quando o dNTP complementar à sequência-molde é
adicionado pela polimerase, o pirofosfato liberado na formação da ligação fosfodiéster dá energia para a reação luminosa ocorrer, que é, por
sua vez, detectada por um sensor.
EXÓGENAS
Não pertencentes ao DNA a ser sequenciado.
EMULSÃO (OU EM GOTÍCULA DE ÓLEO-ÁGUA)
Nessa emulsão de água, em uma fase oleosa, as gotículas de água contêm os reagentes de PCR, uma fita de DNA a ser sequenciado
e uma bead para sua ancoragem.
SONICAÇÃO
É utilizada a energia de ondas sonoras para quebrar macromoléculas – nesse caso, o DNA.
Esse sistema permite a existência de milhares de microesferas, cada uma com uma sequência de DNA única, amplificada e sequenciada.
Assim, milhões de pares de base podem ser sequenciados muito mais rapidamente do que pelo método de Sanger.
O mesmo princípio de criação de bibliotecas de DNA com o uso de adaptadores, imobilização e sequenciamento por síntese foi
aperfeiçoado e modificado posteriormente. Um dos métodos mais famosos e mais usados é o sequenciamento Illumina/Solexa.
Nessa técnica, a biblioteca de DNA é ligada aos adaptadores. Vamos entender como isso é feito:
1
Os fragmentos de DNA são anelados a iniciadores aderidos a uma placa (chamada de célula de fluxo ou flowcell) por meio dos adaptadores,
e a síntese por ponte de DNA começa usando dNTPs normais.
2
Na síntese por ponte, cada extremidade do DNA contém adaptadores diferentes capazes de se anelar aos primers complementares já
aderidos à placa.
3
A DNA polimerase sintetiza todas as fitas complementares, formando agrupamentos (ou clusters, em inglês) de DNA idênticos, que são
desnaturados em fitas simples e usados como molde para a etapa do sequenciamento (Figura 7).
Veja a representação esquemática da amplificação por ponte da técnica de sequenciamento Illumina/Solexa:
Após formação da biblioteca de DNA ligada a adaptadores (rosa e verde), o DNA-alvo é fragmentado e ligado aos iniciadores aderidos na
placa através de complementariedade com os adaptadores, para que a amplificação por ponte aconteça.
 
Fonte: DMLapato - Own work / https://commons.wikimedia.org/ /CC BY-SA 4.0©
 Figura 7. Esquema da amplificação pela técnica de sequenciamento Illumina/ Solexa. Na foto, os adaptadores estão em verde e rosa.
O sequenciamento em si é efeito de forma semelhante ao Sanger, em que didesoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados com fluoróforos são
adicionados à reação, causando a terminação da polimerização. No caso do sequenciamento Illumina, os nucleotídeos marcados com
fluorescência são terminadores reversíveis da polimerização, ou seja, após uma simples lavagem, o sequenciamento pode continuar com a
incorporação de novos nucleotídeos marcados com fluoróforos feita pela DNA polimerase.
A fluorescência de cada ciclo é obtida em diferentes comprimentos de onda para cada ddNTP e é detectada pelo aparelho sequenciador, que
decodifica o sinal. Cada corrida pode ter milhões de clusters diferentes, o que nos gera uma quantidade gigantesca de dados (Figura 8).
 
 Figura 8. Esquema do sequenciamento Illumina.
 ATENÇÃO
Talvez esta tenha sido a maior vantagem dos sequenciamentos de nova geração: a introdução de métodos de alto rendimento, o que significa
um sequenciamento de um número gigantesco de bases, de forma muito mais rápida do que o Sequenciamento Sanger.
Contudo, as NGS possuem desvantagens, como perda de precisão quando as sequências são muito repetitivas em um único nucleotídeo,
pois é difícil para o aparelho saber quantas bases idênticas foram adicionadas em um ciclo apenas, já que o pico de luz fica bem mais
extenso ou mais longo. Nesses casos, podemos usar o Sequenciamento Sanger, que é mais confiável para determinação de sequências
repetitivas por também separar as moléculas de DNA por tamanho.
Outra desvantagem do NGS é o tamanho máximo das sequências lidas: enquanto no Sequenciamento Sanger lemos cerca de 900 pb, nos
primeiros NGSs, as leituras eram bem mais curtas – inicialmente, apenas 30 a 40 bases eram lidas por fragmento.
Atualmente, na terceira geração de NGS, existem equipamentos capazes de ler sequências maiores, de 200 a 300 pb. Novas tecnologias
capazes de sequenciar até 50 kbp (Default tooltip) em uma leitura contínua, assim como técnicas para sequenciamento em tempo real,
também foram desenvolvidas e estão constantemente sendo aprimoradas.
Toda essa capacidade de sequenciamento introduziu outra questão importante: como unir esses pequenos fragmentos e reconstituir a
sequência contínua original de milhões de pares de base, como as que existem nos organismos vivos?
Com o desenvolvimento tecnológico que permitiu os sequenciamentos de alto rendimento, vimos o desenvolvimento de softwares e
algoritmos especializados na resolução do quebra-cabeças gerado ao produzirmos centenas de milhões de sequências. Com o estudo da
genômica e da transcriptômica, um campo novo de intercessão entre biologia e informática cresceu muito: a bioinformática.
TRANSCRIPTÔMICA
Estudo do total de genes que estão sendo transcritos em determinada célula, pela síntese da cDNA a partir do RNA mensageiro. .
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Neste vídeo, você conhecerá um pouco sobre os métodos de NGS de terceira geração.
Para aprender sobre como o quebra-cabeças do genoma é montado em maiores detalhes, acesse nossa seção Explore +.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. O SEQUENCIAMENTO DO DNA PERMITIU GRANDE QUANTIDADE DE CONHECIMENTO SOBRE O GENOMA
DE DIVERSAS ESPÉCIES. SOBRE OS MÉTODOS DE SEQUENCIAMENTO, É CORRETO AFIRMAR QUE:
A) O método mais antigo, conhecido como pirosequenciamento, utiliza a liberação de um pirofosfato terminador de cadeia para revelar qual
nucleotídeo foi adicionado.
B) Um dos métodos mais confiáveis de sequenciamento é o pirosequenciamento, pois consegue identificar regiões com nucleotídeos
repetitivos com alta resolução.
C) Os sequenciamentos de nova geração (NGS) não são tão confiáveis quanto oSequenciamento Sanger, porém produzem grande
quantidade de informação em um intervalo de tempo muito curto.
D) O sequenciamento Illumina e o pirosequenciamento não fornecem muita informação, pois sequenciam apenas algumas dezenas de pares
de base por corrida.
E) Com a chegada de NGS, o Sequenciamento Sanger se tornou obsoleto e não tem mais utilidade para a maioria das aplicações em
ciência, saúde e biotecnologia.
2. SOBRE O SEQUENCIAMENTO SANGER, É CORRETO AFIRMAR QUE:
A) Utiliza a terminação da cadeia em ribonucleotídeos marcados com radioisótopos, o que limita a aplicação do método.
B) Utiliza didesoxirribonucleotídeos marcados com fluoróforos, que são identificados ao longo da cadeia durante a síntese.
C) Parte do princípio de separação das moléculas de DNA em gel de agarose e revelação dos nucleotídeos por emissão de luz ultravioleta.
D) Foi automatizado, de forma que a terminação da cadeia por nucleotídeos modificados e marcados possa ser identificada mais
rapidamente.
E) Depende da leitura de lasers, que excitam os radioisótopos a emitirem radiotividade no comprimento de onda a ser detectado.
GABARITO
1. O sequenciamento do DNA permitiu grande quantidade de conhecimento sobre o genoma de diversas espécies. Sobre os
métodos de sequenciamento, é correto afirmar que:
A alternativa "C " está correta.
 
O Sequenciamento Sanger é muito mais confiável que a maioria dos NGS, especialmente para identificar nucleotídeos em regiões repetitivas,
pois também é capaz de separar as sequências terminadas em ddNTPs marcadas de acordo com seu tamanho. No entanto, cada corrida de
Sequenciamento Sanger consegue identificar uma quantidade de pares de base muito pequena (cerca de 900 bp) comparada à capacidade
de sequenciamento de NGS, que pode chegar a milhões de pares de base (ou Mpb) por corrida.
2. Sobre o Sequenciamento Sanger, é correto afirmar que:
A alternativa "D " está correta.
 
O Sequenciamento Sanger automatizado usa didesoxinucleotídeos marcados com fluoróforos e separação por eletroforese em capilares, o
que permitiu o sequenciamento de dezenas de amostras em uma mesma corrida.
MÓDULO 2
 Reconhecer as principais técnicas de clonagem molecular, suas formas de uso e suas vantagens e desvantagens
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
A tecnologia do DNA recombinante é uma ferramenta com grande aplicação em biotecnologia. É usada para transferir uma informação
genética de um organismo para outro, pela união de duas fitas de DNA de origens diferentes e sua inserção em um organismo hospedeiro
(Figura 9).
 
Fonte: Shutterstock.com
 A tecnologia do DNA recombinante consiste na união de duas fitas de DNA.
Também é conhecido como clonagem molecular, pois nesse processo temos a expansão de organismos hospedeiros idênticos
geneticamente, ou clones, todos contendo o DNA recombinante.
Com o uso da tecnologia do DNA recombinante, conseguimos produzir proteínas humanas em larga escala, para terapia, diagnóstico e até
prevenção de doenças.
 EXEMPLO
Por exemplo, a clonagem molecular permite: que bactérias sintetizem insulina humana, usada no tratamento de diabetes mellitus tipo I; usar
genes inseridos em plasmídeos como forma de amplificarmos o gene e usá-los como curva de quantificação em uma qPCR; fabricar vacinas
contra o papilomavírus humano (HPV) usando apenas a proteína externa do vírus produzida em levedura.
Além disso, podemos alterar geneticamente organismos complexos, como plantas e animais, ao introduzirmos genes de outras origens – os
transgenes, gerando os organismos transgênicos – ou modificando genes que já existem em determinado organismo. Criamos, assim, os
chamados organismos modificados geneticamente (GMO, genetically modified organisms). Entretanto, com essa capacidade, vieram muito
questionamentos éticos sobre o que podemos e devemos modificar nos organismos.
Para dominarmos essa poderosa ferramenta, precisamos conhecer alguns pontos-chave sobre a informação que queremos transferir, sobre
as formas de transferência e sobre o sistema para onde estamos transferindo a informação genética.
A informação que queremos transferir, nesse caso, é uma sequência de DNA de interesse, que pode ser tanto um gene, uma região
regulatória, ou pequenas sequências que determinam epítopos antigênicos que não serão expressos, que chamamos de inserto. A forma
de transferência dessa sequência é o que chamamos de vetor.
EPÍTOPOS ANTIGÊNICOS
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Regiões que causam uma resposta imunológica que podemos detectar.
Assim como uma encomenda precisa ser transportada por caminhão, moto, navio ou avião para chegar até seu destino, a sequência genética
precisa de uma forma de transporte até o organismo-alvo. O sistema de utilização é o nosso organismo final, que apresente a capacidade de
expressar determinado gene ou seja modificado geneticamente, o qual chamamos de hospedeiro (Figura 10).
 
Fonte: Shutterstock.com
 Figura 10. Esquema das partes essenciais da clonagem molecular: sequência de interesse (ou inserto), vetor (plasmídeo) e hospedeiro
(bactéria).
Vamos conhecer cada etapa da clonagem molecular passo a passo:
PASSO 1: ISOLAMENTO DO FRAGMENTO DE INTERESSE
O primeiro passo para clonagem molecular é a identificação do gene ou da sequência de DNA que queremos clonar, que, como já
aprendemos, é chamada de inserto.
Para isso, podemos partir de uma sequência já conhecida. Nas últimas duas décadas, uma quantidade gigantesca de informação genética foi
produzida, e existem diversas ferramentas de informática disponíveis na internet para conhecermos a sequência exata de genes e regiões
não codificantes de diversos organismos. A maior plataforma pública e gratuita que armazena sequências de DNA (e cDNA, caso estejamos
interessados em RNA) e mais conhecida é o GenBank (ou banco de genes, em tradução livre), do Instituto Nacional de Saúde dos Estados
Unidos da América (NIH – National Health Institute).
 ATENÇÃO
Caso seu gene de interesse não esteja entre as sequências armazenadas e disponíveis ao público, você poderá sequenciar a região. Nesse
caso, basta amplificarmos a sequência ou a região próxima que a flanqueie (ou seja, as regiões que estão antes e depois de determinada
sequência) por PCR. Após a amplificação, iremos separar as sequências obtidas na PCR por eletroforese em gel de agarose e observar se
existem vários produtos ou apenas um.
 
Caso tenhamos apenas um produto, podemos purificar a PCR e extrair apenas o DNA amplificado – ou seja, remover todo tampão, enzima
Taq e os iniciadores, que poderiam interferir no sequenciamento. Caso mais de uma banda esteja visível no gel de agarose, precisaremos
cortar a banda de tamanho desejado e purificá-la a partir do gel. Assim, eliminamos produtos de PCR inespecíficos e impedimos que eles
influenciem nosso Sequenciamento Sanger, o que será feito a seguir.
Mas o que fazer caso não haja informação suficiente sobre o organismo estudado sequer para desenhar iniciadores para a PCR?
Nesse caso, pode-se usar novas tecnologias de sequenciamento, conhecidas como sequenciamento de nova geração, que usam
adaptadores para amplificar o genoma.
Uma vez que tenhamos nosso inserto amplificado e sua sequência conhecida, podemos colocá-lo (ou inseri-lo) no nosso vetor.
PASSO 2: ESCOLHA DO VETOR E ESTRATÉGIA DE INSERÇÃO
Uma vez determinada com exatidão a composição da sequência, precisamos observar seu tamanho. Assim como usamos meios de
transporte diversos para diferentes tamanhos de encomendas, precisamos escolher qual o melhor vetor para transportar a sequência.
Os vetores são pequenos DNAs autorreplicantes e circulares que conseguem ser transferidos para dentro das células. Existem diversos
tipos de vetores, baseados em seu tamanho total, no tamanho da sequência de DNA recombinante que pode transportar e organismos em
que podem ser usados.
Os vetores mais conhecidos são os plasmídeos, que são pequenos DNAs circulares autorreplicantes, de origem bacteriana, que podem ser
transportadospara dentro e para fora da célula. Eles ocorrem na natureza e acredita-se que sejam originados de restos de genomas
bacterianos que mantêm todos os elementos necessários à sua própria replicação e que foram absorvidos por outra bactéria. Assim, os
plasmídeos são considerados elementos genéticos móveis, ou seja, eles podem ser transferidos (ou transportados) de uma célula a outra,
ou adquiridos a partir do ambiente.
Normalmente, as bactérias conseguem sobreviver sem plasmídeos – por isso, são considerados como extracromossomais –, mas, por vezes,
a informação codificada neles oferece vantagem em ambientes seletivos.
 
Fonte: Shutterstock.com
 EXEMPLO
Por exemplo, um plasmídeo pode ter uma sequência de DNA que codifique uma proteína de canal, que, por sua vez, confere resistência a
certo antibiótico. Ao entrar em uma célula que esteja sob pressão seletiva pelo tal antibiótico – ou seja, uma célula que esteja lutando para
sobreviver ao antibiótico –, a aquisição desse plasmídeo conferirá resistência, e a bactéria poderá sobreviver facilmente.
Como comentamos anteriormente, os plasmídeos são autônomos em sua replicação e, por isso, precisam ter determinados elementos que
permitam sua duplicação e expressão independentemente do momento em que a célula se encontre.
Um plasmídeo criado em laboratório com o mínimo de informação necessária para ser funcional contém três regiões:

1
A origem de replicação, que a DNA-polimerase da sua célula-hospedeira bacteriana reconhece e onde todos os fatores necessários à
abertura da forquilha de replicação se ligam.
2
Um gene de resistência a antibiótico, que auxilia na seleção das bactérias que contêm o plasmídeo.


3
O sítio múltiplo de clonagem (multiple cloning site – MCS), que deve incluir um promotor gênico, diversos sítios de restrição por diferentes
enzimas e um terminador (Figura 11).
PROMOTOR GÊNICO
Promotor gênico é uma sequência curta no DNA que precede o gene e sinaliza à maquinaria celular de transcrição de RNA o local a
que ela deve se ligar para encontrar o início do gene.
TERMINADOR
Terminador gênico é uma sequência curta que define o sitio de finalização da transcrição para liberar a maquinaria de transcrição.
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Representação esquemática de um vetor comum, o plasmídeo. / Foto: Michael Jeltsch - Own work / https://commons.wikimedia.org/ /CC BY-
SA 4.0©
 Figura 11. Representação esquemática de um vetor comum, o plasmídeo.
 ATENÇÃO
Lembre-se de que essas são as regiões mínimas à replicação em uma bactéria e que seu organismo hospedeiro pode ser um eucarioto
(leveduras, células animais e vegetais), que pode requerer outras regiões para replicação do plasmídeo e sua expressão. Por exemplo,
devemos sempre priorizar o uso de promotores gênicos derivados de leveduras, caso nosso sistema hospedeiro seja a levedura, e de usar
promotores e potenciadores preferencialmente virais para células de mamífero, em adição à origem de replicação e um marcador de seleção
de eucariotos.
Os plasmídeos são amplamente usados em biotecnologia e em clonagem molecular, por serem resistentes ao ambiente, facilmente inseridos
dentro de células procarióticas (bactérias) e eucarióticas (como leveduras, células animais e vegetais) e de fácil manipulação. Os plasmídeos
podem ter tamanho total entre alguns milhares a dezenas de milhares de pares de base e podem conter insertos de tamanhos variados,
desde que o tamanho total do plasmídeo permaneça inferior a 10 mil pares de base (10 kb), muito embora alguns plasmídeos permitam
insertos de até 15 kb.
Existem situações em que pode ser necessário usar insertos maiores, e, nesses casos, outros sistemas podem ser usados. Por exemplo, o
sistema de cosmídeos permite insertos de até 50 kb, pois sua composição genética é uma mistura entre plasmídeos e bacteriófagos.
Entretanto, cosmídeos exigem que seu genoma seja empacotado, ou seja, que uma camada de proteína chamada capsídeo viral recubra o
DNA do cosmídeo, para protegê-lo e para que haja infecção de novas células. Outras opções são os cromossomos artificiais bacterianos
(Bacterial Artificial Chromosome – BAC) ou de levedura (Yeast Artificial Chromosome – YAC), para insertos de tamanho superior a 100 kb.
BACTERIÓFAGOS
São vírus capazes de infectar bactérias, injetando o material genético viral através da parede celular até o citoplasma da bactéria.
PASSO 3: ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM
Uma vez que conheçamos a sequência do nosso inserto, e tenhamos escolhido o vetor que melhor se adeque às nossas necessidades,
podemos começar a clonagem. Para isso, vamos explorar duas estratégias principais. A primeira baseia-se na digestão do DNA e utiliza as
chamadas enzimas de restrição. A segunda, mais recente, utiliza apenas PCR. Vamos explorá-las com detalhes a seguir.
Clonagem por restrição
As enzimas de restrição são capazes de reconhecer sequências internas e muito especificas do DNA fita dupla e cortá-lo ao clivarem a
ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos, e, por isso, são classificadas como endonucleases − endo = interno; nucle = núcleo (relativo ao
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DNA); ase = enzimas. Elas são encontradas na natureza em bactérias e funcionam como um sistema de defesa bacteriano contra DNA
invasores potencialmente perigosos, como o DNA de bacteriófagos (vírus que infectam e matam as bactérias).
Existem dois tipos de enzimas de restrição, baseado em como o corte, ou clivagem, do DNA é feito:
BLUNT END (EM TRADUÇÃO LIVRE, “EXTREMIDADE PLANA” OU “LISA”).
A endonuclease pode reconhecer o seu sítio de clivagem e cortar as duas fitas de DNA no mesmo ponto.
STICKY END (EM TRADUÇÃO LIVRE, “EXTREMIDADE GRUDENTA, PEGAJOSA”).
A enzima pode cortar o DNA fita dupla com uma diferença de poucos nucleotídeos entre as fitas complementares, deixando esses poucos
nucleotídeos em fita simples, o que torna muito mais fácil o pareamento por complementariedade entre as bases nitrogenadas. Esse
método é preferível ao primeiro (Figura 12).
 
Foto: Camila Freze.
 Figura 12. Ilustração representando clivagem por enzima de restrição “sticky” ou “pegajoso” e clivagem “blunt”, ou “plano”.
Para usar o método de clonagem por enzimas de restrição, tanto nosso inserto quanto nosso vetor precisam ter sítios de clivagem pela
enzima de restrição de nossa escolha. É de extrema importância que o sítio de restrição (ou clivagem) no vetor seja único, caso contrário ele
será digerido em diversos fragmentos não funcionais, e nossa clonagem não funcionará (Figura 13).
 
Foto: Camila Freze.
 Figura 13. Ilustração exemplificando sítio de clivagem para enzimas de restrição “sticky” (esquerda) e “blunt” (direita). Na foto, são
exemplificadas enzimas de restrição.
Caso nosso inserto não possua o sítio de restrição naturalmente em suas extremidades, podemos colocar a sequência que a enzima
reconhece nas extremidades durante a amplificação por PCR. Para isso, basta acrescentarmos o sítio de restrição às extremidades dos
iniciadores. Em seguida, faremos a digestão do inserto e do vetor pela mesma enzima de restrição em microtubos separados. A reação de
digestão é normalmente feita a 37°C por uma hora, muito embora a reação possa ser deixada de um dia para o outro para aumentar a
digestão.
Uma vez que a restrição tenha acontecido, veremos se o vetor foi linearizado – lembre-se de que ele era circular – pela eletroforese em gel
de agarose. Esperamos ver apenas uma banda, mais abaixo que a banda do plasmídeo não digerido, pois o DNA linear migra mais
rapidamente que o circular. Se virmos mais de uma banda no gel, será porque nossa enzima de restrição encontrou mais de um sítio de
clivagem no vetor. Isso pode ser o que você deseja, caso queira remover uma sequência primeiro para, depois, colocar seu inserto no local.
Para evitar que o vetor digerido volte a ser um círculo (já que as extremidades digeridas são complementares entre si, especialmente se uma
única enzima de restrição para as duas extremidadesestiver sendo usada), devemos usar fosfatases, para remover o fosfato nas
extremidades 5’, o que impede a circularização espontânea.
 ATENÇÃO
Lembre-se de usar a fosfatase apenas no tubo do vetor, e não no do inserto. Essa é uma boa forma de controle de qualidade da nossa
digestão e para assegurar que nossa clonagem será bem-sucedida.
Em seguida, precisamos fazer a ligação entre as extremidades do nosso inserto e as do vetor linearizado – ou seja, precisamos colocar o
inserto no vetor. As “pontas grudentas”, em que há alguns poucos nucleotídeos com bases nitrogenadas livres, conseguem parear por
complementariedade. Assim, a extremidade 5’ do inserto pareará com a extremidade 3’ do vetor e a extremidade 3’ do inserto com a 5’ do
vetor.
No entanto, o pareamento das bases não será suficiente para que uma ligação estável aconteça, pois a complementariedade das bases se
dá por pontes de hidrogênio facilmente desfeitas pelo calor. Para termos uma ligação estável, precisamos que ela seja covalente, o que
significa que precisamos fazer a ligação fosfodiéster entre as extremidades 5’ e 3’ das duas fitas pareadas. Para isso, usamos uma enzima
chamada DNA ligase (Figura 14).
 
Foto: Camila Freze
 Figura 14. DNA ligase que forma ligação fosfdiéster entre as fitas complementares do vetor e do inserto, após digestão por enzimas de
restrição.
Clonagem livre de restrição
A segunda estratégia que podemos usar é chamada de clonagem livre de restrição (restriction free cloning – RFC).
1
2
3
Nessa opção, não precisamos de enzimas de restrição.
Nela, amplificamos o DNA do inserto em uma PCR especial, que utiliza oligonucleotídeos iniciadores com duas regiões: a região 3’ é usada
para amplificar o inserto, pois o reconhecem e se anelam a ele; e a região 5’ é uma região complementar ao vetor, que será usada na
segunda etapa da RFC.
Por isso, os primers para RFC são maiores que os iniciadores convencionais, com comprimento médio de 50 pb, sendo que 25 pb devem se
anelar ao inserto e os 25 pb restantes ao vetor.
 ATENÇÃO
Na prática, é importante que as duas regiões dos iniciadores senso e antissenso tenham aproximadamente a mesma temperatura de
anelamento para que a PCR funcione. Usaremos esses oligonucleotídeos para amplificar o inserto e, ao mesmo tempo, adicionar a ele uma
região de complementariedade ao vetor. Existe ainda a possibilidade de seu inserto ser pequeno o suficiente para estar contido dentro de
iniciadores um pouco mais longos, o que reduz a RFC a apenas uma PCR.
A ciclagem da PCR em si é praticamente a mesma que qualquer outra, com temperaturas de desnaturação, anelamento e extensão padrões
– lembrando que o tempo de extensão depende do tamanho do amplicon (Default tooltip) a ser gerado.
Como queremos amplificar um vetor de clonagem com milhares de pares de base, cada extensão deverá ter 1 minuto por kb – ou seja, para
um plasmídeo de 7 kb, serão 7 minutos de extensão por ciclo. Como em uma PCR convencional, validaremos a reação vendo o amplicon de
tamanho desejado na eletroforese em gel de agarose.
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2
3
4
A ciclagem vai ser um pouco diferente da PCR convencional, pois usamos menos ciclos, uma vez que a longa fita consumirá os reagentes
rapidamente. Em seguida, iremos purificar esse produto de PCR para eliminar os reagentes de PCR e usá-lo em uma segunda reação, como
o mega-primer: as extremidades do nosso inserto irão anelar com as extremidades complementares do vetor.
Além disso, podemos fazer a RFC-PCR sem temperatura de anelamento, usando apenas uma extensão a 72°C. Para essa segunda PCR,
precisamos usar o mega-primer; o vetor da nossa escolha; Taq polimerase, de preferência uma adequada para polimerização de longas fitas;
e dNTPs.
Como os iniciadores são maiores, sua temperatura de anelamento também será maior e mais próxima à de extensão.
Finalmente, o vetor parental deverá ser digerido por uma enzima chamada Dpn1, uma endonuclease que apenas reconhece e cliva o DNA
metiladol – como o DNA amplificado por PCR não contém grupamento metil, nosso DNA recombinante fica intacto, enquanto o vetor
parental, que havia sido purificado depois de replicado na bactéria, é digerido (Figura 15).
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DNA METILADO
DNA com adição de grupamentos metil, decorrentes da replicação in vivo.
 
 Figura 15. Representação esquemática da clonagem livre de restrição.
A partir da Figura 15, podemos ver que os iniciadores usados na primeira PCR (amplificação de inserto) possuem regiões sobrepostas para
posterior anelamento ao vetor (2º PCR).
Uma vez que tenhamos inserido nossa sequência de interesse em um vetor, quer usando enzimas de restrição, quer não, precisamos
verificar se nosso inserto está presente. Para isso, fazemos uma PCR com um iniciador senso que se anele próximo ao sítio de clonagem e
um iniciador antissenso que se anele à sequência do inserto.
Esperamos que essa PCR de detecção do DNA recombinante funcione e nos dê uma banda única, do tamanho esperado para o intervalo
entre os primers. Esse é o controle de qualidade da clonagem, que vamos repetir mais à frente. Estamos prontos, então, para colocar esse
vetor recombinante dentro de uma bactéria. Essa etapa é necessária para que mais vetores sejam produzidos, mesmo que nosso hospedeiro
final não seja a bactéria. Assim, conseguiremos quantidade de vetores suficientes para outros hospedeiros.
PASSO 4: TRANSFORMAÇÃO, SELEÇÃO DOS CLONES RECOMBINANTES E
MULTIPLICAÇÃO
Para colocar nosso vetor recombinante dentro de uma célula, usamos uma técnica chamada de transformação − processo de aquisição
horizontal de DNA exógeno do meio ambiente que algumas bactérias possuem. A principal bactéria usada em clonagem molecular é a
Escherichia coli, um bacilo Gram-negativo com fácil multiplicação e manutenção em cultura, alta eficiência de transformação e que possui
cepas usadas em laboratório que não são patogênicas. No entanto, a E. coli não é naturalmente capaz de adquirir DNA a partir do meio.
Para ser passível de transformação, precisamos fazer como que a E. coli seja competente. Conseguimos isso ao congelarmos
instantaneamente as células, usando nitrogênio líquido e na presença de tampão rico em cálcio, que fará com que a parede celular da E. coli
fique permeável e apresente pequenos orifícios para a entrada do DNA durante a transformação.
Após tornarmos a E. coli competente para a entrada do DNA exógeno na célula, podemos transformar nosso vetor recombinante. A
transformação bacteriana mais comumente usada é a de choque térmico. As células que estão congeladas serão descongeladas e
misturadas com o DNA do vetor plasmidial. Tudo isso deve ser feito em gelo; caso contrário, a célula perderá sua competência.
Após curta incubação em gelo, fazemos o choque térmico ao colocarmos as bactérias na temperatura de 42°C por menos de 1 minuto,
seguido de banho de gelo por mais uns poucos minutos. Então, fazemos a semeadura das bactérias transformadas em placa de cultivo
bacteriano seletivo. No dia seguinte, após deixarmos nossa placa em incubadora de 37°C, veremos o surgimento de colônias, cada uma
correspondendo à expansão clonal de um único transformante − bactéria que foi transformada (Figura 16).
 
Foto: Amunroe13 - Own work/ CC BY-SA 3.0 ©
 Figura 16. Representação da transformação bacteriana.
Ao analisarmos a Figura 16, vemos que, após congelamento instantâneo de bactéria sensível a antibiótico (1), a parede celular fica
permeável (2). Assim, o plasmídeo é incubado com a bactéria e pode entrar mediante o choque térmico (3). Os clones que tiveram uma
transformação bem-sucedida são capazes de crescer sob seleção, ou seja, tornam-se resistentes ao antibiótico presente na placa pela
aquisição do plasmídeo (4).
A transformação é diretamente proporcional à quantidade de DNA plasmidial: quanto mais DNA, maior o número de colônias no final. Por
isso, tenha em mente que DNA em excesso pode ser tão prejudicial quanto em escassez, pois pode não ser possível diferenciar as colôniasbacterianas no final nem separar seus clones.
Entretanto, é importante sabermos que a transformação para clonagem tem eficiência muito mais baixa do que a transformação apenas para
expansão do vetor (ou seja, apenas para aumentarmos a quantidade que temos de determinado plasmídeo). Por isso, normalmente
tentamos obter e usar o máximo de DNA para a transformação durante a clonagem.
A entrada do vetor na E. coli competente precisa distinguir a célula na qual a transformação foi bem-sucedida da que não foi. Portanto,
usamos alguns marcadores de seleção que estão presentes nos vetores e que farão a distinção entre as bactérias. O marcador de seleção
mais usado é o antibiótico ampicilina. A ampicilina é um antibiótico derivado da penicilina, capaz de matar bactérias e usado em infecções
bacterianas comuns. As espécies de E. coli são sensíveis à ampicilina, o que significa que essas bactérias morrem na presença do
antibiótico.
Vamos aprender mais sobre esse assunto no tópico a seguir.
SELEÇÃO POR ANTIBIÓTICO
A maioria dos plasmídeos usados em clonagem molecular possuem o gene que codifica resistência ao antibiótico ampicilina. Dessa forma,
apenas as E. coli que adquiriram o vetor serão resistentes à ampicilina e capazes de crescer em cultura. Portanto, usamos as colônias de
clones bacterianos que cresceram em ampicilina, pois apenas estes apresentam o vetor (rever Figura 16). Entretanto, precisamos, ainda,
checar se nosso vetor está vazio ou se contém nosso inserto.
Para isso, selecionaremos várias colônias para verificarmos mais uma vez se a clonagem molecular funcionou, usando a PCR de detecção
do DNA recombinante. Apenas os clones cuja banda do vetor-inserto estiver presente serão usados para purificação do plasmídeo.
A purificação do plasmídeo recombinante é uma extração de DNA por coluna, a partir de bactérias, podendo ser feita rapidamente com uso
de kits. Uma vez purificado, um bom controle de qualidade é enviar o plasmídeo para Sequenciamento Sanger, a fim de verificarmos se
nosso inserto está incorporado de forma correta no vetor e se nenhuma mutação indesejada ocorreu durante a duplicação bacteriana.
SELEÇÃO AZUL-BRANCA
Neste método de clonagem, é possível distinguir visualmente não apenas quais colônias de clones bacterianos tiveram o plasmídeo
transformado com sucesso (com o uso de antibióticos), mas também quais clones tiveram o inserto integrado ao vetor com sucesso.
Para entender como isso funciona, vamos conhecer alguns detalhes.
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A bactéria E. coli possui uma enzima chamada beta-galactosidase, codificada por um dos genes presente em uma estrutura de genes
expressos contiguamente em um único mRNA chamado operon lac.
A expressão desse operon é induzida pela presença de lactose no meio e expressa a enzima beta-galactosidade; é reprimida por um
composto chamado IPTG (isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranosideo).
Quando a beta-galactosidase é expressa, ela cliva (quebra) um composto, chamado x-gal, em galactose e em um corante azul insolúvel.
A beta-galactosidase contém um segmento, chamado peptídeo-alfa, para ser funcional e clivar o x-gal.
No plasmídeo usado nesse sistema, a beta-galactosidase não contém esse segmento, mas ele está presente em outra região, no sítio de
clonagem múltipla (MCS). Esse é o sítio no qual o nosso DNA-alvo deve ser inserido.
Caso o inserto seja adicionado com sucesso, ele o fará no meio da sequência do peptídeo-alfa, impedindo que este último seja expresso.
Portanto, a beta-galactosidase não será capaz de clivar x-gal, e o corante azul não será feito. Nesse caso, o inserto é detectado pela falta do
corante azul, o que torna a colônia de clones branca.
Caso o inserto não tenha sido inserido com sucesso, o gene do peptídeo-alfa permanece intacto, e a beta-galactosidase poderá usá-lo e
clivar x-gal, produzindo o composto azul. Dessa forma, as colônias negativas, em que a clonagem não ocorreu, serão azuis (Figura 17).
 
 Figura 17. Esquema simplificado da seleção azul-branca. As colônias cujo inserto foi integrado ao plasmídeo crescem na cor branca.
 SAIBA MAIS
A purificação do plasmídeo recombinante poderá ser feita e, apesar de não ser absolutamente necessária, é recomendável fazer o
sequenciamento do inserto.
Neste vídeo, você conhecerá um pouco sobre a clonagem molecular.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE POSSUI MUITAS APLICAÇÕES EM MEDICINA, AGRONEGÓCIOS
E BIOTECNOLOGIA. SOBRE DNA RECOMBINANTE, É INCORRETO AFIRMAR QUE:
A) As bactérias podem ser usadas como fábricas para proteínas de origens exógenas.
B) O DNA recombinante consiste na união de sequências de DNA de duas ou mais origens diferentes.
C) Podemos produzir vacinas seguras e eficazes a partir de leveduras, por meio da recombinação de DNA.
D) A diabetes mellitus do tipo I pode ser controlada pelo o do uso de insulina produzida por tecnologia do DNA recombinante.
E) A clonagem molecular não é útil na modificação de organismos pluricelulares, pois não gera organismos estáveis.
2. PARA A CLONAGEM MOLECULAR, PRECISAMOS DE UM INSERTO, UM VETOR E UM HOSPEDEIRO.
SOBRE A CLONAGEM MOLECULAR, É CORRETO AFIRMAR QUE:
A) Os plasmídeos são vetores autorreplicativos nos quais inserimos um DNA exógeno a ser clonado.
B) Chamamos de transformação o processo de transformar organismo selvagem em geneticamente modificado.
C) Bactérias não são bons organismos hospedeiros, pois são incapazes de fazer transformação.
D) As enzimas de restrição são usadas na clonagem para sintetizar novas sequências de DNA, pela sua capacidade sintetase.
E) Os clones são selecionados baseados em sua semelhança fenotípica em microscopia ótica.
GABARITO
1. A tecnologia do DNA recombinante possui muitas aplicações em medicina, agronegócios e biotecnologia. Sobre DNA
recombinante, é incorreto afirmar que:
A alternativa "E " está correta.
 
Uma das maiores e mais lucrativas aplicações da tecnologia do DNA recombinante é o desenvolvimento de organismos complexos, como
plantas e animais, chamados de organismos geneticamente modificados.
2. Para a clonagem molecular, precisamos de um inserto, um vetor e um hospedeiro. Sobre a clonagem molecular, é correto afirmar
que:
A alternativa "A " está correta.
 
Vetores de clonagem molecular são DNAs circulares extracromossomais, dispensáveis à sobrevivência da célula na ausência de pressão
seletiva, e que são replicados de forma independente por possuírem todos os elementos básicos à replicação, como origem, promotores e
terminadores.
MÓDULO 3
 Identificar os métodos de hibridização de ácidos nucleicos, suas diferenças e aplicações na rotina do biologista molecular
TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO
As técnicas de hibridização consistem na identificação de sequências de DNA fita simples ou RNA específicas por meio de seu pareamento
por complementariedade – ou hibridização – com sequências sintéticas. O termo hibridização pode ser, por vezes, equivalente ao
pareamento por complementariedade. Assim, pode-se dizer que os oligonucleotídeos iniciadores hibridizam com o DNA-alvo em uma PCR.
Para definirmos melhor o conteúdo a ser abordado neste módulo, vamos falar de técnicas de hibridização que não se baseiam na
amplificação do DNA pela Taq polimerase.
Para detectar o DNA fita simples ou RNA nesse grupo de técnicas, usamos oligonucleotídeos marcados, chamados de sondas.
Na maioria das aplicações de técnicas de hibridização, desenhamos sondas que cubram a maior extensão possível de nosso gene,
sequência ou mensageiro de interesse.
Tais sondas podem ser curtas ou longas, e são normalmente marcadas com isótopos radioativos, enzimas, anticorpos, substratos ou com
fluoróforos, dependendo da técnica em questão.
Dessa forma, podemos classificar os métodos de revelação em métodos diretos e indiretos:
DIRETOS
Em métodos diretos, as sondas são marcadas diretamente com o emissor de sinal (por exemplo, radioisótopos ou fluoróforos) e são,
portanto, proporcionais à quantidade de moléculas existentesna amostra analisada.
INDIRETOS
Em indiretos, as sondas estão marcadas com agentes intermediários que são usados para aumentar o sinal emitido (como enzimas,
substratos e anticorpos).
Técnicas de transferência (blottings)
Existe um grupo de três técnicas de hibridização chamadas blots (manchas, em inglês), que são baseadas na separação das
macromoléculasalvo (DNA, RNA ou proteínas), desnaturação e transferência para uma membrana porosa que permitirá a hibridização
com as sondas para revelação.
Vamos conhecer cada uma dessas técnicas em detalhes a seguir.
Southern blotting
Criada pelo bioquímico britânico Edwin Southern, em 1975, recebe o seu nome. Nessa técnica, identificamos sequências específicas de
DNA.
1
2
3
Para isso, precisamos, primeiro, extrair o DNA total da nossa célula ou do tecido e digeri-lo usando enzimas de restrição.
Uma vez que o DNA tenha sido fragmentado, podemos separá-lo usando eletroforese, que pode ser feita em gel de agarose ou em
poliacrilamida, dependendo da resolução que se queira.
Em suma, a eletroforese é feita da mesma forma que a usada para ler o produto da amplificação de uma PCR, e podemos ler seu resultado
ao adicionarmos brometo de etídio ao gel.
 ATENÇÃO
Lembre-se de que a eletroforese separa as moléculas de DNA de acordo com o tamanho através da sua migração pelo gel em direção ao
polo positivo (ou cátodo), que acontece quando ele é submetido à corrente elétrica em tampão aquoso.
Após a separação por eletroforese e leitura em transiluminador ultravioleta, o DNA é desnaturado (em fitas simples) em solução alcalina por
cerca de meia hora, e então é neutralizado de volta a pH 7. Então, podemos proceder para a transferência do DNA do gel para a membrana
porosa, feita de nitrocelulose ou nylon.
Para isso, precisamos montar uma espécie de sanduíche, no qual as duas “fatias de pão” são placas de vidro, cada uma acompanhada por
papel absorvente do lado de dentro, e o gel em contato com a membrana porosa como “recheio”. O sanduíche deve sempre ser montado
dentro de uma cuba contendo o tampão de transferência, de forma que todos os componentes fiquem encharcados e nenhuma bolha de ar
fique presa. Isso porque as bolhas de ar impedem a transferência, formadas quando o tampão aquoso é submetido a corrente elétrica – por
isso, usamos papel absorvente para manter a membrana e o gel em contato com o tampão durante todo o período de transferência, que pode
levar mais de três horas dependendo do tamanho dos fragmentos digeridos. Após a transferência, o DNA fica fixado na membrana, que pode
ter seus sítios de ligação inespecífica bloqueados e pode ser armazenada por longos períodos em geladeira.
 ATENÇÃO
Para a etapa de hibridização propriamente dita, usamos sequências conhecidas, as sondas. As sondas são complementares às sequências-
alvo e se anelam a elas, fazendo parte do sistema de detecção do sinal. Tanto as sequências-alvo quanto as sondas podem ser feitas de
DNA ou de RNA.
Originalmente, eram usadas sequências de RNA produzidas em células a partir de DNA recombinante e tratadas momentaneamente com
radioisótopos – por isso, a técnica era chamada de hibridização, pelo uso de híbridos de DNA-RNA. Com o uso de oligonucleotídeos
sintéticos, as sondas de DNA têm substituído as de RNA, pois são mais estáveis que as últimas.
A membrana deve ficar imersa em solução contendo a sonda, em agitação, por pelo menos uma hora. Após essa incubação, a membrana é
lavada, e todas as sondas que não se ligaram por complementariedade ao DNA desnaturado em fita simples serão removidas do sistema,
restando apenas aquelas que se anelaram ao DNA.
 
Foto: CNX OpenStax/ CC-BY-4.0 ©
 Figura 18. Etapas de separação, transferência e hibridização do Southern Blotting, para identificação de DNA.
A leitura da hibridização dependerá da forma como as sondas foram marcadas. Caso tenhamos usado radioisótopos, precisamos revelar
usando filmes de raios X, em que a radioatividade marcará uma impressão.
Caso decidamos usar sondas fluorescentes, colorimétricas ou quimioluminescentes, precisamos revelá-las de acordo. Essas últimas opções
são preferíveis à primeira, por serem mais seguras para o manipulador e o meio ambiente.
Na revelação colorimétrica, a sonda está marcada com um substrato que é usado por uma enzima, em uma etapa adicional, para produção
de um composto colorido. Assim, a posição da sonda pode ser visualizada a olho nu. As sondas fluorescentes precisarão de leitura em
aparelho especializado, que excitará o fluoróforo e permitirá a identificação do local onde a sonda está.
No método quimioluminescente, temos uma enzima que catalisa uma reação, cujo produto emite luz em determinado comprimento de onda
(dependendo de qual enzima reveladora for usada) e, por isso, também precisamos de aparelho para leitura da reação.
Neste vídeo, você conhecerá um pouco sobre as técnicas de hibridização.
Northern blotting
O Northern blotting é uma técnica de hibridização para identificação de sequências específicas de RNA, dentre uma mistura complexa de
ácidos nucleicos, cujo nome é derivado da técnica desenvolvida para DNA (Southern blotting).
O Northern blotting pode ser usado para avaliar a presença e a quantidade da expressão de determinado gene, assim como avaliar se o
mRNA está associado a proteínas, após a purificação das últimas.
Os mesmos princípios da técnica de Southern blotting são usados para o Northern blotting. Conheça:

1
Iremos desnaturar e separar o RNA total extraído por eletroforese em gel de agarose contendo formaldeído − um composto químico que
usamos para fixação e preservação da amostra, que é especialmente útil quando trabalhamos com RNA.
2
Em seguida, iremos transferi-lo do gel para a membrana de nitrocelulose ou nylon. Para isso, montamos o mesmo sanduíche, contendo a
membrana e o gel no meio, dentro de folhas de papel absorvente e com as placas de vidro como “pão”.


3
Após a transferência ocorrer e fixarmos o RNA, passamos à etapa de hibridização das sondas e revelação do resultado, de acordo com a
marcação das sondas usadas (Figura 19).
 
Foto: Ilewieszoośmiornicach - Own work/ commons.wikimedia.org©
 Figura 19. Esquema ilustrando a técnica de Northern blot.
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
A hibridização in situ (in situ hybridization – ISH) foi uma das primeiras técnicas de biologia molecular a ser aplicada ao diagnóstico clínico de
doenças.
Ela permite a detecção e a quantificação de ácidos nucleicos em cortes histológicos especiais e cultivos celulares e nos informa onde o ácido
nucleico investigado está localizado dentro da célula e do tecido.
A ISH tem sido usada para diagnóstico citogenético e de doenças infecciosas, como no caso da infecção pelo papilomavírus humano (HPV),
causador do câncer do colo do útero, em cérvice uterina. Outros exemplos de aplicação da ISH incluem a detecção de cromossomos
aberrantes, com alterações como duplicações, deleções e inserções genômicas que não deveriam existir e que podem causar doenças,
como ocorre na distrofia muscular de Duchenne, na fibrose cística e em alguns tipos de câncer.
 
Fonte: Ryan Jeffs / Wikimedia Commons / License 3.0
A ISH originalmente usava isótopos radioativos para marcação das sondas. Porém, com o desenvolvimento de marcadores fluorescentes
mais seguros, a ISH evoluiu para FISH (fluorescent in situ hybridization, ou hibridização in situ fluorescente). As outras abordagens de leitura
do sinal vistas nos blottings, como quimioluminescência e colorimetria, também podem ser usadas em ISH, porém são menos difundidas que
a FISH.
Já que trabalhamos com tecidos ou células em cultivo, a leitura dos resultados normalmente é feita em microscopia. Para isso, precisamos
ter um microscópio de fluorescência, capaz de excitar os fluoróforos e detectar o local de emissão da fluorescência com a precisão
necessária ao sistema.
Nesse caso, podemos usar microscópio com precisão na casa de nanômetros, ou seja, na casa de bilionésimo de um metro,algo em torno
de 0,000000001 metro (Figura 20).
 
Foto: Camila Freze.
 Figura 20. Representação esquemática das etapas da hibridização in situ fluorescente.
O primeiro ponto que avaliamos em uma IHS ou FISH é o desenho da sonda. Caso queiramos identificar uma sequência, um gene ou um
mRNA longo, podemos usar dezenas de sondas curtas, de cerca de 20 pb cada uma, que se anelem ao longo da sequência-alvo. Isso dá
grande especificidade ao método, além da ótima sensibilidade dada pelo aumento do sinal emitido, já que todas estarão marcadas.
Caso desejemos detectar uma região muito curta, na qual não poderemos sintetizar e anelar dezenas de sondas diferentes, podemos usar
uma técnica chamada de branched-FISH (ou FISH ramificado).
Nessa técnica, usamos oligonucleotídeos que tenham duas regiões:
1
A primeira é complementar à sequência-alvo, presente no tecido ou na célula.
2
E a segunda região, mais longa, é usada como alvo para as sondas marcadas se anelarem.
Com isso, conseguimos aumentar o sinal de detecção da sequência-alvo.
Como em outras técnicas de hibridização, na ISH ou FISH, precisamos desnaturar o DNA fita dupla em fitas simples. Como agora estamos
trabalhando com tecidos ou células fixados e aderidos a uma lamínula de microscopia, não podemos usar agentes que destruam o tecido,
como acontece se tratarmos ele com tampões extremamente alcalinos.
 ATENÇÃO
Por isso, a desnaturação do DNA normalmente é feita por calor controlado, de forma a não destruirmos a célula ou o tecido. Se nosso ácido
nucleico-alvo for RNA, não poderemos usar calor, então utilizamos um composto químico chamado de formamida para desnaturação de
proteínas que possam estar ligadas ao RNA, liberando-o para a hibridização.
Precisamos ainda considerar como as sondas entrarão nas células, e isso depende diretamente do material que estamos usando e da
natureza das células. Se estivermos fazendo FISH para células ou tecidos de mamíferos, permeabilizamos as membranas plasmáticas
usando álcool (etanol) e detergentes suaves (Triton 0.1%). Caso trabalhemos com leveduras, precisamos permeabilizar uma estrutura mais
resistente, a parede celular, o que fazemos usando digestão enzimática da parede.
Finalmente, podemos fazer a hibridização, ao incubar nossa amostra fixada, desnaturada e permeabilizada com as sondas marcadas. Após
lavagens para remover o excesso de sondas, podemos montar nossa lâmina de microscópio e observar a presença de nosso DNA ou RNA-
alvo ao excitarmos os fluoróforos das sondas e detectarmos o sinal emitido por eles. Em muitos casos, vamos querer obter imagens e salvá-
las, para não somente detectar a presença ou ausência do sequência-alvo, mas também quantificar o sinal e sua intensidade, determinar sua
localização, analisar os dados e emitir os resultados (Figura 21).
 
Foto: MrMatze - Own work/commons.wikimedia.org©
 Figura 21. Esquema ilustrando a FISH usando como agente desnaturante a formamida e um sistema de revelação pelo método indireto
(com a utilização de um anticorpo).
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. AS TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO DE DNA E RNA FORAM UMAS DAS PRIMEIRAS A SEREM USADAS E
APLICADAS EM BIOLOGIA MOLECULAR. SOBRE HIBRIDIZAÇÃO, SELECIONE A OPÇÃO CORRETA:
A) As técnicas de blotting baseiam-se na separação de DNA ou RNA amplificados in vitro e na transferência para membranas de
nitrocelulose.
B) O northern blot foi desenvolvido para separação e identificação de proteínas, DNA e RNA, podendo ser usado igualmente para as três
moléculas.
C) As amostras usadas em técnicas de hibridização devem estar frescas e as células, vivas, senão a técnica não irá funcionar.
D) As moléculas-alvo de hibridização precisam estar fixadas em suporte de vidro, encharcadas em tampão, para que a hibridização aconteça.
E) A hibridização corresponde ao anelamento por complementariedade entre uma sonda marcada e o ácido nucleico da amostra.
2. A HIBRIDIZAÇÃO IN SITU (ISH) É USADA NO DIAGNÓSTICO DE DIVERSAS DOENÇAS GENÉTICAS E
INFECCIOSAS. A RESPEITO DA ISH E SUAS VARIAÇÕES, É INCORRETO AFIRMAR QUE:
A) As sondas são desenhadas de forma a cobrirem a menor área possível do gene ou sequência-alvo.
B) As sondas são marcadas com radioisótopos, enzimas, substratos ou fluoróforos para posterior identificação.
C) As ISH são úteis para a detecção, localização e quantificação da sequência-alvo.
D) A hibridização in situ fluorescente (FISH) exige leitura em microscópio de fluorescência para obtenção dos resultados.
E) Na FISH, usamos agentes desnaturantes dos ácidos nucleicos, como o calor, e fixadores, como o formaldeído.
GABARITO
1. As técnicas de hibridização de DNA e RNA foram umas das primeiras a serem usadas e aplicadas em biologia molecular. Sobre
hibridização, selecione a opção correta:
A alternativa "E " está correta.
 
As técnicas de hibridização baseiam-se na capacidade de bases nitrogenadas em uma fita simples formarem pontes de hidrogênio com
bases nitrogenadas de outras fitas de forma específica. Conhecemos essa capacidade como pareamento por complementariedade e a
identificamos pela marcação das sondas para identificação posterior.
2. A hibridização in situ (ISH) é usada no diagnóstico de diversas doenças genéticas e infecciosas. A respeito da ISH e suas
variações, é incorreto afirmar que:
A alternativa "A " está correta.
 
As sondas usadas em ISH são sequências de DNA curtas e marcadas. Para que tenhamos a especificidade – dada pela ligação das sondas
ao DNA-alvo – e sensibilidade – dada pela capacidade de detecção do sinal −, precisamos usar o máximo de sondas marcadas, o que
significa que o máximo do gene deve estar coberto por sondas.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste tema, aprendemos como as grandes contribuições do conhecimento do genoma humano e de outros organismos foram feitas pelas
técnicas moleculares. Vimos também o sequenciamento, um conjunto de diferentes técnicas que visam descobrir a sequência de
nucleotídeos presentes no DNA. Dentre esse conjunto de técnicas, exploramos o sequenciamento Sanger e o sequenciamento de nova
geração.
Visitamos também a tecnologia do DNA recombinante, aprendendo todas as etapas da clonagem molecular, a escolha do segmento de
interesse, do vetor, da estratégia de inserção e de clonagem (por restrição ou livre de restrição), a transformação, seleção dos clones
recombinantes e sua multiplicação. Por fim, entendemos as técnicas de hibridização, que consistem na identificação de sequências de DNA
fita simples ou RNA específicas pelo pareamento por complementariedade com sequências sintéticas, abordando as técnicas de
transferências, Southern blotting e Northern blotting. Além disso, conhecemos a técnica de hibridização in situ.
Ao longo desta jornada, vimos como o sequenciamento, a clonagem e a hibridização de ácidos nucleicos permitiram avanços importantes na
ciência e como esses conhecimentos são aplicados em saúde, agropecuária e biotecnologia.
AVALIAÇÃO DO TEMA:
REFERÊNCIAS
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BAJPAI, B. High Capacity Vectors. Advances in Biotechnology. 1-10. 2013.
CRONAN, J.E. Escherichia coli as an Experimental Organism. In: eLS, John Wiley & Sons, Ltd., 2014.
FARACK, L.; ITZKOVITZ, S. Protocol for Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization for Intact Pancreatic Tissue. STAR
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GRIFFITHS, JAF. Recombinant DNA. Encyclopædia Britannica. 2020. Consultado em meio eletrônico em: 28 out. 2020.
HEATHER, J. M.; CHAIN, B. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics. 1(107),p 1-8. 2013.
HUBER, D. et al. Fuorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH? Micro and Nano
Engineering: 1 (2018) 15–24.
LIAO, Y. et al. RNA Isolation and Northern Blot Analysis. Bio-protocol 4(6), 2014 Consultado em meio eletrônico em: 6 nov. 2020.
SACRAMENTO STATE. Southern blotting: Probe labeling & Detection. Consultadoem meio eletrônico em: 6 nov. 2020.
SCITABLE BY NATURE EDUCATION. Plasmid definition. Consultado em meio eletrônico em: 30 out. 2020.
SOUTHERN, E. Southern blotting. Nat Protoc 1, 518–525 (2006).
VAN DEN ENT, F.; LOWE., J. RF cloning: A restriction-free method for inserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67
(2006) 67–74.
EXPLORE+
Para saber mais sobre os assuntos tratados neste tema, assista ao vídeo:
Aulas sobre sequenciamento, no canal de Siomar Soares, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Pesquise na internet:
O tópico de Biotecnologia e Clonagem de DNA, em conteúdo de biologia, no site da Khan Academy.
CONTEUDISTA
Camila Freze Baez
 CURRÍCULO LATTES
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