Relatório aula prática - Semeadura fúngica, coloração azul algodão e Gram

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UNIVERSIDADE SANTO AMARO – UNISA 
Curso: Ciências Biológicas 
 
 
 
BRUNO FRÕES BERMUDES 
 
 
 
SEMEADURA FÚNGICA 
COLORAÇÃO DE AZUL ALGODÃO E GRAM 
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS – BIOLOGIA DOS 
MICROORGANISMOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
São Paulo 
2018 
 
 
UNIVERSIDADE SANTO AMARO – UNISA 
Curso: Ciências Biológicas 
 
 
BRUNO FRÕES BERMUDES 
 
 
 
SEMEADURA FÚNGICA 
COLORAÇÃO DE AZUL ALGODÃO E GRAM 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – BIOLOGIA DOS 
MICROORGANISMOS 
 
Relatório de aula prática – Semeadura Fúngica 
e Coloração de Azul Algodão e Gram - 
Ciências Biológicas da Universidade Santo 
Amaro, da disciplina Biologia dos 
Microorganismos, sob a orientação do Prof. 
Felipe Scassi Salvador. 
 
 
 
 
São Paulo 
2018 
 
 
SUMÁRIO 
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 4 
2. SEMEADURA FÚNGICA .................................................................................. 5 
2.1. OBJETIVOS ................................................................................................... 5 
2.2. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 5 
2.3. RESULTADOS E DISCUSÃO ........................................................................ 6 
2.4. CONCLUSÃO ................................................................................................. 8 
 
3. COLORAÇÃO DE AZUL ALGODÃO E GRAM ................................................ 9 
3.1. OBJETIVOS ................................................................................................... 9 
3.2. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 9 
3.3. RESULTADOS E DISCUSÃO ...................................................................... 11 
3.4. CONCLUSÃO ............................................................................................... 13 
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS................................................................ 14 
 
 
 
 
4 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
Os fungos podem ser classificados como seres microscópicos ou 
macroscópicos, pluricelulares ou unicelulares, eucariontes e heterotróficos e fazem 
parte do Reino Fungi,1 no qual, é formado pelos fungos mais conhecidos como mofos, 
bolores e cogumelos. Por ser seres heterotróficos, eles não produzem seu própria 
alimento, precisando obter energia de outros lugares, desta forma, eles podem se 
associar com outros seres, como por exemplo algas e raízes de plantas formando 
respectivamente os líquens e as micorrizas. Estes fazem respiração aeróbica 
utilizando o O2 na troca gasosa. Porém existem alguns tipos que são capazes de 
respirar mesmo na ausência do oxigênio por respiração anaeróbica, ou através da 
fermentação, como no caso das leveduras que utilizam o açúcar para obtenção de 
energia. Sua reprodução pode ser de forma sexuada ou assexuada, sendo, que a 
sexuada só ocorre em fungos pluricelulares, no qual ocorre a troca do material 
genético através da fusão de hifas. A assexuada pode ocorrer tanto em fungos 
pluricelulares como unicelulares.2 
A coloração com Lactofenol, também conhecida como azul de algodão, é um 
método de coloração utilizado para preparar exames microscópicos de colônias de 
fungos. Está técnica tem a finalidade de visualizar o micélio vegetativo e reprodutor 
de um fungo filamentoso, e também as características da célula vegetativa e a 
reprodução por brotamento de leveduras.3 
A coloração de Gram é utilizada na microbiologia para identificar alguns 
grupos de bactérias. Está técnica foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista 
Holandês Hans Christian Gram, que observou que as bactérias ficavam com cores 
diferentes, ao serem tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificar as 
bactérias em dois grupos distintos: As Gram-positivas que ficavam roxas, e as Gram-
negativas que ficavam vermelhas.4,5 
 
 
 
 
5 
 
2. SEMEADURA FÚNGICA 
 
2.1. OBJETIVOS 
Executar a semeadura dos fungos em meio sólido e observar seu 
desenvolvimento. 
 
2.2. MATERIAIS E MÉTODOS 
- Placas de Petri com BHI (Brain Heart Infusion); 
- Alça de Níquel-Cromo; 
- Solução Salina; 
- Bico de Bunsen; 
- Cultura de fungos Aspergillus niger e Rhodotorula. 
 
O experimento foi conduzido no laboratório de microbiologia da Universidade 
Santo Amaro – Unisa. Antes de iniciar a semeadura dos fungos foi necessário a 
preparação da zona de segurança do Bico de Bunsen, essa zona corresponde a uma 
região de aproximadamente 10 cm de raio em torno do bico de Bunsen, pois o ar 
aquecido tende a formar uma corrente no sentido de baixo para cima, evitando que os 
microrganismos que estejam em suspensão no ar contaminem a área. As 
manipulações foram feitas por trás da chama do bico de Bunsen. Logo em seguida a 
alça de Níquel-cromo foi esterilizada na chama do bico de Bunsen em posição vertical 
até o ponto de incandescência (até ficarem rubras), movendo-se rapidamente o 
suporte da alça para dentro da chama (Figura 1), dessa forma alguns centímetros do 
suporte também foram flambados ligeiramente, e depois resfriado na solução salina. 
 
6 
 
Figura 1 - Fonte: https://goo.gl/1PweLq 
 
Em uma das placas de Petri foi semeado com o auxílio da alça de Níquel os 
fungos Aspergillus niger, e em outra placa de Petri dividida em duas partes, foi 
semeado os fungos Rhodotorula na forma de agulhamento e estria. Logo após, o 
material foi levado para estufa onde foi mantido em período de incubação em 
temperatura de 37ºC por 7 dias. 
 
 
2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
Após o período de 7 dias de incubação, foi verificado a taxa de crescimento dos 
fungos nas placas de Petri e foi observado os seguintes resultados: 
Os fungos Aspergillus niger obtiveram o crescimento esperado (FIGURA 2). 
Este resultado ocorreu devido vários fatores, um deles que podemos citar é a questão 
da temperatura. Está temperatura de crescimento dos fungos abrange uma larga 
faixa, porém, os fungos de importância médica (patogênicos), em geral, são mosófilos 
apresentando uma temperatura ótima próxima dos 37ºC, ou seja, a temperatura 
próxima do corpo humano. Outro fator importante é a presença do oxigênio, por se 
 
7 
 
tratar de microrganismos aeróbicos, eles necessitam desse gás para sua obtenção de 
energia e se desenvolver.6 
 
 
Figura 2: Crescimento dos fungos Aspergillus niger após o período de incubação. 
 
Ao contrário dos Aspergillus, a semeadura de Rhodotorula não obteve os 
resultados esperados (FIGURA 3). Isso pode ter ocorrido devido a um erro na 
configuração da temperatura da estufa no qual o fungo foi mantido. Como dito 
anteriormente, os fungos de importância médica por serem mesófilos, precisam ser 
mantido em temperaturas próximas do corpo humano para se desenvolvimento, ou 
seja, próximo dos 37ºC, e a estufa foi mantida em 25ºC. Apesar de ter um pequeno 
desenvolvimento como mostrado na imagem, os resultados não foram satisfatórios. 
 
8 
 
 
Figura 3: Crescimento dos fungos Rhodotorula após o período de incubação. 
 
2.4. CONCLUSÃO 
Nesta aula prática foi possível colocar em prática as técnicas de semeadura de 
fungos, e os cuidados técnicos necessários antes dos procedimentos. Também foi 
possível acompanhar o desenvolvimento das culturas dos dois tipos de fungos 
utilizados, observando a importância dos requisitos ambientais para que ele possa 
obter energia e nutrientes necessários para seu crescimento. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
3.COLORAÇÃO DE AZUL ALGODÃO E GRAM 
 
3.1. OBJETIVOS 
Visualização dos fungos em microscópio após as técnicas de coloração de azul 
algodão e Gram. 
 
3.2. MATERIAIS E MÉTODOS 
- Lâminas contendo cultura de fungos Aspergillus niger e Rhodotorula; 
- Violeta de genciana; 
- Lugol; 
- Álcool-acetona; 
- Fucsina; 
- Água destilada (remoção dos reagentes); 
- Lactofenol: 
- Microscópio; 
- Bico de Bunsen; 
- Alça de Níquel-cromo; 
- Óleo de imersão. 
O experimento foi conduzido no laboratório de microbiologia da Universidade 
Santo Amaro – Unisa. Antes de iniciar o preparo das lâminas com os fungos foi 
necessário a preparação da zona de segurança do Bico de Bunsen, essa zona 
corresponde a uma região de aproximadamente 10 cm de raio em torno do bico de 
Bunsen, pois o ar aquecido tende a formar uma corrente no sentido de baixo para 
cima, evitando que os microrganismos que estejam em suspensão no ar contaminem 
a área. As manipulações foram feitas por trás da chama do bico de Bunsen. Logo em 
 
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seguida a alça de Níquel-cromo foi esterilizada na chama do bico de Bunsen em 
posição vertical até o ponto de incandescência (até ficarem rubras), movendo-se 
rapidamente o suporte da alça para dentro da chama, dessa forma alguns centímetros 
do suporte também foram flambados ligeiramente, e depois resfriado na solução 
salina. 
Após a esterilização uma pequena quantidade de cada cultura de fungos foi 
colocado em lâminas e feito um esfregaço ligeiramente para não ficarem muito 
aglomeradas e secados próximo ao bico de Bunsen para uma melhor fixação. Em 
seguida foram seguidos os seguintes procedimento para a coloração de Gram: 
1. O esfregaço foi coberto com o Violeta de genciana por aproximadamente 1 minuto; 
2. O corante foi escorrido e lavado com um filete de água destilada; 
3. A lâmina foi coberta por Lugol e deixado agir por aproximadamente 30 segundos; 
4. O lugol foi escorrido e lavado com um filete de água destilada; 
5. Foi adicionado Álcool-acetona sobre a lâmina para a remoção do corante; 
6. A lâmina foi lavada novamente com água destilada; 
7. A lâmina foi coberta por Fucsina e deixada agir por aproximadamente 30 segundos; 
8. A lâmina foi lavada com água destilada e deixada secar ao ar livre. 
 Figura 4 – Procedimento de coloração de Gram. 
 
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Para a técnica de coloração de azul algodão, os seguintes procedimentos 
foram seguidos: 
1- Colocar uma gota de Lactofenol azul-algodão sobre a lâmina; 
2- Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma alíquota da cultura de 
levedura, utilizando a alça de níquel cromo; 
3- Colocar o fragmento da cultura ou a alíquota de levedura sobre a gota de 
lactofenol e homogeneizar; 
4- Cobrir com lamínula e examinar ao microscópio. 
Após os procedimentos de coloração, foram efetuadas as leituras das lâminas 
no microscópio em objetiva (10,40 e 100x). 
 
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Após leitura das lâminas no microscópio, os seguintes resultados foram 
observados: 
Os fungos Aspergillus niger apresentaram forma esférica e filamentosos 
formando um conjunto de hifas, e coloração roxa indicando que é um fungo Gram-
positiva (Figura 5). Isso se dá devido a parede celular possuir muita Mureina, fazendo 
com que o corante inicial (Violeta de genciana) se incorpore na estrutura da parede 
celular. Após a coloração com o lactofenol através da técnica de azul algodão, foi 
possível observar no microscópio os conidióforos (FIGURA 6), e também seus 
conídios (esporos). 
 
12 
 
 
Figura 5: Aspergillus niger Gram positivas. Fonte: https://goo.gl/sBCoUB 
 
 
Figura 6: Aspergillus niger estruturas após coloração de azul-algodão. Fonte: 
https://goo.gl/KFZbjx 
 
Os fungos Rhodotorula que é um tipo de levedura, apresentaram células 
unicelulares, e coloração roxa indicando que é um fungo Gram-positiva (Figura 7). Da 
mesma forma que o anterior, Isso se dá devido a parede celular possuir muita Mureina, 
 
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fazendo com que o corante inicial (Violeta de genciana) se incorpore na estrutura da 
parede celular. 
 
 
Figura 7: Rhodotorula Gram positivas. Fonte: https://goo.gl/htpdSP 
 
 
3.4. CONCLUSÃO 
 
Com a técnica de coloração de Azul-algodão foi possível observar a morfologia 
dos fungos e suas principais estruturas, e com a coloração de Gram foi possível 
identificar grupos específicos de fungos através de sua estrutura, e assim sabendo 
diferencia-las em Gram-positivas e gram-negativas, além de capacitação necessária 
para execução correta dos procedimentos em laboratório. 
 
 
 
 
 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
1. Fungos - Toda Matéria [Internet]. [cited 2018 May 4]. Available from: 
https://www.todamateria.com.br/fungos/ 
2. GABALDO K. Reino Fungi - Fungos - Biologia - InfoEscola [Internet]. [cited 
2018 May 4]. Available from: https://www.infoescola.com/biologia/reino-fungi/ 
3. Aulas Práticas : BIOPEDAGOGIA - Coloração com Lactofenol Azul de algodão 
[Internet]. [cited 2018 May 4]. Available from: 
https://biopedagogia.webnode.com.br/microbiologia/aulas-praticas/ 
4. CAXIAS M. Coloração de Gram - IBAP Cursos [Internet]. [cited 2018 May 4]. 
Available from: https://ibapcursos.com.br/coloracao-de-gram/ 
5. Coloração de Gram - Biomedicina Brasil [Internet]. [cited 2018 May 4]. 
Available from: http://www.biomedicinabrasil.com/2011/06/coloracao-de-
gram.html 
6. BELLINASO F. Metabolismo dos Fungos [Internet]. [cited 2018 May 4]. 
Available from: http://reinofungi1.blogspot.com.br/2012/06/metabolismo-dos-
fungos.html