Relatório de Cultura de Tecidos

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RELATÓRIO DE AULAS PRATICAS DE LABORATORIO
	
Projeto de pesquisa apresentado ao Curso de Pós-graduação em Agronomia, Área de Concentração em Produção Vegetal, da Universidade Federal do Acre, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Agronomia. 
Orientador: xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
RIO BRANCO
2014
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 RELATÓRIO DE AULAS PRATICAS DE LABORATORIO
	
Relatório apresentado ao Curso de Pós-graduação em Agronomia, Área de Concentração em Produção Vegetal, da Universidade Federal do Acre, como parte das exigências para a obtenção de nota na disciplina de Cultura de tecidos
Orientador: xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
RIO BRANCO
2014
Data: 04 de Novembro de 2014
RELATORIO SOBRE NOÇÕES E PROCEDIMENTOS DO LABORATÓRIO DE CONSERVAÇÃO E PROPAGAÇÃO IN VITRO DE PLANTAS 
INTRODUÇÃO
A Biotecnologia é uma ferramenta auxiliar em programa de melhoramento de plantas, na obtenção de manipulação de células através de germoplasma desde a multiplicação de material, produção mudas isentas de doenças e disseminação de vírus. Bem como a conservação do germoplasma. Com o objetivo de produzir material genético com as mesmas características e heranças genéticas, que também pode ser estender ao aumento de variabilidade genética mediante as variações somaclonais e/ou indução de mutagênese e obtenção de plantas transgênicas. 
 
DESCRIÇÃO DA ATIVIDADE REALIZADA
Aula da disciplina de Cultura de tecidos ministrada pelo professor xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx, a recepção foi ao Laboratório de Conservação e propagação in vitro de plantas, a qual é responsável. Fomos orientados com o uso de jaleco na entrada do laboratório que é imprescindível, as vidrarias, os instrumentos de manipulação, a padronização de normas, procedimentos e orientações metodológicas, e os produtos que são utilizados para o desenvolvimento das pesquisas relacionadas à propagação vegetativa in vitro de espécies nativas e de importância econômica para a região da Amazônia Sul - Ocidental. O professor nos mostrou como era o ambiente organizacional do laboratório que deve ser assegurado ao máximo de isolamento do ambiente externo, a fim de evitar a entrada de agente contaminantes que possam inviabilizar o cultivo in vitro. Reforça ainda, algumas recomendações: a ideia da limpeza e limitação de pessoal que circundam as salas de manipulação e de crescimento com elevado nível de assepsia; Paredes lisas de cores clara para refletir luz e iluminação ambiente e que janelas não são necessárias, embora se houver necessidade dever ser tampada para controle de luz e evitar de animais e sujeira. A temperatura é um fator importante deve ser agradável, com exceção a sala de crescimento, onde a temperatura, umidade e luminosidade são controladas.
Um laboratório de cultura de tecidos deve ter alguns compartimentos: 
Sala de recepção ou ante-sala: ambiente que protege o laboratório do ambiente externo, onde são encontrados tapetes para limpezas dos calçados, armários para armazenamento de sacolas e bolsas, banheiros e sala de espera. No entanto, o laboratório não possui toda dependência necessária para um laboratório com suas seguintes dependência. Ressalta ainda, que no laboratório são tomadas a medidas necessárias de limpeza e assepsia do ambiente. Em seguida, fomos a sala de lavagem e esterilização, local destinado a descartes de meios de cultura e outros resíduos, lavagem de vidrarias, neste ambiente estão os equipamentos: autoclave, destilador(es), aparelho deionizador(es), lavadores com pias adaptadas para lavagem de vidrarias, esterilização de pinças e bisturis, bancadas e prateleiras e armários com produtos de limpeza e vidrarias e estufas de secagem. Esta sala é conjunta com área de preparo de meios, onde são feitos as soluções e meios de cultura com equipamentos necessários para preparo de meios: Balança de precisão e analítica, pHmetro, agitador magnético, micro-ondas, no entanto, mesmo em salas conjuntas, a área de preparo de meios fica mais isolada para que não evite contaminação com resíduos descartados. 
A sala de manipulação: local onde são realizadas a inoculações e tranferencias de matéria vegetal. Consiste de câmaras de fluxo laminar, bancada para estocagem de meios de culturas já autoclavados, soluções liquidas já esterilizadas. Nesse local estão aparelhos como microscópio estereoscópicos, lupas e câmeras fotográficas acopladas a estes equipamentos. 
A sala de crescimento de culturas, local com temperatura, umidade e luminosidade controlada, onde ficam os frascos com material vegetal em meio de cultura estocadas em fileiras em estantes metálicas com luzes fluorescentes e camaras de BOD (Byosistem Organized Development), esse ambiente deve esta sempre fechado e com entrada restrita.
Data: 11 de Novembro de 2014
PREPARO DE SOLUÇÕES-ESTOQUE: PROCEDIMENTOS DO LABORATORIO DE CULTURA DE TECIDOS. 
INTRODUÇÃO 
O preparo de soluções-estoque tem objetivo em facilitar e diminuir o custo, no preparo dos meios de cultura com a dosagem precisa de macro e micronutrientes. É recomendável montar estoques de sais minerais (conjuntos de macronutrientes e micronutrientes), Fe-EDTA (frasco envolvido em papel alumínio devido sensibilidade a luminosidade), misturas orgânicas, vitaminas e reguladores de crescimento e mantidos em geladeira, principalmente aquelas que apresentam precipitações. Agentes reguladores osmóticos como sacarose, manitol, sorbitol e os agentes gelificantes são pesados e preparados no momento do preparo do meio depois do ajuste do pH recomendado pela cultura. 
DESCRIÇÃO DE ATIVIDADES
Preparo solução estoque 1 - Nitrato de Amônio (NH4NO3)
Para preparar 500 mL da solução.
Solução de (NH4NO3) na concentração de 50x
Cálculo do estoque 1
82,5, g(NH4NO3) ------- 1000 mL
x g(NH4NO3)--------500 mL
x= 41,25 g
Diluição 41,25 g de (NH4NO3) feita em quantidade menos em seguida completar tudo de menisco para 500 mL e vedados para facilitar a dissolução, que é feito no agitador com a barra magnética. 
Preparo de solução estoque 2 - Nitrato de potássio (KNO3)
Prepara 500 mL da solução.
Solução de (KNO3) na concentração de 50x
Cálculo do estoque 2
 95 (g) (KNO3) ----- 1000 mL
 Y(g) --------------- 500 ml
 y= 47,5 g de (KNO3)
 O mesmo processo de dissolução do cálculo 1 para o cálculo 2. 
Cálculo do estoque 3 de Cloreto de Cálcio (CaCl22H2O)
Prepara 500 mL da solução.
Solução de (CaCl22H2O) na concentração de 50x
22 (g) ((CaCl22H2O)) ----- 1000 mL
 Y(g) --------------- 500 ml
 y= 11 g de (CaCl22H2O)
 
O mesmo processo de dissolução do cálculo 1 e 2 para o cálculo 3.
Cálculo do solução estoque 7 
Para preparar 500 mL da solução de (FeSO47H2O) + EDTA (agente quelante)
Sulfato Ferroso (FeSO47H2O) na concentração (100x)
2,78 (g)(FeSO47H2O) ----- 1000 mL 
 y (g)(FeSO47H2O) -------- 500 ml
 y= 1,39 g de (FeSO47H2O) 
3,73 (g) (EDTA) ----- 1000 mL
 Y(g) (EDTA) ------ 500 ml
 y= 1,865 g de EDTA
- Dissolver 1,39 g de sulfato de ferro (FeSO47H2O) em 400ml de água quente aproximadamente a 70 °C e completar para 500 mL;
- Dissolver 1,865 g de EDTA em 400ml de água quente;
- Misturar as duas soluções quentes, vertendo-se a solução de EDTA sobre a solução de FeSO47H2O;
- Armazenar em vidro escuro e coberto com papel alumínio, colocando-o em geladeira.
Antes do preparo das soluções-estoque é necessário pesar os reagentes em balança analítica e colocar em água destilada no balão volumétrico para que esteja bem dissolvido. O volume estará aferido se o menisco se encontrar na marca do balão volumétrico. E cuidados com as quantidades de nutrientes que desejar fazer devido alta concentrações por isso a necessidadede identificação dos frascos. Outro cuidado é sobre elementos que necessitam de solventes recomendados. 
MATERIAL REALIZADO
Tabela 1. Solução estoque do meio MS (Murashige; Skoog, 1962 )
	Componentes
	Meio MS
	
	Conc. Estoque
	p/ 1000 mL
	Estoque
	Macronutrientes
	NH4NO3
	50 X
	82,5 g
	Macro MS
	KNO3
	50 X
	95 g
	Macro MS
	CaCl22H2O
	50 X
	22 g
	Macro MS
	Micronutrientes
	FeSO47H2O
	100 X
	2,78 g
	Fe-EDTA
	EDTA
	100 X
	3,73 g
	Fe-EDTA
 
- Proveta de 1000 mL e Balão Volumétrico;
- Balança Analítica de precisão;
- 500 mL de água destilada para cada solução;
- Frasco Ambar
- Agitador
Bibliografia citada 
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with
tabacco tissue culture. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, p. 473-497,1962.
Data: 25 de Novembro de 2014
PREPARO DE MEIO DE CULTURA
INTRODUÇÃO
O preparo do meio de cultura é das etapas que necessitam de tempo, portanto, o estoque de soluções armazenado é viável com finalidade de otimizar a rotina no laboratório. Tendo as soluções que precisam o preparo se torna rápido. No caso de uso de experimento mais específico tem o meio pronto de acordo com fabricante.
Todas as soluções para o preparo do meio de cultura devem ser preparadas com agua destilada. 
Características Básicas dos Meios de Cultura: Fonte de Carbono e Nitrogênio; fonte de Energia; sais minerais; fatores de crescimento (fitorreguladores); condições físicas e esterilizado. Deve sempre, atender à exigência da cultura, o que você deseja trabalhar.
DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES 
Foram realizados dos meios de cultura de 1000 mL, o meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), e 1000 mL meio WPM é muito indicado para espécies lenhosas que não obtiveram bons resultados com meio MS.
O meio MS foi preparado a partir da solução estoque, adicionado com sacarose 30 g L-1, pH foi ajustado 5,8 em seguida o agente geleificante Phytagel e regulador de crescimento BAP (6-benzilaminopurina). 
O segundo meio de cultura foi o meio WPM – Menor quantidade de Nitrogênio, desenvolvido para plantas lenhosas. O preparo do meio WPM foi com o meio pronto com 2,3 g L-1. Adicionado 30 g, pH ajustado para 5,8 em seguida o agente geleificante Phytagel.
A sacarose, Phytagel e Meio pronto dos meios de cultura passaram pelo agitador para melhor homogeneidade do meio, e em seguida, levado aos micro-ondas.
MATERIAIS REALIZADOS	
Meio MS (para fazer 1000 mL de meio de cultura)
Soluções-estoque: 20 mL (50x) e 10 mL (100x)
Sacarose (açúcar comercial) = 30 g
Phytagel = 2 g
Fitorregulador: BAP (6-benzilaminopurina) com 4 mg
Meio WPM (para fazer 1000 ml de meio de cultura)
Meio pronto (pó solúvel) = 2,3 g 
Sacarose (açúcar comercial) = 30 g
Phytagel = 2 g
Equipamentos:
- pHmetro: 5,8 
- Tudo de ensaio deensaio 20x150 MM 
- Balança analítica e de precisão
- Agitador 
- Micro-ondas
 
 
Data 02 de Dezembro de 2014
	
ESTABELECIMENTO IN VITRO DE ÁPICES CAULINARES DE BANANEIRA
INTRODUÇÃO
A utilização de técnicas de cultura de tecidos, a partir de ápices caulinares, é realidade em muitos países. Relatam que as primeiras pesquisas em multiplicação com o gênero Musa datam da década de 60, intensificando trabalhos visando o uso de técnicas mais simples produtivas.
A Sigatoka-negra tem se expandindo muito e ameaçando a bananicultura mundial. Neste contexto, faz a importância de validar novas formas de melhoramento de bananeira. Apesar de inúmeras pesquisas, para cada genótipo implica em comportamento diferenciado, o que implica em modificações e adaptações dos protocolos.
O que se espera-se definir da técnica de cultura de tecidos é que seja um sistema eficiente e prático para obtenção de mudas de alta qualidade.
DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES 
 
Mudas de bananeira assim que foram cortadas no laboratório de fitotecnia e enviados para o Laboratório de Propagação e Conservação in vitro da Universidade Federal do Acre. Foi feita uma pré-limpeza dos rizomas com lavagem em água corrente e imersão na solução de fungicida CERCOBINTM (50g 20 L-1), sendo posteriormente reduzidos por quatro vezes até o tamanho aproximado de 2 cm2. As reduções serão realizadas mediante cortes transversais e longitudinais do rizoma e pseudocaule. A cada redução o material vegetal será tratado com solução de hipoclorito de sódio (2-2,5% de cloro ativo) por 20 minutos.
Em fluxo laminar horizontal o material vegetal procedente de cada tipo de muda será imerso em álcool 70% (v/v) por 3 minutos, seguido de imersão em hipoclorito de sódio (1-1,25% de cloro ativo, adicionado de 1 gota de Tween 80 para cada 100 mL de solução) durante 20 minutos e então submetido a três lavagens em água destilada e autoclavada e os explantes inoculados em meio de cultivo. Os explantes foram inoculados em frasco de 600 mL com 40 mL de meio MS (MURASHIGE; SKOOG 1962), suplementado com 30 g L-1 de sacarose, 4 mg L-1 de BAP (6-benzilamino purina), e solidificado com Phytagel a 2 g L-1. Os frascos foram mantidos por uma semana em sala de crescimento sob fotoperíodo de 16 h, com intensidade de luz de 25 μmol.s-1.cm-2 e temperatura de 25 ± 3 ºC. Após esse período, foram eliminados todos os explantes devidos a contaminação por bactérias.
 MATERIAIS UTILIZADOS
	ESPECIFICAÇÃO
	
QUANTIDADE
	Sacarose
	
30 g L-1
	PhytagelTM
	
4 mg L-1
	6-Benzilaminopurina (BAP)
	
2 g L-1
	Pó para preparo do meio MS (10 L)
	
2,3 g L-1
	Álcool etílico 92,8º INPM
	
1 L
	Hipoclorito de sódio (2-2,5% cloro ativo)
	
500 mL
	Hipoclorito de sódio (1-1,5% cloro ativo
	
50 mL
	
Balança analítica com sistema Unibloc
	-
	
Sistema de Osmose reversa 10 L h-1
	-
	
Fluxo Laminar
	
1
	Tween 80
	
1 gota 100 mL
	Micropipeta monocanal de 10.000 µL
	
1
	Fracos 
	600 mL
	Cercobin
	50 g 20 L-1
	Bisturis e pincas
	
2/2
Data 02 de Dezembro de 2014
MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE ÁPICES CAULINARES DE BANANEIRA
INTRODUÇÃO
O método de multiplicação de mudas da bananeira é realizado em condições controladas de laboratório, proporciona alta eficiência de brotos e calor morfogeneticos, apresentando rendimento de 150 a 300 mudas por matriz, num período de 6 a 8 meses. Entre as vantagens da micropropagação: (i) Produção em grande escala em qualquer época do ano; (II) mudas produzidas rapidamente em espaço físico reduzido; (III) apresentam alta qualidade fitossanitária; (IV) Facilidade no transporte, e (V) proporcionam uniformidade no tamanho das mudas e nos tratos culturais e colheita no primeiro ciclo da cultura.
DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES 
Após toda assepsia e o explante é colocado em meio de corte. Após 28 a 30 dias, se faz o segundo subcultivo, através de cortes longitudinais tanto no rizoma e e próxima a apical. O continuo da atividade do cultivo dos explantes vai por 6 a 8 semanas, dependendo da finalidade, nestes períodos, ocorre a indução de brotações, sendo estas individualizadas, para obtenção de mais propágulos vegetativos. Lembrando que o material pode apresentar tecidos externos oxidados, deve ser feitos retiradas para que o explante desenvolva, a partir destes de subcultivos serão transferidas para outros frascos com 40 mL de meio, contendo MS + 30 g L-1 de sacarose + BAP a 4,0 mg L-1 e solidificado com Phytagel a 2 g L-1, tampados com tampa plástica e vedados com filme de PVC. O pH foi ajustado para 5,8 previamente à autoclavagem a 121 ºC e sob pressão de 1 atm por 20 minutos colocados em decansp para então transferir o material vegetativo em fluxo laminar. 
 MATERIAIS UTILIZADOS
	ESPECIFICAÇÃO 
	Quantidade
	
Fluxo Laminar
	
1
	Tween 80
	
1 gota 100 mL
	Micropipeta monocanal de 10.000 µL
	
1
	Fracos 
	600 mL
	Cercobin
	50 g 20 L-1
	Bisturis e pincas
	
2/2
Data 02 de Dezembro de 2014
ESTABELECIMENTO IN VITRO DE GEMAS AXILARES ABACAXIE SEGMENTO DE RAMOS BATATA-DOCE.
DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES 
 
Abacaxi 
	A multiplicação foi feita a partir de brotações de gemas axilares em fluxo laminar e transferência em meio MS com 30 g L -1, adicionado com agente geleificante e ausência de citocinina sintética. Pois a cultura do abacaxizeiro tem facilidade em propagar muito rápido, para que não ocorra faz necessário ausência de reguladores de crescimento ou inibidores de crescimento. 
 Batata-doce
 	Foram feitos cortes dos ramos, lavados com detergente, colocados posteriormente em um recipiente com gaze. Enquanto isso, realiza a limpeza do fluxo com aparelho ligado em seguida, ligam as lâmpadas de UV, para que ocorra esterilização do fluxo. Realizar a tríplice flambagem de pinças e bisturis, para que recepção do material vegetativo. Os segmentos de ramos que estão em um Becker são imergidos em hipoclorito a 0,5% de cloro obtido pelo cálculo de volume e concetração que foi feito para 500 mL, e adicionado Twenn (2 gotas por 200 mL) com o tempo de 20 minutos dentro do fluxo: 
Ci x Vi = Cf x Vf
Ci: Concentração inicial (2,25% - Hipoclorito comercial);
Vi: Volume inicial;
Cf: Concentração final (Que se deseja obter. Neste caso a concentração é 0,5%);
Vf: Volume final (Que se deseja obter. Neste caso a concentração é 500 mL)
Ci x Vi = Cf x Vf => 2,25% x Vi(mL) = 0,5% x 500(mL) => 250/2,25 = 111,11 mL
Com base no valor do hipoclorito foram colocados em proveta valor absoluto 100 mL e seguida foi colocado 11,11 com a micropipeta monocanal de 10.000 µL. 
Se passando 20 minutos o frasco fazer a retirada e colocados em agua destilada e autoclavada para tríplice lavagem.
 MATERIAIS UTILIZADOS
	ESPECIFICAÇÃO 
	
QUANTIDADE
	Álcool etílico 70 ºC INPM
	
1 L
	Frasco com Meio MS para transferência 
	-
	Hipoclorito de sódio (0,5%) cloro ativo
	
50 mL
	
Fluxo Laminar
	
1
	Tween 80
	
1 gota 100 mL
	Micropipeta monocanal de 10.000 µL
	
1
	Fracos 
	
600 mL
	Becker 
	250 mL
	Bisturis e pincas
	
2/2
Data 20 de Janeiro de 2014
CULTURA DE EMBRIÕES ZIGÓTICOS 
INTRODUÇÃO
 
As principais aplicações estão na coleta, intercambio e conservação de germoplasma. O cultivo de embriões zigoticos tem propósito no auxilio no programa de Melhoramento Genético de Plantas. Através do resgaste de sementes que representam algum tipo de dormência causada pelo tegumento espessa, ou dormência fisiológica.
A obtenção do resgaste se dá a quebra de dormência e ocorrência de germinação do embrião que vai dar origem a plântula. Para que seja mantida in vitro ou para parte de aclimatização.
O embrião quando colocado em meio de cultura deve passar por desdiferenciação celular, estas células voltam a ser celular indiferenciadas, que pode ser um embrião zigótico, somático ou segmento de calo, ou folha. 
Assim a cultura de embriões zigóticos é de grande importância que possibilita o resgate de embriões híbridos, oriundos de cruzamentos interespecíficos que tem sido feito pesquisa com Coco, café e açaí em outras.
DESCRIÇÃO DA ATIVIDADE DA PALMEIRA MURMURU E MATERIAIS UTILIZADOS
Nos últimos anos, a busca por alimentos naturais a partir de produtos florestais não-madeireiros da Região Amazônica tem sido revalorizada e sua utilização incrementada em virtude da valorização de uma vida de hábitos mais saudáveis
Dentre as espécies fornecedoras destes produtos, tem se a palmeira murmuru (Astrocaryum spp.) de potencial econômico e uso na indústria de cosméticos. O murmuru pode ser encontrado por toda Região Amazônica. No entanto, há poucas informações sobre a botânica, ecologia, biologia reprodutiva e agronômico devido se tratar ainda de uma espécie silvestre. O que se sabe, é que esta palmeira tem importância econômica. 
Para obtenção de embriões foram feitas coletas frutos de uma arvore de murmuru nas proximidades do bloco de Engenharia da Universidade Federal do Acre, no dia 13 de janeiro. Em seguida os frutos foram lavados e despolpados restando apenas tegumento espesso e colocados em estufa de secagem com circulação forçada de ar, 6 dias depois as sementes foram retiradas e levadas ao laboratório de conservação e propagação in vitro para quebra do tegumento espesso com mesa alicate, deixando apenas a parte do endosperma sólido. Para o tratamento de desinfecção do murmuru dentro do fluxo laminar:
Álcool 70% por 3 minutos para diminuir a tensão superficial
Hipoclorito de sódio na concentração 1,25% cloro ativo por 20 minutos
Triplice lavagem
Em seguida, faz corte longitudinal no endorperma sólido para retirada no embrião zigotico e transferir em tubos de ensaios com meio MS.